JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu kağıt akış sitometresi-tabanlı bir tahlil kimyasal inhibitörleri ekran kitaplıklarına inhibitörleri ve T hücre reseptör sinyal etkileyen hedefleri tanımlaması için kullanır. Yöntem tanımlamak burada da yüksek üretilen iş gösterimleri için genişletilebilir.

Özet

Sinyal iletimi arabulucu çok sayıda yol oluşur T-hücre reseptör (TCR) TCR harekete geçirmek sinyalleri. Farklı stratejileri önerdi ve yeni arabulucu TCR sinyal, ve T-hücre süreçlerini harekete geçirmek ve timik seçimi de dahil olmak üzere, anlayış geliştirmek tanımlanması için uygulanan. Biz timositleri geliştirme harekete geçirmek üstünde dayalı TCR sinyal etkisi molekülleri tanımlaması sağlar bir tarama yöntemi açıklanmaktadır. Güçlü TCR sinyalleri apoptotik makine negatif seçimi olarak bilinen bir işlem içinde etkinleştirmek gelişmekte olan timositleri neden. Kinaz inhibitörleri uygulanması yoluyla, bu TCR sinyal etkiler hedefleri ile negatif seçim sürecinin geçersiz kılmak edebiliyoruz. Bu yazıda ayrıntılı Yöntem TCR sinyal yolları içinde kurulan rollerle kurallı kinaz inhibitörleri ve TCR sinyal yolları henüz kurulacak yeni kinaz inhibitörleri tanımlamak için kullanılabilir. Burada tarama strateji TCR sinyal içinde roman druggable hedefleri tanımlanması için daha yüksek aktarıma filtrelerine uygulanabilir.

Giriş

Edinilmiş bağışıklığın tamirhanede bir rol oynamak lenfositler soyundan T hücrelerdir. Her hangi bir antijen sunma yüzeylerde bulunan sağlayan onları onların ligandlar, MHC kompleksi molekülünün (MHC) oluşan komplekslerin tanımak ile ilişkili peptid TCR ifade hücreleri (ZPT). Yolu TCR/MHC etkileşimi aracılığıyla sinyal TCR tetikleme T Hücre aktivasyonu ve geliştirme1için çok önemlidir.

T-hücre gelişiminde nerede farklılaşma geçmesi ve T hücreli lineage ilerleme2aşamalarında git timus, kemik iliği türevi hematopoetik kök hücre (HSCs) göç. Çift-pozitif (DP) timositleri, CD4 ve CD8 coreceptors, ifade öz-peptit/MHC ZPT Tarih ile meşgul. Timositleri ile kendi öz-peptit/MHC ligandlar ılımlı bir benzeşim tek pozitif (SP) CD4 veya CD8 timositleri, pozitif seçimi olarak adlandırılan bir süreç haline olgun. Diğer taraftan, aşırı TCR stimülasyon öz-peptit/MHCs aracılığıyla almak timositleri apoptosis yolu ile negatif seçim3,4tabi. Stimülasyon kaynaklı, caspase bağımlı apoptosis bu işlemi taklit vitro anti-CD3/28 antikor kaplı boncuk5ile örneğin timositleri uyararak olabilir. Seçim süreci geçmek olgun T hücreleri tarafından sigara-öz-peptit/MHC ligandlar ZPT çevre üzerinden aktif hale gelir. Öz-peptit/MHCs hala hayatta kalma ve homeostatik yayılması, yardımcı T hücreleri farklılaşma ve sigara-öz-peptit/MHCs T hücreli yanıt geliştirme için sinyal tonik bağlamında Periferik T hücre ilgilidir coagonism6,7,8,9. Yüksek-benzeşme TCR bağlama peptit/MHC ligand için ağ10sinyal bir karmaşık TCR oluşturan birçok sinyal molekülleri içeren birkaç aşağı akım sinyal yollar etkinleştirir. TCR sinyal yollar birkaç on yıl için inceledik ve henüz yolun yeni arabulucu keşfi11,12azalmaya hiçbir iz gösterir. TCR sinyal yolları modülasyon klinik ilgisi vardır ve T hücreli yanıt için immunotherapeutic uygulamaları ya da T-hücre yanıt otoimmünite13kontrolünü için inhibisyonu potentiating içerebilir. T-hücre yanıt modülasyon için stratejiler esas olarak faaliyet14,15,16kinaz veya fosfataz bozulma bağlıdır.

Akış Sitometresi-tabanlı bir tahlil küçük kimyasal bileşikler ile taranması için bir uygulama yeteneklerini TCR sinyal ve T-hücre harekete geçirmek17modüle için açıklar. Tahlil için güçlü TCR sinyaller maruz kaldığında apoptosis yolu aktive timositleri olgusu bağlı. Tahlil stimülasyon gücü değişiklikleri tanımlamak için yeterince duyarlıdır; transgenik TCR benzeşme artan peptit/MHC tetramers ile ifade timositleri kuluçka caspase harekete geçirmek-apoptotik yanıt5bir ölçüsü olarak kullanılan karşılık gelen bir artış sonuçlandı. Belgili tanımlık perde için kinaz inhibitörleri içeren bir kitaplık kullanılan ve güçlü TCR sinyalleri thymocyte cevaben modüle yeteneğini değerlendirildi.

Çeşitli akış sitometresi-tabanlı veya floresan muhabir dayalı stratejiler bir ürün yelpazesine periferik harekete geçirmek fenotipleri çeşitli T-hücre alt kümeleri içinde yüksek-den geçerek taranması için tarif edilmistir. Bu tür stratejiler içerir bir okuma sitotoksik T hücre etkinlik19,20ve analizi olarak degranulation kullanımı, genetik floresan gazeteciler zamanlama ve T-hücre harekete geçirmek18büyüklüğü değerlendirmek için kullanımı fosforilasyon çeşitli proteinlerin hücresel21sinyal dahil.

Burada sunulan tarama tahlil başarıyla yolu yanı sıra potansiyel, yeni bileşikler TCR sinyal üzerinde inhibitör etkisi ile sinyal TCR kanonik molekülleri inhibe bileşikler tanımlamak yapabiliyor. Örneğin, GSK3β ve Hsp90 inhibitörleri T hücreli yanıt-e doğru17etkileyen yeni bileşikler tespit edilmiştir. Tahlil apoptotik yanıttan TCR bağımsız inhibitörlerinin etkileri hücresel toksisite bir azalma nedeniyle sinyal iletimi müdahale inhibitörleri ayırt edebilmektedir. Apoptozis indüksiyon ek olarak, ayrıca CD69 upregulation ve TCR downregülasyon harekete geçirmek imleyicileri ölçüyoruz. Ağlar karmaşıktır sinyal TCR birden çok güzel kullanımı molekülleri ile tek bir yol üzerinde belirli etkileri keşfetme şansını artırabilir. Burada, aynı zamanda akış sitometrik çözümlemesi için hazırlık hücrelerde boyama sırasında Santrifüjü bağımsız Protokolü kullanmaya özgün iletişim kuralını yüksek üretilen iş alternatif olarak tanıtmak. Bu raporda açıklanan tahlil kinaz inhibitörleri içeren küçük bir bileşik kitaplık kullanır ama prensip olarak, bu daha yüksek üretilen iş tarama için kullanılabilir. Seçim Kütüphanesi Ayrıca inhibitörleri ya da diğer molekülleri çeşitli dahil.

Protokol

Bu çalışmada, 6 - için 8-hafta-yaşlı erkek ve dişi C57Bl/6 fareler kullanıldı. Fareler Singapur Ulusal Üniversitesi (Singapur) hayvan tesisinde yetiştirilen. Singapur Ulusal Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi (IACUC) tüm hayvan deney onayladı.

1. Thymocyte süspansiyon hazırlanması

  1. CO2 odası farelerde ötenazi.
  2. Sonraki adımları izleyerek bir doku kültürü hood herhangi bir hücre kültürleri kirlenmesini önlemek için. Fare leşi pins, kullanarak diseksiyon kuruluna güvenli ve fare % 70 etanol ile sprey.
  3. Makas kullanarak, çeneye doğru karın başlayarak ventral tarafta dikey kesi yapmak. Başka insizyon boyunca her şiir yapmak. Göğüs kafesi ve pin deri streç.
  4. Diyafram ve posterior ucundan göğüs kafesi her iki makas çifti ile kesti. Göğüs kafesi kaldırın ve maruz timus aşağı pin. Ayrı bağ dokusu timus için bağlı ve bir çift eğri forseps kullanarak timus ayıklayın.
  5. Timus 5 mL tam RPMI medya de içeren bir 6-şey plaka bir kuyunun içine yerleştirin.
    Not: Eğer uzun bir thymocyte canlılık geliştirmek için medyaya % 10 kömür elimden fetal Sığır serum (FBS) eklemeyi düşünün bekleme süresi diseksiyon ve stimülasyon tahlil arasında bekleniyor.
  6. Yavaşça künt sonuna bir şırınga kullanarak timus, püre ve hücreleri bir 70 µM hücre süzgeç aracılığıyla geçmek. Alternatif olarak, sağlıklı bir durumda timositleri toplamak için iki çift forseps timus sıkmak ve timositleri toplamak timik epitel dışarı bu akışı kullanmayı düşünebilirsiniz.
  7. Sayma, hücre için bir hemasitometre veya enstrüman sayma otomatik bir hücreye kullanarak devam edin.

2. titrasyon kinaz inhibitörleri toksik olmayan konsantrasyonları

Not: Bu bölümde kullanılmak üzere T-hücre harekete geçirmek perde inhibitörleri hazırlanması üzerinde duruluyor. İnhibitörleri yüksek konsantrasyonlarda kullanılan T-hücre harekete geçirmek ekranlarının bir okuma olduğunu hücre ölümüne neden olabilir. Apoptozis TCR uyarılması bağımsız ikna etmek değil bireysel inhibitörleri son konsantrasyonu belirlemek için inhibitörleri amaçlarından dilutions dizi. Bu çalışmada kullanılan kinaz inhibitörleri Kütüphanesi harici bir satıcıdan satın alınmıştır. İnhibitörleri listesi Tablo malzemelerbulunur.

  1. Düşük konsantrasyonlarda kinaz inhibitörleri plakaları hazırlanması
    1. İnhibitörleri 1 mm bir tabak hazırlamak için dimetil sülfoksit (DMSO) tüm inhibitörleri için 90 µL inhibitörleri 10 µL ekleyin.
      Not: Bu çalışmada kullanılan küçük molekül kitaplığından inhibitörleri 10 mM bir hisse senedi toplama gel. İnhibitörleri Pelet formda iseniz,'dan terdarikçilerin önerilen sulandırma adımları. İnhibitörleri 10 mM sağlanmamışsa, alternatif uygun konsantrasyonlarda inhibitörü tabak yerine ve uygun seyreltme faktörü inhibitörleri ayrı seri dilutions hazırlayın.
      Uyarı: toksik inhibitörleri durumlarda, güvenli taşıma ve bertaraf üreticinin yönergelerini izleyin.
    2. İnhibitörleri 0.1 mm bir tabak hazırlamak, 10 µL inhibitörleri, 1 mM inhibitörleri tabaktan DMSO 90 µL için ekleyin.
    3. İnhibitörleri 0,01 mm bir tabak hazırlamak, inhibitörleri 10 µL 0,1 mM inhibitörleri tabaktan DMSO 90 µL için ekleyin.
  2. Timositleri kinaz inhibitörleri ile tedavi
    1. Aynı derecede bölüm 1 thymocyte süspansiyon hazırlamak.
    2. 5 x 106 hücre/mL bir thymocyte askıya almak için tam RPMI içinde timositleri sulandırmak.
    3. Thymocyte süspansiyon, 200 µL bir çok kanallı pipet kullanarak bir 96-şey plaka bütün wells için ekleyin.
    4. Her şey için de 1 mM inhibitörleri (son inhibitörleri 10 µM bölgedir) içeren saçtan karşılık gelen gelen inhibitörleri 2 µL ekleyin.
    5. Aynı plaka, tedavi edilmemiş denetimleri dört kuyu, dört Kuyu yapımı 5 µM deksametazon tedavi olumlu denetimleri ve negatif denetimleri, araç tedavi dört kuyu DMSO 2 µL ekleyerek hazırlayın.
    6. Bir 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka için 17-20 h timositleri kuluçkaya (veya bir gece).
  3. Bireysel inhibitörleri uygun konsantrasyonlarda belirlenmesi
    1. Timositleri 300 x g de tabak spin ve 5 dakika süreyle 4 ° C Resuspend 250 µL FACS yıkama arabelleği hücrelerde.
    2. Bir akış sitometrik analiz örnekleri çalıştırmak ve sonuçları bir Akış Sitometresi Analizi programı ile analiz.
    3. Canlı hücreleri FSC-SSC çoğunluğuna göre yüzdesini belirleyin. Perdeleme strateji Şekil 1Badımında gösterilir.
    4. Ortalama canlı hücreleri % 100 normalleştirilmiş DMSO tedavi denetimleri temel alan yüzdesi hesaplamak. Rasgele bir pencere kabul edilebilir hücre ölümü (e.g.,20%) ayarlayın. Bu pencere (i.e., DMSO tedavi kontrollerin % 80'in altında) altındaki canlı hücreleri yüzdesi sonuçlandı inhibitörleri düşük konsantrasyonlarda tekrar test üzeresiniz.
    5. Canlılığı ölçüt adım 2.3.4 geçemedi inhibitörleri için tekrarlamak belgili tanımlık merdiven adımlardan 2.2.1 - 2.3.4, inhibitörleri tabak 0.1 mM adım 2.2.4 yerine 1 mM inhibitörleri içeren plaka için kullanır Burada kullanılan inhibitörleri son konsantrasyonu 1 µM olduğunu.
    6. Bu hala yüksek düzeyde hücre ölümü 1 µM, üretmek, inhibitörleri, 0,1 µM. test inhibitörleri için adımları 2.2.1 - 2.3.4, tekrar ama 0,01 mm adım 2.2.4 inhibitörleri tabak kullanın. Burada kullanılan inhibitörleri son konsantrasyonu 0,1 µM olduğunu.
  4. Kinaz inhibitörleri hisse senedi bir tabak hazırlanması
    1. 10 µM kullanılacak inhibitörleri için 10 mM inhibitörleri 10 µL DMSO 10 µL için ekleyin.
    2. 1 µM kullanılacak inhibitörleri için 10 mM inhibitörleri 1 µL DMSO 19 µL için ekleyin.
    3. 0,1 µM kullanılacak inhibitörleri için 10 mM inhibitörleri 1 µL DMSO (Şekil 1 c) 199 µL için ekleyin.
      Not: İnhibitörleri hazırlanan hisse senedi tabak thymocyte süspansiyonlar eklendiğinde amaçlanan son konsantrasyonu konsantrasyonu x 500'dür. İnhibitörleri hisse senedi tabak PCR şeritler veya 96-şey plakaları hazırlanabilir.
    4. Kinaz inhibitörleri hisse senedi tabak timositleri tarama için bir geleneksel Santrifüjü bağımlı sisteminin (Bölüm 3; bkz: Şekil 1A, Yöntem 1 ve 2) veya alternatif Santrifüjü bağımsız sistemi (Bölüm 4; bkz: uygulanabilir Şekil 1A, Yöntem 3'ü).

3. kinaz inhibitörü Kütüphane (geleneksel santrifüj tabanlı tahlil) Eleme

  1. Timositleri kinaz inhibitörleri ile tedavi
    1. Aynı derecede bölüm 1 thymocyte süspansiyon hazırlamak.
    2. 5 x 106 hücre/mL bir thymocyte askıya almak için tam RPMI içinde timositleri sulandırmak.
    3. Timositleri 200 µL bir çok kanallı pipet kullanarak bir 96-şey plaka her şey için ekleyin. Plaka buza koyun.
    4. 96-şey plaka inhibitörleri inhibitörü hisse senedi plaka karşılık gelen kuyulardan 0.5 µL 2.4 bölümünde hazırlanan ekleyin.
    5. Tedavi edilmemiş denetimleri sekiz kuyu hazırlayın. Denetimleri araç tedavi dört kuyu DMSO 0.5 µL ekleyerek hazırlayın. 5 µM deksametazon tedavi denetimleri (Şekil 2) dört kuyu hazırlayın.
  2. Anti-CD3/CD28 boncuk kullanarak timositleri uyarılması
    1. Boncuk 1 mL al ve boncuk 2 mL PBS ile yıkayın. Manyetik bir stand kullanarak boncuk ayrı ve çözüm Aspire edin. Boncuk 5 mL tam RPMI resuspend.
      Not: 1-2,5 boncuk hücrelere oranıdır. Boncuk uyarmak için kuyu sayısı ve timositleri kullanılan sayısına bağlı olarak almaya miktarını belirleyin.
    2. Boncuk 50 µL önleyici tedavi her örnek, dört DMSO tedavi örnekleri ve dört sekiz tedavi edilmezse örnekleri ekleyin. Tam RPMI 50 µL kalan dört tedavi edilmeyen kuyular için ekleyin. Şekil 2 plaka genel düzenini gösterir.
    3. Bir çok kanallı pipet kullanarak wells içeriğini karıştırmak.
    4. Bir 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka için 17-20 h timositleri kuluçkaya (veya bir gece).
  3. Yüzey antijenleri ile boyama
    1. Anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 ve anti-CD69 antikorlar içeren bir antikor boyama karışım hazırlayın. Antikorlar FACS yıkama arabelleği (% 0.5 Sığır serum albümin [BSA] ile desteklenmiş PBS) 1: 200 (v/v) oranında sulandırmak.
      Not: antikor titreleri, varyasyon farklı deneyler boyama içinde en aza indirmek ve sinyal-gürültü oranı artırmak için sabit antikor dilutions, kullanmak yerine boyama için kullanılan en iyi duruma getirme düşünün.
    2. 300 x g ve 5 min için 4 ° C plaka Döndür.
    3. Çözüm atmak için plaka fiske.
    4. Bu noktada, protokol geleneksel santrifüj bağımlı protokolü takip edebilirsiniz (3.3.5 adım geçin; Şekil 1A, Yöntem 1 bakın) veya alternatif Santrifüjü bağımsız Protokolü (4.4.4 adım geçin; Şekil 1A, yöntemi bakın 2).
    5. 3.3.1. adımda hazırlanan boyama antikor karışımı 75 µL hücrelerde resuspend.
    6. Bir çok kanallı pipet kullanarak örnekleri mix ve onları 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
  4. Hücreleri fiksasyonu
    1. Wells 200 µL FACS yıkama arabelleği ile yıkama ve 300 x g ve 5 min için 4 ° C plaka spin.
    2. Çözüm atmak için plaka fiske.
    3. Fiksasyon/permeabilization arabellek ekleyin (active caspase-3 apoptosis kit ile; geliyor 10 x perma/yıkama arabellek ile aynı adımda 3.5.1 ve anti-caspase-3 antikor 3.5.2. adımda belirtilen) iyi başına 200 µL adlı.
    4. 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
  5. Hücre içi active caspase 3 boyama
    1. 1 x perma/yıkama arabellek 10 x perma/yıkama arabellekte Ultrasaf Su 45 mL 5 mL sulandrarak hazırlayın.
    2. Hücre içi active caspase leke anti-caspase-3 antikor 1.3 mL 1 perma/yıkama arabellek x 6,5 mL ekleyerek hazırlayın. Perma/arabellek yıkama için antikor oranı 1: 5'tir.
    3. 300 x g de plaka spin ve 4 ° C, 5 dakika süreyle fiske çözüm atmak için plaka. 1 x perma/yıkama arabelleği 200 µL Tabağını yıka.
    4. 3.5.3 arasındaki adımları yineleyin.
    5. 300 x g de plaka spin ve 4 ° C, 5 dakika süreyle fiske çözüm atmak için plaka. Hücre içi caspase leke bütün wells 3.5.2. adımda hazırlanan 75 µL ekleyin.
    6. Bir çok kanallı pipet kullanarak örnekleri mix ve 1 h için buz üzerinde kuluçkaya.
    7. 1 x perma/yıkama arabelleği 200 µL örnekleriyle yıkama ve 300 x g ve 5 min için 4 ° C plaka spin.
    8. Çözüm atmak için plaka fiske. 1 x perma/yıkama arabelleği 200 µL Tabağını yıka. 300 x g ve 5 min için 4 ° C plaka Döndür.
    9. Çözüm atıp örnekleri FACS yıkama arabellek 200 µL içinde resuspend için plaka fiske.
    10. Bir akış sitometrik analiz örnekleri çalıştırmak ve sonuçları bir FACS analiz programı ile analiz.
    11. DP timositleri nüfus CD4 ve CD8 olumlu bir ifade ile bir CD4 ve CD8 arsa kullanarak, kapı (Şekil 2, yarısı alt). DP thymocyte kapı içinde harekete geçirmek caspase-3, unstimulated örnek olumlu denetim negatif kontrol ve deksametazon kullanarak hücrelerle yüzdesini belirlemek. DP thymocyte kapı CD69 ifadede analiz için unstimulated örnek olumlu denetim negatif kontrol ve uyarılmış örnek kullanın.
      Not: DP timositleri geçişi, DP timositleri nüfusa doğru bireysel örnekleri için geçişli doğrulayın. Sıkı bir DP kapı kullanılırsa teşvik hücreleri tümleyici yüzey coreceptors ve istenmeyen bir dışlama olayların ortaya çıkar.

4. kinaz inhibitörü Kütüphane (santrifüj bağımsız tahlil) Eleme

  1. Timositleri kinaz inhibitörleri ile tedavi
    1. Aynı derecede bölüm 1 thymocyte süspansiyon hazırlamak.
    2. 25 x 106 hücre/mL bir thymocyte askıya almak için tam RPMI içinde timositleri sulandırmak.
    3. Timositleri 40 µL bir çok kanallı pipet kullanarak bir küçük hacimli tabak her şey için ekleyin. Plaka buza koyun.
    4. Bir bölümü inhibitörü/DMSO/deksametazon (5 seyreltme faktörü) ile hisse senedi plaka, DMSO ve tam RPMI tam RPMI dört bölümden oranında deksametazon inhibitörleri sulandırmak.
      Not: Bu küçük hacimli tabak içinde kullanılan birimleri 5 x geleneksel yöntemde daha küçük olduğundan, inhibitörleri ve denetim kimyasalları seyreltilmiş onları timositleri plaka için eklemeden önce beş kat.
    5. İnhibitörleri 0.5 µL 96-şey plakasına 4.1.4 adımda hazırlanan inhibitörü plaka karşılık gelen kuyulardan ekleyin.
    6. Tedavi edilmemiş denetimleri sekiz kuyu hazırlayın. 4.1.4. adımda hazırlanan DMSO 0.5 µL ekleyerek denetimleri araç tedavi dört kuyu hazırlayın. 4.1.4 (Şekil 2). adımda hazırlanan seyreltilmiş deksametazon kullanarak 5 µM deksametazon tedavi denetimleri, dört kuyu hazırlayın.
  2. Anti-CD3/CD28 boncuk kullanarak timositleri uyarılması
    1. Boncuk düzgün resuspended emin olun. Boncuk 1 mL al ve PBS 2 mL ile yıkayın. Manyetik bir stand kullanarak boncuk ayrı ve çözüm Aspire edin. Boncuk 1 mL tam RPMI resuspend.
      Not: 1-2,5 boncuk hücrelere oranıdır. Boncuklar, uyarmak için kuyu sayısı ve timositleri kullanılan sayısı bağlı olarak miktarını belirleyin.
    2. Boncuk süspansiyon 10 µL önleyici tedavi her örnek, dört DMSO tedavi örnekleri ve dört sekiz tedavi edilmezse örnekleri ekleyin. Tam RPMI 10 µL kalan dört tedavi edilmeyen kuyular için ekleyin. Şekil 2 genel plaka düzenini gösterir.
      Not: Son Wells içinde Wells kapasitesi maksimum 50 µL birimdir. Dikkatli olmalarını ve tabakalar dik, çapraz-şey dökülmeyi önlemek için tutmak için önemlidir.
    3. Karıştırmak için bir Mikroplaka orbital çalkalayıcı kullanarak plaka kışkırtmak. Alternatif olarak, bir çok kanallı pipet kullanarak wells içeriğini karıştırmak.
    4. Bir 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka için 17-20 h timositleri kuluçkaya (veya bir gece) ile bir anti-buharlaşma kapağı.
  3. Tabak yıkama kurulumu
    Not: tabak yıkama kadar ayarlama yönergeleri üreticisi tarafından sağlanır. Adımları kısaca aşağıda belirtilmiştir. Yaklaşık 150 mL çözeltisi her astar adım için gereklidir.
    1. Yıkama sistemi içeren % %1 70 etanol ile Başbakan ara 20.
    2. % 1'i içeren deiyonize su ile yıkama sistemi Başbakan ara 20.
    3. Yıkama sistemi FACS yıkama arabelleği ile Başbakan.
  4. Yüzey antijenleri ile boyama
    1. Anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 ve anti-CD69 antikorlar içeren bir antikor boyama karışım hazırlayın. 1: 100 (v/v) oranında FACS yıkama arabellekte antikorlar sulandırmak.
    2. Plaka 9 x 55 µL FACS yıkama arabelleği yıkama yıkama sistemi otomatik laminar akış kullanarak, başına kullanarak yıkayın.
      Not: yıkama sonunda, her şey artık hacminin 25 µL olacak.
    3. 4.4.1. adımda hazırlanan boyama antikor karışımı 25 µL hücrelerde resuspend.
    4. 96-şey plaka (Kimden adım 3.3.4) örnekleri aktardıysanız 3.3.1. adımda hazırlanan antikor karışımdan 50 µL hücrelerde resuspend ve küçük hacimli plakasına örnekleri aktarın. Bu adım Yöntem sayısı 2, 1A rakamtasvir karşılık gelir.
    5. Karıştırmak için plaka Mikroplaka orbital çalkalayıcı ile tahrik veya bir çok kanallı pipet kullanarak örnekleri karıştırın ve 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
  5. Hücreleri fiksasyonu
    1. Plaka 9 x 55 µL FACS yıkama arabelleği yıkama yıkama sistemi otomatik laminar akış kullanarak, başına kullanarak yıkayın.
    2. Fiksasyon/permeabilization arabellek ekleyin (active caspase-3 apoptosis kit ile; geliyor 10 x perma/yıkama arabellek ile aynı adımda 4.6.1 ve anti-caspase-3 antikor 4.6.2. adımda belirtilen) iyi başına 50 µL adlı.
    3. 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
  6. Hücre içi active caspase 3 boyama
    1. 1 x perma/yıkama arabellek arabellekte 225 mL Ultrasaf Su perma/yıkama 10 x 25 mL sulandrarak hazırlayın.
    2. Hücre içi active caspase leke 1 perma/yıkama arabellek x 2 mL 1 mL anti-caspase-3 antikor ekleyerek hazırlayın. Perma/arabellek yıkama için antikor oranı 1: 2'dir.
    3. 1 x perma/yıkama arabellek yıkama sistemiyle Başbakan.
    4. Plaka 9 yıkama x 1 x 55 µL her yıkama için perma/yıkama arabellek ile.
    5. Bütün wells 4.6.2. adımda hazırlanan hücre içi caspase leke 25 µL ekleyin.
    6. Karıştırmak için plaka Mikroplaka orbital çalkalayıcı ile tahrik veya bir çok kanallı pipet kullanarak örnekleri karıştırın ve 1 h için buz üzerinde kuluçkaya.
    7. Plaka 9 yıkama x 1 x 55 µL her yıkama için perma/yıkama arabellek ile.
    8. 25 µL FACS yıkama arabelleği için bütün wells ekleyin.
    9. Örnekler üzerinden yeterli karıştırma pipetting sonra microtiter tüpler için transfer.
    10. Başka bir 50 µL FACS yıkama arabelleği boş wells ekleyin ve 4.6.9 arasındaki adımları yineleyin.
    11. 4.6.9 ve 4.6.10 numaralı adımları yineleyin 2 x 200 µL örnekleri toplanır kadar microtiter tüplerde.
      Not: 4.6.10 ve 4.6.11 numaralı adımlarda açıklanan yordamları amacı küçük hacimli plaka hücrelerin en büyük bir kurtarma sağlamaktır. Hücre sayıları adım 4.6.10 sonra bir endişe değil, Eğer, sadece microtiter kontör FACS yıkama arabelleği ile 200 µL tüpleri.
    12. Bir akış sitometrik analiz örnekleri çalıştırmak ve sonuçları adım 3.5.11 göre bir FACS analiz programı ile analiz. Caspase-3 harekete geçirmek ve CD69 ifade CD4 içeren kapıda analiz+CD8+DP timositleri.

Sonuçlar

Tarama tahlil için yaklaşım Şekil 1Aile özetlenir. Kinaz inhibitörleri ilk thymocyte canlılığı gizli etkileri için gösterildi. Apoptozis için olumlu bir denetim olarak deksametazon bir proapoptotic ajan olarak kullanıldı. İçin canlı hücre nüfus çoğunluğuna dayalı tedavi edilmezse olumsuz denetimleri ve deksametazon tedavi olumlu denetimleri (Şekil 1B) tespit edilmiştir. İnhibitörleri ilk 10 µM timositleri üzerinde test edildi ve hücrelerin yüzdesi için 18 h kuluçka sonra ölçüldü. Öyle ki bu bileşikleri indüklenen hücre ölümü için % 20 pencere seçildi bir daha büyük %20 DMSO tedavi örnekleri için karşılaştırıldığında canlı hücre kapısında hücrelerinin kaybı düşük konsantrasyonlarda (Şekil 1B) test edildi. Seçili önleyici tedavi örnekleri ve temsilcisi FACS araziler canlılığı tahlil göstermek için gösterilir. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; CA'ları 154447-36-6), bir PI3K inhibitörü22, büyük ölçüde hücre ölümü 10 µM, artış ve engelleyici 10 µM sonraki deneyleri için kullanıldı. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide; CAS 1202884-94-3), bir çift inhibitörü olan PI3Kα/mTOR23, indüklenen hücre ölümü 10 µM, yüksek düzeyde ve 1 µM ancak 0,1 µM ve 0,1 µM uygulamada aşağı akım deneyleri için uygun toplama olmak tespit edildi. Staurosporine (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one; CA'ları 62996-74-1), bir pan-protein kinaz C inhibitörü apoptosis24, ikna etmek için kurulan bir yetenek ile test, hatta 0,1 µM tüm konsantrasyonlarda önemli hücre ölüm indüklenen. 0,1 µM, sonraki deneyleri içinde ek bir olumlu denetim kullanıldı.

İnhibitörleri son konsantrasyonları neyin onlar hücre ölümü DMSO tedavi örnekleri fazla % 20 tarafından yükseltmek değil en yüksek konsantrasyonları dayalı seçildi. Öyle ki tüm inhibitörleri hücrelere uygulanan 500 kere konsantrasyonu olduğunu tespit inhibitörleri son konsantrasyonları ile inhibitörleri hisse senedi bir tabak hazırlanmıştır. Şekil 1 c hisse senedi plaka, plaka düzen inhibitörleri son konsantrasyonları ile gösterilmektedir. Küçük hacimli tabakalar laminar akış tahlil yıkama için doğrudan hücrelerde kuluçka, alternatif protokolünde küçük birimlerin kullanımını inhibitörleri başka bir seyreltme gerektirdiği. Öyle ki uygulandığında 100 kere amaçlanan konsantrasyonu, olduklarını inhibitörü ek hücreler için çok yüksek olmaz sonra kültürlerinin DMSO içeriği sağlamak için inhibitörleri daha fazla tam RPMI içinde 5, seyreltme faktörüyle seyreltilmiş hücreleri.

Toksik olmayan konsantrasyonları için seyreltilmiş inhibitörleri, tahlil TCR stimülasyon indüklenen apoptosis timositleri5,17için kullanılmıştır. Stimülasyon 18 h için anti-CD3/CD28 boncuklar kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve hücreleri daha sonra caspase-3 harekete geçirmek içinde CD4 için lekeli+ ve CD8+ DP thymocyte nüfusu (Şekil 2). Caspase-3 harekete geçirmek ve CD69 ifade ve ayrıca TCR downregülasyon artış anti-CD3/CD28-teşvik ve nonstimulated örnekleri karşılaştırıldığında DMSO sahte tedavi anti-CD3/28-teşvik örnekleri, gözlendi. Deksametazon tedavi örnekleri caspase-3 harekete geçirmek içinde TCR uyarılması bağımsız olmak apoptosis indükleyici etkisini bekleniyor CD69 upregulation bağımsız bir artış gösterdi.

Şekil 3A tahlil için seçili inhibitörleri eleme Kütüphane sonuçlarını özetler. Caspase-3 harekete geçirmek ve CD69 potansiyel inhibitörleri ifade bastırılması nedeniyle ilgi tanımlamak için kullanılabilir. Beklendiği gibi ekranlarda pozitif sayısı olarak inhibitörleri TCR sinyal kurallı arabulucu ortaya çıktı. İnhibitör etki gücüne değişen derecelerde sergilenen, böyle inhibitörleri hedef birden çok kinaz ve ayrıca, daha fazla geniş spektrumlu inhibitörleri dahil belirli inhibitörleri. Bazı inhibitörleri caspase-3 harekete geçirmek ve CD69 upregulation (Şekil 3B, üst satır, sol kapı aynası) bastırmak başardık. Bir tür inhibitörü olan bisindolylmaleimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione; CA'ları 137592-45-1), protein kinaz A ve PDK125,26,27ek olarak tüm protein kinaz C izoformlarının engeller. Bu kategorideki başka bir inhibitörü olan CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide; CA 494772-86-0), önerilen bir inhibitörü olan IKK228.

CD69 upregulation inhibe ama caspase-3 harekete geçirmek (Şekil 3B, üst satır, doğru panelleri) zarar değil bileşikler vardı. CAY10626, PI3Kα ve mTOR23ve U-0126 bir inhibitörü (2,3-bis [amino [(2-aminophenyl) thio] metilen]-butanedinitrile; CAS 109511-58-2), bir MEK inhibitörü29, tanımlanan inhibitörleri bazıları. Sonuçlar farklı inhibitörleri belirli dalları TCR sinyal yolu üzerinden farklı kinaz özellikle son aşama kinaz, Hedefleme hedefleme T-hücre etkinleştirme olayları seçici bozulma neden olabilir gösterir.

Ayrıca CD69 upregulation ve caspase-3 harekete geçirmek (Şekil 3B, alt satır, sol kapı aynası) engelleme inhibitörleri idi. Paklitaksel (βS-(benzoylamino) - αR - hidroksi-benzenepropanoic asit, (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 , 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl ester; CA'ları 33069-62-4), bir topu Mikrotubul dynamics30ve necrostatin-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile; CA'ları 337349-54-9), bir inhibitörü RIP1 kinaz31, iki inhibitörleri bu kategoride olmak tespit vardır. Nerede CD69 upregulation ve caspase-3 harekete geçirmek zayıflatmak değildi bu gibi durumlarda, bu inhibitörleri nedeniyle ilgili kinaz yolu sinyal TCR hedefliyor değil.

Daha önce belirtildiği gibi staurosporine hala timositleri apoptosis indüklenen bir konsantrasyon, ekranlar kullanılmıştır. Beklendiği gibi caspase-3 harekete geçirmek (Şekil 3B, alt satır, sağ sütun) yüksek düzeyde staurosporine tedavi örnek gösterdi. Bisindolylmaleimide II, başka bir pan-PKC inhibitörü, ayrıca CD69 ifade bastırılmış olarak CD69 ifade seviyesinin düşük PKC, staurosporine-aracılı inhibisyonu için bağlanabilir. Alternatif olarak, onlar için upregulate önce staurosporine CD69 ifade hücrelerde apoptoz indüklenen.

İşlem hacmi ve otomasyon iletişim kuralının artırmak için bir otomatik plaka sistemi üzerinden laminar akış yıkama kullanımı dahil paralel iletişim kuralları hazırlanmıştır. Bu otomatik plaka çamaşır aygıtı kullanan iki ayrı protokol yargılandın ve 96-şey plakaları hücrelerde kültür ve Santrifüjü bağımlı Protokolü hücrelerde boyama geleneksel yöntemi ile karşılaştırıldığında. 96-şey kaplamalar, standart prosedür aynı derecede hücrelerde kültür bir yöntem dahil ve boyama için hücreleri plakaları otomatik plaka yıkayıcı ile uyumlu aktarma (Şekil 4, DA-çamaşır örnekleri) adımları. Diğer yöntem hücreleri doğrudan plaka çamaşır makinesi uyumlu plakaları kültür ve sürekli aynı plaka (Şekil 4, DA-kültür örnekleri) üzerinde boyama protokolü ile ilgili. Santrifüjü bağımsız iletişim kuralları etkin caspase-3, CD69 veya TCRβ test, geleneksel Santrifüjü bağımlı Protokolü (Şekil 4) ile karşılaştırıldığında farklı örnekleri arasında boyama birçok hissedilir farklar vermeyin. Boyama yoğunluk farklılıkları antikorlar biraz farklı konsantrasyonlarda boyama sırasında adımlarla için bağlanabilir.

figure-results-8803
Resim 1 : Thymocyte canlılığı inhibitörleri ile tedavi sonrası. (A)tarama tahlil temel adımlardan deneysel anahat. Stimülasyon ve yani (1 bir geleneksel Santrifüjü tabanlı iletişim kuralını kullanarak boyama tarafından takip standart 96-şey tabak içinde timositleri, kültür etkinleştirme yöntemi, kullanılan timositleri ile boyama için üç önerilen yöntem vardır (2) Santrifüjü bağımsız çamaşır Protokolü ve (3) kullanarak boyama tarafından izlenen standart 96-şey tabak içinde timositleri, küçük hacimli kaplamalar içinde timositleri kültür kültür takip kullanarak aynı levha boyama tarafından bir Santrifüjü bağımsız çamaşır protokolü. (B) canlılık deneyleri kullanılan stratejiler geçişi. Canlı hücre kapısı ileri dağılım (FSC) elde edildi ve yan dağılım (SSC), yukarıda açıklanan17olarak çizer. Tabi 10 kat daha düşük konsantrasyonlarda daha fazla canlılık testleri test edilen konsantrasyon çok toksik olmak kabul edildi inhibitörleri vardı. Temsilcisi önleyici tedavi örnekleri gösterilir. 1 µM ve 0,1 µM örnekler için kullanılan ortak denetim (DMSO tedavi [DMSO]) unutmayın. (C) seyreltilmiş inhibitörleri yerleşimini plaka. 500 x amaçlanan son konsantrasyonu konsantrasyonu DMSO içinde seyreltilmiş inhibitörleri plakaları şematik gösterimi. Her şey bir benzersiz inhibitörü temsil eder; gri kuyu bomboş. Gösterilen konsantrasyonları hücre kültürleri için yani 10 µM (Bordo), 1 µM (Fuşya) ve 0,1 µM (mavi) eklendiğinde son konsantrasyonu vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-10689
Resim 2 : Thymocyte harekete geçirmek tahlil plaka yerleşimini. (Üst) Sütun 2-11 önleyici tedavi örnekleri (bej) iken sütun 1 ve 12 denetimler için ayrılmıştır. Kuyu A1 D1 için negatif kontrol (nonstimulated [NS]; gri) kaplar ve hücre ölümü (deksametazon tedavi [DEX]; mor) için pozitif kontrol wells E1 H1 için kaplar. Sütunlar 2-12 timositleri anti-CD3/CD28 boncuk ile uyarılan içerir. Pozitif kontrol için thymocyte harekete geçirmek (uyarılmış örnekleri [α-CD3/CD28]; yeşil) kuyu A12 D12 ve araç kontrolü için kaplar (uyarılmış ve DMSO tedavi [α-CD3/CD28 + DMSO]; kırmızı) kuyu E12 H12 için kaplar. (Alt) Akış Sitometresi araziler active caspase-3 (ActCasp3), CD69 ve çift-pozitif (DP) kapı içinde kapı timositleri, TCRβ boyama. Farklı denetim temsilcisi araziler gösterilir. NS nonstimulated; = DEX deksametazon tedavi örnekleri; = Α-CD3/CD28 + DMSO CD3/CD28-kaplı boncuk ile uyarılmış ve DMSO ile; tedavi örnekleri = Α-CD3/CD28 örnekleri CD3/CD28-kaplı boncuk ile uyarılan =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-12029
Şekil 3 : Thymocyte etkinleştirme hakkında inhibitörü Kütüphanesi eleme. (A)özetlenmiş verileri harekete geçirmek testin. Bu hücrelerin aktif caspase-3 ve CD69 ifade için seçili inhibitörleri ile Normalleştirilmiş değerleri gösteren temsili bir denemenin sonuçları vardır. Normalleştirme aktif-caspase-3-pozitif veya 0 grafik içinde göreli değeri ayarlanır DMSO tedavi denetiminin değerini kapıya CD69 pozitif hücreler yüzdesi karşılaştırarak yapıldı. (B) seçili FACS çizer. Caspase-3 harekete geçirmek ve CD69 upregulation (sol üst), bastırılmış inhibitörleri ve akış sitometresi araziler sadece CD69 upregulation (sağ üst) bastırılır veya caspase-3 harekete geçirmek ve CD69 upregulation (sol alt) üzerinde bir etkisi vardı. Staurosporine tedavi edilen örnek ve araziler toksik konsantrasyonları (sağ altta) bir inhibitörü kullanarak etkilerini göstermek için gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-13295
Şekil 4 : Farklı tahlil protokollerinin karşılaştırılması. Akış Sitometresi araziler active caspase-3 (ActCasp3), CD69, ve TCRβ üç farklı takip DP timositleri boyama tahlil protokolleri. Dört farklı koşullarda test, yani negatif kontrol (nonstimulated [NS]), hücre ölümü (deksametazon tedavi [DEX]) için pozitif kontrolü, araç kontrol (uyarılmış ve DMSO tedavi [α-CD3/CD28 + DMSO]) ve bir önleyici tedavi örnek (uyarılmış ve PIK-75-tedavi [α-CD3/CD28 + PIK-75]). Geleneksel = standart 96-şey tabak içinde timositleri, kültür ve boyama geleneksel Santrifüjü tabanlı protokol ile; DA-çamaşır = standart 96-şey tabak içinde timositleri kültür ve laminar akış protokolü; yıkama kullanarak boyama DA-kültür küçük hacimli tabak içinde timositleri kültür ve laminar akış protokolü yıkama kullanarak aynı levha boyama =.  Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Burada önerilen tarama strateji timositleri apoptotik etkileri stimülasyon, T-hücre harekete geçirmek-CD69 upregulation ve TCR downregülasyon daha geleneksel işaretleri yanı sıra sonra bastırmak için küçük molekül inhibitörleri yeteneğini değerlendirir . Ek işaretleri farklı thymocyte alt kümeleri32analizini etkinleştirmek için de. TCR sinyal engel inhibitörleri de daha fazla ayrım inhibitörleri hücre ölümü inducing olabilir TCR bağımsız etkileri vurgulayarak apoptosis, indüksiyon nemlendirin geçerli testin ilginç bir yönü yatıyor. Ayrıca, bir akış sitometresi-tabanlı tahlil inhibitörlerinin etkileri TCR sinyal, ayrı bireysel dallarda rapor olabilir farklı harekete geçirmek işaretleyici olarak birden çok güzel kullanımı sağlar. Burada sunulan durumda caspase-3 harekete geçirmek ve CD69 upregulation fark inhibisyonu gösterdi inhibitörleri vardı. Çünkü bazı bileşikler protein sentezi veya veziküler kaçakçılığı gibi temizlik işlevleri etkileyebilir, bu etkileri upregulation sentez de novo işaretleri (Örneğin, CD69) ama üzerinde ardından gözlemlemek için şaşırtıcı değil değişiklikler (Örneğin, caspase-3 proteolitik aktivasyonu).

Sunulan tahlil olarak burada apoptosis ölçer bir okuma bu inhibitörleri gizli toksik etkileri sonuçları belirsiz değil zorunludur. Örneğin, ekranda, biz staurosporine 1 ötesinde seyreltik değil nM, hâlâ o konsantrasyonu, hücrelere toksik varlık rağmen. Önüne gelenle yatıp kalkan kinaz inhibitörü ve bir uyarıcı apoptosis33olmak staurosporine ile anlaşma temsilcisi sonuçlarıdır. Yeterli seyreltme için toksik olmayan konsantrasyonları test bileşikler potansiyel sayısı gözden kaçırmak mümkündür.

Burada ayrıntılı tarama strateji timositleri yüksek üretilen iş tarama için yeterli sayıda elde etme ile ilgili komplikasyonlar nedeniyle insanlar uygulamak zor olacaktır. Ancak, Pediatrik kardiyak biyopsi34,35 veya fetusa36,37insan timus örnekleri edinmek mümkündür. Yine de, yollar ve sinyal Proteinler amino asit dizileri büyük ölçüde fareler ve insanlar arasında korunmuş TCR sinyal olarak thymocyte tahlil yararlı ön elemeyi strateji sağlar ve fare kullanarak bu tahlil ile herhangi bir sonuç elde timositleri sonra birincil insan lenfosit doğrulanabilir.

Geleneksel Santrifüjü bağlı iletişim kuralı bir sınırlama hücre permeabilization ve Santrifüjü gibi adımları içerir süreç multistep doğası atfedilen hücre kaybı olasılığı ile ilgilidir. Her Santrifüjü hem de resuspension adım hücrelerinin kaybı kaçınılmaz olur. Böyle kayıplar sınırlı sayıda örnekleri içeren çalışmalar için kritik olmayabilir iken, akışı sağlayarak daha yüksek tarama özellikle ilerledikçe tahlil biçimi 96-384 - için 1536-iyi uygulandığında sorunlar doğuracak. Bu sorunu aşmak için bir hücre permeabilization ve birden çok yıkar5komplikasyonları kaçınırken caspase harekete geçirmek algılanabilmesi hücre geçirgen floresan caspase sensörleri38 aracılığıyla yoludur. Alternatif olarak, istihdam, laminer akış tarafından hücreleri Yıkama Santrifüjü bağımsız bir yöntem hücre kaybı en aza indirmek için olanağı da sağlar. Bir duvar daha az plaka ile birlikte İstasyonu yıkama bir otomatik plaka ile hücreleri laminar akış bir santrifüj kullanımı olmadan tarafından yıkanır. Reaktifler üstel seyreltme kapsamlı ve verimli az 3 santrifüj çamaşır iki tur için eşdeğer bir seyreltme temsil eden dk, hücrelerinin durulama için sağlar. Dış gerilmeler Santrifüjü nedeniyle olmadan hücreleri daha uygun ve hücre kayıpları en aza indirilir.

Timositleri 96-şey U-alt kültür sonra İstasyonu yıkama otomatik plaka kullanma imkanı da keşfettik plakaları ve ayrıca, hücreleri doğrudan duvar daha az plakaları İstasyonu yıkama otomatik plaka ile uyumlu kültür. Duvar-az plakaları hücre kültürü çalışmalarının tüm aralıklarla merdiven ortadan kaldırılması etkin ve plakalar arasında bir örnek transfer gereksinimini ortadan kaldırarak hücre kaybı en aza indirilmiştir. Genel olarak, üç farklı protokoller stimülasyon etkinlik ve boyama içinde karşılaştırılabilir. Otomatik yıkama istasyonu Otomasyonu, hız ve verimlilik, yüksek üretilen iş analizi kolaylaştırır yararı sağlar. Ayrıca, artan Otomasyon ile çamaşır adımları daha hızlı yapılabilir ve deneyler veya Denemecileri arasında büyük bir tutarlılık olduğunu. Ancak, yıkama istasyonu bazı dezavantajları vardır:, arabellekleri yıkama geniş hacimli gereklidir priming çamaşır makinesi için hangi 50 mL yıkamak için kullanılan arabellek değişikliği, ücret (150 mL); ekstra bakım plaka işleme herhangi bir çapraz bulaşma sınırlı küçük hacimli plaka kuyular arasında bölümleme nedeniyle Wells önlemek için gerekli olduğu; Çamaşır daha yüksek bir hazır reaktifler kullanımı gerektirir sonra Wells 25 µL kalan arabellek 1 x konsantrasyon daha. Kalan cilt sorunları ve sınırlı birim kapasitesi plaka adrese, 70 µL kuluçka birimden 150 µL için genişletmek için suç ortağı, geleneksel iletişim kuralları kabulü kolaylaştırıcı eklenebilir. Otomatik Plaka işleme sistemleri şu anda mevcut olmakla birlikte, onlar ~ 1 kübik ayak (~0.028 m3) küçük birimidir laminer yıkama sistemi için karşılaştırıldığında önemli bir ayak izi var. Ayrıca, aralıklarla otomatik plaka işleme sistemlerini tümleştirme hücre çamaşır onların kullanımda sınırlama meydan okuyor. Şu an bildiğimiz gibi aletler kullanılabilir, yıkama yok santrifüj bağımsız hücre bulunmaktadır.

Burada sunulan tarama strateji küçük moleküller ve TCR sinyal ve T Hücre aktivasyonu etkileyen onların sözde hedef kinaz tanımlamak yapabiliyor. Burada kullanılan kitaplık kinaz inhibitörleri küçük molekül ağırlıklı oluşur ve potansiyel sayısı ilginç bir dizi elde edebilecektir. İletişim kuralı da kolayca inhibitörü kitaplıklarına diğer enzim sınıfları veya küçük moleküller diğer türleri için hem de diğer bileşikler (Örneğin, çeşitli oluştururlar) kitaplıklara uygulanır. İletişim kuralı ekran Periferik T lenfositler veya transgenik TCRs ifade veya muhabir sistemleri taşıyan dahil olmak üzere ölümsüzleştirdi hücreleri gibi diğer hücre tipleri için kullanılabilir. Belirlenmesi ve T-hücre sinyal yolu ile ilgili bilgilerimizi artırmak ve aynı zamanda hedefe yönelik tedavi immün hastalıklar13,14,15, , geliştirilmesinde yardım sinyali yeni arabulucu karakterize 16. tüm, bu çalışmada T-hücre sinyal yolu ile yüksek-den geçerek tarama deneyleri arabulucu tespiti için kullanılabilir seçenekler aralığına ekler.

Açıklamalar

Yazar Chyan Ying Ke Curiox Klinikleri, DA-hücre yıkayıcı ve bu makalede kullanılan DA hücreli plakaları üreten bir çalışandır.

Teşekkürler

Bu eser hibe Singapur Sağlık Bakanlığı'nın Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi, NMRC CBRG15may017 ve Singapur Eğitim Bakanlığı, 2014-T2-1-136 (N.R.J.G.) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMIHyCloneSH30027FS
FBSHyCloneSH3007103
L-GlutamineHyCloneSH3003401
Sodium pyruvateHyCloneSH3023901
Penicillin/StreptomycinHyCloneSV30010
b-mercaptoethanolSigma Aldrich516732 
10X PBSVivantisPB0344 – 1L
Kinase Screening Library (96-Well)Cayman Chemical10505Exact contents of the library may vary
DMSOSigma AldrichD2650
DexamethasoneSigma AldrichD4902 
anti-CD3/CD28 beadsThermo Fisher Scientific11452D
FITC Active Caspase-3 Apoptosis KitBD Pharmingen550480Contains Fixation/Permeabilisation buffer, 10X Perm/Wash buffer and anti-caspase 3 antibody
DA-Cell WasherCURIOXHT1000
96-well DA-Cell PlateCURIOX96-DC-CL-05
Antibodies
CD3eBioLegend100236
TCRbBD Biosciences553174
CD4BD Biosciences740007
CD8BD Biosciences563786
CD69eBioscience25-0699-42
Inhibitors
TG003Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
PKC 412Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
DoramapimodCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
PaclitaxelCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
ErlotinibCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Necrostatin-5Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
NVP-BEZ235Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Phthalazinone pyrazoleCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
AG-879Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
1-NA-PP1Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Torin 1Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide IICayman Chemical-From the Kinase Screening Library
BIBF 1120Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
SMI-4aCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide XI (hydrochloride)Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
CAY10657Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
AS-703026Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Chelerythrine chlorideCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
TunicamycinCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
GSK 1059615Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
RuxolitinibCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Necrostatin-1Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
SB 505124Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
INK128Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Canertinib (hydrochloride)Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
SB 431542Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
PD 173074Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Valproic Acid (sodium salt)Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
PD 0325901Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
SB 203580Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
VX-702Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
EmodinCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
CHIR99021Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
BIOCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Imatinib (mesylate)Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Sunitinib MalateCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
GefitinibCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
PP2Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
3-MethyladenineCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide ICayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide IVCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide VCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
NSC 663284Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
D 4476Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
NU 7026Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
H-9 (hydrochloride)Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Indirubin-3'-monoximeCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
KN-62Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
KN-93Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
CGP 57380Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Iso-OlomoucineCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
(S)-Glycyl-H-1152 (hydrochloride)Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide VIII (acetate)Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
ST638Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
SU 6656Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
LY364947Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
SB 203580 (hydrochloride)Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
CAY10621Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
YM-201636Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
ZM 447439Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
AS-041164Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
NVP-AEW541 (hydrochloride)Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
PP242Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
ABT-869Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
CAY10622Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
17β-hydroxy WortmanninCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
CAY10626Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
SU 6668Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
CAY10572Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
N,N-DimethylsphingosineCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
LY294002Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
U-0126Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
StaurosporineCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
KN-92 (hydrochloride)Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
AS-605240 (potassium salt)Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
O-1918Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Y-27632 (hydrochloride)Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
LeelamineCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
PD 98059Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
PD 169316Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
TGX-221Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
(S)-H-1152 (hydrochloride)Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
AS-605240Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
D-erythro-Sphingosine C-18Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
OSU03012Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
JNJ-10198409Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Leelamine (hydrochloride)Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Arachidonic Acid LeelamideCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Lauric Acid LeelamideCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
AS-252424Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
CAY10505Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
PI-103Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
PIK-75 (hydrochloride)Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Sphingosine Kinase Inhibitor 2Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
PiceatannolCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
SC-1Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
(R)-RoscovitineCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
BAY-43-9006Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
CAY10561Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
AS-604850Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
PI3-Kinase α Inhibitor 2Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
ML-9Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
TriciribineCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Erbstatin AnalogCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
KenpaulloneCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
OlomoucineCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
AG-494Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
AG-825Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
AG-1478Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
SB 216763Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
SB 415286Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
AG-17Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
H-8 (hydrochloride)Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
LFM-A13Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
SC-514Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
ApigeninCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
AG-18Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
CAY10554Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
DRBCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
RG-13022Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
RG-14620Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
AG-490Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
AG-82Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
AG-99Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
AG-213Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
AG-183Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Lavendustin CCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
ZM 336372Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
5-IodotubercidinCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
SB 202190Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
CAY10571Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
NilotinibCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
SP 600125Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
L-threo-Sphingosine C-18Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
H-89Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
HA-1077 (hydrochloride)Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
AG-370Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
WortmanninCayman Chemical-From the Kinase Screening Library
AG-1296Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
KT 5823Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
Janex 1Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
CAY10574Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
CAY10575Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
CAY10576Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
NH125Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
TWS119Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
NSC 210902Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
CAY10577Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
CAY10578Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
PD 184161Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
CCT018159Cayman Chemical-From the Kinase Screening Library
MyricetinCayman Chemical-From the Kinase Screening Library

Referanslar

  1. Gascoigne, N. R., Rybakin, V., Acuto, O., Brzostek, J. TCR Signal Strength and T Cell Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 327-348 (2016).
  2. Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 9-21 (2008).
  3. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nature Reviews Immunology. 9 (12), 833-844 (2009).
  4. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annual Review of Immunology. 21, 139-176 (2003).
  5. Rybakin, V., Gascoigne, N. R. Negative selection assay based on stimulation of T cell receptor transgenic thymocytes with peptide-MHC tetramers. PLoS One. 7 (8), e43191 (2012).
  6. Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. A role for "self" in T-cell activation. Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).
  7. Nakayama, T., Yamashita, M. The TCR-mediated signaling pathways that control the direction of helper T cell differentiation. Seminars in Immunology. 22 (5), 303-309 (2010).
  8. Hoerter, J. A., et al. Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC. The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).
  9. Zhao, X., et al. Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling. Nature Communications. 9 (1), 2716 (2018).
  10. Fu, G., et al. Fine-tuning T cell receptor signaling to control T cell development. Trends in Immunology. 35 (7), 311-318 (2014).
  11. Wang, D., et al. Tespa1 is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling. Nature Immunology. 13 (6), 560-568 (2012).
  12. Fu, G., et al. Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development. Nature. 504 (7480), 441-445 (2013).
  13. Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. Treating human autoimmunity: current practice and future prospects. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  14. Hebeisen, M., et al. SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1044-1056 (2013).
  15. Wang, R. E., et al. An immunosuppressive antibody-drug conjugate. Journal of the American Chemical Society. 137 (9), 3229-3232 (2015).
  16. Borroto, A., et al. First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases. Science Translational Medicine. 8 (370), (2016).
  17. Chen, E. W., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Development of a screening strategy for new modulators of T cell receptor signaling and T cell activation. Scientific Reports. 8 (1), 10046 (2018).
  18. Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-Nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. Journal of Visualized Experiments. (121), e55199 (2017).
  19. Zhao, Z., et al. A high-throughput phenotypic screen of cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis reveals candidate immunosuppressants. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 359-371 (2015).
  20. Florian, A. E., et al. Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis. Journal of Biomolecular Screening. 18 (4), 420-429 (2013).
  21. Krutzik, P. O., Crane, J. M., Clutter, M. R., Nolan, G. P. High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry. Nature Chemical Biology. 4 (2), 132-142 (2008).
  22. Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F. A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002). The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5241-5248 (1994).
  23. Chen, Z., et al. Synthesis and SAR of novel 4-morpholinopyrrolopyrimidine derivatives as potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 53 (8), 3169-3182 (2010).
  24. Ruegg, U. T., Burgess, G. M. Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10 (6), 218-220 (1989).
  25. Davis, P. D., et al. Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-Bisarylmaleimides. Journal of Medicinal Chemistry. 35 (1), 177-184 (1992).
  26. Komander, D., et al. Interactions of LY333531 and other bisindolyl maleimide inhibitors with PDK1. Structure (London, England: 1993). 12 (2), 215-226 (2004).
  27. Gassel, M., et al. The protein kinase C inhibitor bisindolyl maleimide 2 binds with reversed orientations to different conformations of protein kinase A. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23679-23690 (2004).
  28. Faull, A., Johnstone, C., Morley, A., et al. . Novel compounds. , (2003).
  29. Favata, M. F., et al. Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase. The Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18623-18632 (1998).
  30. Woods, C. M., Zhu, J., McQueney, P. A., Bollag, D., Lazarides, E. Taxol-induced mitotic block triggers rapid onset of a p53-independent apoptotic pathway. Molecular Medicine (Cambridge, MA). 1 (5), 506-526 (1995).
  31. Teng, X., et al. Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 15 (22), 5039-5044 (2005).
  32. Saini, M., et al. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science Signaling. 3 (114), ra23 (2010).
  33. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42 (4), 373-381 (2000).
  34. Varas, A., et al. Analysis of the human neonatal thymus: evidence for a transient thymic involution. Journal of Immunology (Baltimore, MD:1950). 164 (12), 6260-6267 (2000).
  35. Verstichel, G., et al. The checkpoint for agonist selection precedes conventional selection in human thymus. Science Immunology. 2 (8), (2017).
  36. Yamaguchi, E., de Vries, J., Yssel, H. Differentiation of human single-positive fetal thymocytes in vitro into IL-4- and/or IFN-gamma-producing CD4+ and CD8+ T cells. International Immunology. 11 (4), 593-603 (1999).
  37. Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development (Cambridge, UK). 140 (9), 2015-2026 (2013).
  38. Cali, J. J., et al. Bioluminescent assays for ADMET. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (1), 103-120 (2008).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve enfeksiyonsay 143Caspase 3 harekete ge irmekkinaz inhibit rlerielemesinyalT H cre aktivasyonuthymocyte se im TCR K t phane

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır