Arabidopsis montaj için çok yönlü bir yöntem Intravital zaman hata görüntüleme için yaprakları

Özet

Floresan canlı görüntüleme Arabidopsis thaliana yaprakların uzun bir zaman aralığı içinde gerçekleştirmek için basit ve çok yönlü bir yöntemi bildirin. Biz bir transgenik Arabidopsis bitki bitki bağışıklık yanıtı kronolojik zamanmekansal anlayış kazanıyor için bir örnek olarak bir bağışıklık ile ilgili düzenleyici denetimi altındaki bir floresan muhabir gen ifade kullanın.

Özet

Bitki bağışıklık yanıtı bir genom çapında transkripsiyon yeniden programlama ile ilişkili enfeksiyon sitesinde başlatılır. Böylece, bağışıklık yanıtı dağınık şekilde ve geçici düzenlenmiştir. Floresan bir gen bir bağışıklık ile ilgili organizatörü bir otomatik floresans mikroskobu ile birlikte kontrol altında kronolojik zamanmekansal düzenleme bitki bağışıklık, anlamak için basit bir şekilde kullanmaktır. Çeşitli intravital floresan görüntüleme deneyler bir dizi için kullanılan kök dokular aksine, floresan canlı görüntüleme örnekler havadan mikrobiyal enfeksiyonlar bir dizi karşılaşırsanız yaprak dokuları için mevcut. Bu nedenle, zaman uzun süre canlı hücre görüntüleme için Arabidopsis thaliana bitkilerin yaprakları bağlamak için basit bir yöntem geliştirdi. Biz bir savunma ile ilgili marker gen, Pathogenesis-Related 1 (organizatörü kontrolü altında transgenik Arabidopsis bitkiler Sarı floresan protein (YFP) genefused nükleer yerelleştirme sinyal (NLS) için ifade kullanılan PR1). Pseudomonas syringae pv ile transgenik bir yaprak sızmış. domates DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) ve 40 h bir otomatik floresans stereomicroscope kullanma toplam YFP sinyal içinde vivo hızlandırılmış görüntüleme yapılır. Bu yöntem sadece bitki bağışıklık yanıtı araştırmalar aynı zamanda çeşitli gelişim olaylar ve yaprak dokularda meydana gelen çevre yanıt-e doğru analizler için yararlı olabilir.

Giriş

Bitki bağışıklık yanıtı içeren bir dinamik transkripsiyon birden çok transkripsiyon tarafından düzenlenir yeniden programlama faktörler yanı sıra etki¹. Transcriptome veri birikimi bitki bağışıklık sistemi üzerinde bilgi toplamak için fırsatlar sağlar: Örneğin, sinyal ağ yapısı²basamaklandırır. Ancak, kayma ve temporal dinamizm bitki bağışıklık ile ilgili bilgilerimizi hala sınırlı^3,4,5kalır.

Önceki çalışmalarda, kronolojik zamanmekansal düzenleme savunma ile ilgili gen ekspresyonu, çoğunlukla In situ hibridizasyon ve β-glucuronidase (GUS) muhabir tahlil^6,7,8kullanarak analiz. Bu yöntemler bize ilgi yerinde çeşitli genlerin transkripsiyon etkinleştirme görselleştirmek etkinleştirin. Ancak, bu yordamları örneklerin kimyasal fiksasyonu gerektirir ve böylece tüm geçici bilgi kaybına neden. Biyolojik etkinlikler, bağışıklık, zaman içinde ilerleme gibi. Bir muhabir olarak luciferase kullanımı faiz³organizatörü zamansal dinamiği yakalanması sağlamıştır. Ancak, luciferase tabanlı tahlil pahalı bir substrat ve son derece duyarlı detektörlerle gerektirir. Anlayışımız bitki bağışıklık yanıtı basit bir yordam kullanarak kronolojik zamanmekansal yönlerini artırmak için biz transgenik Arabidopsis thaliana üretilen bitkilerin Sarı floresan protein (YFP) ifade için gen erimiş Nükleer yerelleştirme sinyal (YFP-NLS) savunma ile ilgili marker gen, Pathogenesis-Related 1 (PR1)⁹organizatörü kontrol altında. Klorofil autofluorescence, canlı hücreler, bir marker kez efektör tetiklemeli bağışıklık (ETI), bir tür bitki bağışıklık belirli patojen bulaşma⁹ tarafından indüklenen sırasında oluşan programlı hücre ölümü (PCD), işlemi yakalama yapardık ^{, 10}. floresans sinyal yoğunluğu içinde serbestçe hareket eden nesneleri, gibi zamansal dinamiği izleme Arabidopsis yaprakları yaşayan, karmaşık bir görüntü işleme yazılımı şirket içinde inşa edilmiş veya mevcut ticari gerektirir. Alternatif olarak, örnek hareket etmesini engelleyen sorunu çözmek için basit bir yöntemdir. Burada, bir otomatik floresans stereomicroscope altında uzun vadeli gözlem altında transgenik Arabidopsis bitkisinin yaprakları yaşayan montaj için çok yönlü ve basit bir yöntem geliştirdi. Yöntemi dynamics olduğu gibi bitki toprak yerli içerisinde bir kaç gün içinde bırakır organizatörü yakalamak için bize sağlar.

Protokol

Not: Uyku önlemek önemlidir yaşam yaprak hareketi sırasında zaman hata görüntüleme örnekleri. Mekanik stres yapraklarda en aza indirmek için yaprakları yumuşak fiksasyonu gereklidir. Sadece yeterince hazır yaprak örnekleri hızlandırılmış görüntüleri çeşitli görüntü analizleri için uygun üretmek. Transgenik Arabidopsis bitkiler YFP-NLS füzyon PR1 gen Düzenleyici (pPR1-YFP-NLS bitkiler) ve Pseudomonas syringae pv kontrolü altında ifade kullanan bir protokolü. domates DC3000 (avrRpt2) yük (Pst_a2) örnek olarak aşağıda açıklanmıştır.

1. bitki ve patojenler hazırlanması

1. Bir plastik hücre tak tepsi (Tablo reçetesi) autoclaved toprak ile doldurun.
2. Hücre (Şekil 1A) başına bir transgenik Arabidopsis tohum ekmek.
3. 2-3 hafta boyunca sürekli beyaz ışık altında bitkiler büyümek ve tepsiyi 23 ° C'de tutulan bir büyüme Oda transfer.
4. İki gün önce patojen aşılama, Pseudomonas syringae pv çizgi. domates DC3000 avrRpt2 (Pst_a2) NYG Orta (5 g/L pepton, 3 g/L maya ekstresi, 20 mL/L gliserol, 15 g/L bakteriyolojik agar, pH 7,0) içeren 100 mg/L rifampisin ve 50 mg/L sefaloridin üzerine gliserol stoktan strain ve 28 ° c 48 h için kuluçkaya.
5. Plastik ipuçlarını kullanarak orta yüzeyinde görünür bakteri hücreleri hasat, onları 10 mM MgCl₂içeren bir plastik tüp aktarmak ve resuspend. Belgili tanımlık eriyik vasıl 600 optik yoğunluk (OD) ölçmek nm (OD₆₀₀). Son hücre konsantrasyonu 10⁸ koloni oluşumu birimlerine (CFU) bakteri hücreleri ayarlamak / normalde OD₆₀₀ için karşılık gelen mL = 0.2¹¹.

2. patojen aşı

1. Dikkatli bir şekilde 2-3-hafta-yaşlı bitki bitki zarar vermeden içeren bir hücre fiş kesmek. Bir boş hücre tak tepsisinde hücreye ayarla (2 x 2 hücreleri yeterli) iyi bir denge (Şekil 1B) korumak için.
2. Aşılama için gözle görülür sağlıklı bir yaprak seçin. Genel olarak, üçüncü, dördüncü ve beşinci bırakır (#3 ve #4 #5, sırasıyla, Şekil 1C' deki) bitki alttan işlemek kolaydır. Kullanımı daha iyi tekrarlanabilirlik için deneyler bir dizi aynı pozisyonda bırakır. Su toprak bitki aşılama uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme için önce holding.
3. İsteğe bağlı olarak, pPR1gibi stres duyarlı Rehberleri analiz durumunda bitkiler doğal olarak stresli emin olmak için yaprakları patojen Aşılama öncesinde bir floresan stereomicroscope altında YFP sinyal yokluğu doğrulamak için inceleyin. Dışlama gösteren YFP sinyal deneyden bırakır.
4. İnfiltrasyon patojen ile doğrudan temas önlemek için önce tek kullanımlık lateks eldiven giymek. 1 mL needleless plastik Ģırınga kullanarak dikkatle sızmak bakteriyel süspansiyon ile yaprak abaxial tarafında (10⁸ CFU/mL)¹¹ (Şekil 1D). Aşı yaprak yarım saniyeden üzerinde küçük bir bölümünün pPR1 aktivitesinin iyi bir görselleştirme sağlar; infiltre alan daha koyu yeşil renkli kalan yaprak ile karşılaştırıldığında olarak görünür hale gelir. Herhangi bir mekanik yaprak infiltrasyon sırasında zarar değil için son derece dikkatli olun.
   Not: infiltre alanındaki tüm hücreler arası boşlukları tamamen olduğundan emin olun (dikey olarak) yerine patojen süspansiyon; Aksi takdirde, PCD etki alanı altında floresan stereomicroscope görselleştirmek zor olacak. Bu sadece karanlık greening infiltre alanında tamamlanmasıyla tarafından onaylanabilir.
5. Bakteriyel süspansiyon infiltre yaprak yumuşak kağıt havlu ile infiltre bölümünü çevreleyen alandan fazlalığı emer.

3. inoculated yaprak montaj

1. Hemen aşı sonra öyle ki infiltre yaprak cam slayt Merkezi'nde bulunur cerrahi bant (Tablo reçetesi) kullanarak plastik tepsi bir cam slayt gidermek. Yaprak aşılamak bıçak cam slayt (Şekil 2A) içinde tamamen monte emin olun.
2. Plastik bant çift katmanlı hazırlamak (0.2 mm kalın bant söz konusu olduğunda, Tablo malzemelerigörmek) ve ikiye kesilmiş parçalar (Şekil 2B; parçalar 1 ve 2) petiole boyunca alanlarda infiltre yaprak uyacak. Şekil 2içindeAgösterilen iki başlı ok uzunluğu uyması için Şekil 2B, çift başlı bir ok ile gösterilen bu iki parça uzunluğunu düzenlemek.
   Not: her iki parçalar bir köşeden kesmek yaprak bıçak zarar önlemek yardımcı olur (Şekil 2B, ok uçları; Ayrıca adım 3,4 aşağıda bakınız). Plastik bant benzer kalınlığı ile her türlü petiole üzerinde bir köprü yapmak için uygundur. Plastik bant sertliği, aşağıda açıklanan yordamı sırasında kolay kullanım için önemlidir.
3. Öyle ki her parça kesme köşesi (Şekil 2C) yaprak bıçak tabanı ile hizalanır bir çift iyi Cımbız kullanarak, teyp parçalar 1 ve 2 petiole her iki tarafında kal. Teyp adet petiole veya yaprak bıçak dokunmayın emin olun.
   Not: Bu plastik bant çift katmanlı parçalar tabanında yaprak bıçak tutucular hareket ve petiole fiziksel stres montaj sırasında önlemek.
4. Plastik bant (Şekil 2B, parça 3) çift katmanlı ek bir parçası Şekil 2B çift başlı ok boyutuna uygun ve teyp parçalar 1 ve 2 petiole ( üzerinde bir köprü kurmaya üzerine sopa hazır olun Şekil 2D, E). Şekil 2D, Eoklarla gösterilen pozisyonlarda teyp parçalar arasında doğrudan petiole ve yaprak bıçak yakalamak değil son derece dikkatli olun.
5. Böylece yaprak bıçak çok yumuşak cam slayt üzerinde sabit yavaşça cerrahi bant (Şekil 2F, parça 4) yaprak bıçak ucu yukarıda cam slayt üzerinde küçük bir parçası sopa. Yalnızca cerrahi bant doğrudan cam slayt (Şekil 2F, kesik çizgili kırmızı çizgiyle alan), dokunaklı parçası bastırın değil yaprak örten diğer bölümü.
6. Yavaşça petiole sınırda cerrahi bant (Şekil 2G, parça 5) başka bir küçük parçası sopa ve böylece petiole çok yumuşak cam slayt ve plastik bant adet sabittir plastik bant (1, 2 ve 3) adet. Sadece sıkıca doğrudan cam slayt ve plastik bant parçaları (Şekil 2G, kesik çizgili kırmızı çizgiyle alan), cam slayt dokunmadan cerrahi bant parçası eklemek değil petiole örten diğer bölümü.
7. Komşu yaprakları 200 µL pipet ipuçları (Şekil 2H) kullanma mikroskop görüş alanı taşınmasını engelleme. Pipet uçları hafifçe infiltre yaprak uzak komşu yaprakları tutmak için toprak ekleyin. İpuçları çok derin toprak olası kök zarar görmemesi için değil eklemek için dikkatli olun.
   Not: Hazırlanan bitki şimdi floresan stereomicroscope görüntüleme için hazırdır.

4. mikroskobik hızlandırılmış gözlem

1. Floresan stereomicroscope açın.
   Not: Burada, son derece hassas bir 1.4 megapiksel monokrom dijital fotoğraf makinesi 12-bit modunda kullanılır donatılmış bir otomatik stereomicroscope (Malzeme tablo). Mikroskop 23 ° C oda sıcaklığında hızlandırılmış görüntüleme sırasında korumak için yeterli havalandırma ile karanlık bir odada bir klima ünitesi ile donatılmış veya karanlık dolabında yerleştirilmelidir.
2. Bitki stereomicroscope görüntüleme için objektif mercek altında alanı ayarlayın.
3. Hızlandırılmış görüntüleme için parametreleri ayarla ( Tablo 1' deki örneklere bakın). Işık pozlama için program adımlara ışık bitki bağışıklık¹²üzerinde önemli bir etkisi olduğundan zaman hata görüntüleme aralığı süresi sırasında emin olun.
   1. YFP sinyal görselleştirmek için geleneksel YFP filtre (uyarma 500-520 nm; Emisyon 540-580 nm) kullanın.
   2. Texas kırmızı (TXR) filtre (uyarma 540-580 nm; Emisyon 610 nm uzun pası) PCD etki alanı YFP-pozitif hücre katmanları⁹ tarafından (Şekil 3 çevrili karanlık bir alanı (autofluorescence) olarak görünür böylece klorofil autofluorescence görselleştirmek için kullanın A).
   3. Geleneksel epi-parlak alan kurulumu için ek pozlama ışık adımları kullanın.
      Not: Daha önce deneme, epi-parlak ışık kaynağı gücünü ölçmek ve kendi bitki büyüme koşulu seviyeye ayarlayın.
4. Hızlandırılmış görüntüleme programını çalıştırın. Birkaç gün içinde uzun vadeli gözlem için bitki sulama uygun şekilde, örneğin, ışık pozlama adımları sırasında göz önünde bulundurun.
5. Resim alma sonra ilave kanalları için ışık pozlama ( Tablo 1' deki 3-8 kanallara karşılık gelen) aralıklarla veri kümesinden kullanılan atlayın. Veri bölgesi faiz (ROI) analizi, Fiji⁹gibi farklı görüntü analiz yazılımı kullanarak gibi çeşitli yöntemlerle analiz.

Sonuçlar

Burada, Pst_a2kullanılan-hızlandırılmış görüntüleme için bir örnek olarak ETI indüklenen. Hızlandırılmış veri birkaç-in hangi Şekil 3Bgösterilir, görüntüleri, bir dizi ve bir hızlandırılmış film (Tamamlayıcı film 1)⁹olarak elde edilmiştir. PPR1-YFP-NLS Pst_a2sırasında kullanarak başarılı deneylerde-indüklenen ETI, geçici pPR1 aktivasyonu gözlenen, PCD etki alanı (Şekil 3B) çevreleyen hücrelerin çeşitli katmanlarında foci ifade YFP kadar belirgin ⁹. pPR1 genellikle PCD etki alanı çevreleyen hücrelerin aktivasyonu yaklaşık 5 saat sonrası aşılama (HPI), tepeler, yaklaşık 12 HPI, başlar ve 40 HPI (Şekil 3B)⁹sürer. Bir epi-floresan sistemi kullanarak görüntüleri elde beri burada elde YFP sinyalleri yanı sıra üst epidermal mesophyll hücreleri de dahil olmak üzere birkaç adaxial hücre katmanlardan üretildi.

Resim 1 : Bakteriyel pathogen infiltrasyonu için kullanılan yöntemi Arabidopsis thaliana yaprak. (A)iki - için üç hafta çocuk Arabidopsis bitkiler hücre tak tepsisinde yetiştirilen. (B) tek hücreli fiş içeren aşı ve gözlem için kullanılmak üzere seçilen bitki biçilmiş kaftan ve dengeyi korumak için boş hücre tak tepsisine yerleştirilir. (C) Üçüncü, dördüncü ve beşinci bırakır (#3 ve #4 #5, sırasıyla) görüntü analizi için uygundur. Patojen süspansiyon infiltrasyonu (D) needleless kullanarak seçili yaprak içine. İnfiltre alan kalan yaprak daha koyu yeşil rengini temel alan kabul edilebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : İnfiltre montaj için kullanılan yöntemi Arabidopsis yaprak zaman hata görüntüleme için. İnoculated yaprak altında sabit bir cam slayt ile Arabidopsis bitkisinin(a)fotoğraf. İnfiltre yaprak cam slayt merkezinde yerleştirildi. Çift başlı ok plastik bant çubukları uzunluğunu gösterir. (B) plastik bant çubukları ve köprü hazırlanması. Çift Kişilik - katmanlı plastik bant ikiye kesilmiş parçalar (1 ve 2) çubukları için ve başka bir parça (3, kesik kırmızı çizgiyle) bir köprü hazırlamak için kesildi. Çift başlı ok uzunlukları(a)çift başlı ok uzunluğu neredeyse aynıdır. Parçalar 1 ve 2, oklarla gösterilen dört bir yanına birini kes. (C) iki adet plastik bant çift katmanlı (1 ve 2 numaralandırılmış) dikkatle petiole ve yaprak bıçak ile doğrudan temas yapmadan bir çift iyi Cımbız kullanarak petiole boyunca slayt cam üzerine yapıştırılan edildi. (D) (B) hazırlanan (3 numaralı) çift katmanlı plastik bant, ek bir parçası petiole Kaset 1 ve 2 arasında koşabilirdin sağlarken (1 ve 2) petiole üzerinde bir köprü oluşturmak için her iki bazal çubukları üzerinde yerleştirildi pozisyonlar oklarla gösterilir. (E) fotoğraf bantlanmış petiole gösterilen. Bitki doku oklarla gösterilen pozisyonlarda plastik bant parçaları arasında doğrudan yakalamak değil önemlidir. (F) A küçük parça (4 numaralı) cerrahi bant yavaşça etrafında yaprak bıçak ucu cam slayt üzerinde yapıştırılan. Yalnızca kesikli kırmızı çizgi tarafından özetlenen alanı cam slayt sıkıca basılıştan. (G) başka bir küçük parça (5 olarak numaralandırılmış) cerrahi bant hafifçe petiole ve plastik bant parçaları sınırda yapıştırılan. Yalnızca kesikli kırmızı çizgi tarafından özetlenen alanı petiole usulca slayt cam ve plastik bant parçaları tamir ettiğin için basılıştan. (H) iki tek kullanımlık pipet ipuçları komşu yaprakları stereomicroscope görüş alanı taşınmasını engelleme için kullanıldı. Pipet ipuçları doğrudan toprağa uygun pozisyonlarda yerleştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : Temsilcisi sonuçları kullanarak Arabidopsis yöntemi montaj yaprak. (A)floresan stereomicroscopic görüntülerini bir transgenik Arabidopsis yaprak (pPR1-YFP-NLS bitki). Yaprak bir kısmını Pst_a2 ile infiltre (10⁸ CFU/mL) abaxial yüzeyinde ve resimler 22 saat sonrası aşılama (HPI) Yakalanan edildi. PPR1 organizatörü etkinleştirildiği çekirdeği YFP filtresini kullanarak tespit edildi ve programlanmış hücre ölümü (PCD) Texas kırmızı (TXR) filtresini kullanarak klorofil autofluorescence zarar üzerinde göre tespit edildi. Ölçek çubuğu 2.5 mm. (B) = 800 görüntüleri burada açıklanan protokolü kullanılarak elde edilen bir koleksiyonundan seçilen birkaç hızlandırılmış resimleri. Bu veri pPR1 etkinliği için 40 HPI kronolojik zamanmekansal dinamikleri vivo içinde genel bakış sağlar. YFP ve TXR görüntülerin birleştirilmiş resimler gösterilir. Ölçek çubuğu 2.5 mm. (C) sahte infiltrasyonu transgenik yaprak (pPR1-YFP-NLS bitki) =. Sahte infiltrasyon içinde 10 mM MgCl₂ abaxial yan tarafından hızlandırılmış görüntüleme takip yaprağın içine sızmış. Sahte tedavi ektopik pPR1 aktivite neden olmaz ve klorofil autofluorescence 13 HPI yönü ile müdahale değil. Bir ok sahte infiltrasyon konumunu gösterir. Ölçek çubuğu 2.5 mm. = Bu görüntüler bir önceki çalışmada⁹modifiye edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan zaman hata görüntüleme programı.

Tamamlayıcı film 1: kronolojik zamanmekansal dinamikleri gösteren hızlandırılmış film pPR1 harekete geçirmek içinde bir transgenik Arabidopsis aşağıdaki efektör tetiklemeli bağışıklık (ETI) indüklenen yaprak Pst_a2 aşı. pPR1-YFP-NLS yapı taşıyan bir transgenik yaprak abaxial tarafında bir kısmını Pst_a2 ile infiltre (10⁸ CFU/mL). Görüntüleri 40 h olmak üzere toplam 3 dk aralıklarla elde. Gösterilen zaman damgası biçimi dd:hh:mm:ss.sss var. Bu film bir önceki çalışmada⁹güncellenmiştir. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Tartışmalar

Burada, Arabidopsis yaprak bir organizatörü bir Otomatik floresan stereomicroscope kullanarak uzun vadeli gözlem için ilgi kontrol altında bir floresan muhabir gen ifade bir yaşam bağlamak için basit bir yöntem raporu. Floresan bir gazeteci hızlandırılmış görüntüleme kök dokularda sık gerçekleştirilen; Ancak, yalnızca birkaç benzer çalışmalar içinde yaprak doku yapılmıştır. Bunun en olası nedeni yaprakları ise kökleri genellikle gömülü ve solid agar ortamında sabit uzayda, özgürce hareket edebiliyoruz.

Bu raporda, Pst_a2tarafından indüklenen ETI sırasında pPR1 aktivite kronolojik zamanmekansal dinamikleri üzerinde duruldu. Yukarıda ayrıntılı yaprak yumuşak fiksasyonu ek olarak, açıkça organizatörü harekete geçirmek ve PCD gibi hücresel olayların kronolojik zamanmekansal dynamics görselleştirmek önemlidir. PPR1 etkinliği ve PCD gösteren hücreleri arasındaki ayrım keskin değilse, tüm infiltre alanındaki hücreler arası boşlukları tamamen patojen süspansiyon ile dolu emin olun (bkz. Adım 2.4). Bu örnek aynı dikey konumunu boyunca tüm tespit sinyalleri bu mikroskoplar yakalama beri geniş alanlı floresan stereomicroscopes kullanırken önemlidir. Klorofil autofluorescence hayatta kalan hücreleri üstünde veya altında PCD etki alanı hücrelerde kolayca yok autofluorescence sergilenmesi ölü hücreleri gizliyor. Bu da YFP sinyal için doğrudur.

Hızlandırılmış görüntüleme koşulları dikkatle çeşitli deneysel koşullarda birkaç ön deneyler yoluyla kurulmuş gerek. Hızlandırılmış görüntüleme için parametreleri mikroskobik sistem, transgenik bitkiler ve patojenler. gibi çeşitli etkenlere bağlıdır Bu parametreler elde etmek için biz ilk çeşitli pozlama süreleri YFP sinyal şiddeti, neredeyse pPR1ilk harekete geçirmek ile çakışacak 7 HPI infiltre yaprak için analiz edildi. 5 s pozlama bu çalışmada kullanılan stereomicroscope ile YFP sinyal yakalamak için uygun olarak tespit edilmiştir. Benzer bir sınama klorofil autofluorescence görüntüleme için gerçekleştirildi. Örnek ışığa maruz kalma 3 dk aralıklar arasındaki zaman hata görüntüleme programı maksimum çekim hızı ile normal parlak alan görüntülemede olarak programlandı. Sistemimiz (Tablo reçetesi) yanı sıra YFP, TXR ve parlak alan görüntüleme 2.5 min izin verdi. Bu sınırlama 3 dk aralığı seçmek için başlıca nedeni oldu. Ardından, hızlandırılmış bu durum bitki örnekleri belirgin hiçbir zarar ve ektopik hafif stres kaynaklı harekete geçirmek-in pPR1 (Şekil 3B, C) teşvik değil doğruladı. Bu çalışmada kullanılan programı geliştirilmesi olmuştur. Böylece, floresans görüntüleme 3 dk aralıklarla pPR1 dynamics Pst_a2sırasında yakalamak için yeterli kabul edildi-ETI⁹aracılı.

Organizatörü-muhabir yapıları, özellikle NLS için yuvarlak floresan reporter ile birçok gruplar ve araştırma toplumdan kolayca kullanılabilir tarafından kullanılan; Kubo vd tarafından yayımlanan yapı kullanılan ¹³. Eğer uygun transgenik bitkiler elde edilebilir böylece, burada açıklanan protokol yaprak dokuları, inceleyerek herhangi bir bitki biyoloji çalışma odasında kullanılabilir. Bizim basit ve kolay iletişim kuralı kim are içinde meydana gelen herhangi bir biyolojik olay kronolojik zamanmekansal dinamiklerini analiz etmek güçlü araştırmacılar için büyük bir fırsat bırakır, bağışıklık yanıtı gibi sağlar. Teyp parçaları kullanarak bizim Yöntem numuneler üzerinde hafif bir fiziksel stres indükler akla yatkın. Ancak, bu sorun deneyler (Şekil 3C) sahte tedaviler gibi uygun pozitif ve negatif denetimler dahil olmak üzere kontrol edilebilir. Deneysel koşullar daha da değiştirilebilir ve bu denetimlerin farklı koşullar altında analiz ederek en iyi duruma getirilmiş.

Son yıllarda araştırmacılar ilgi biyolojik olayların kronolojik zamanmekansal karmaşık yönleriyle görüntüleme araçları ve teknikleri, hızlı geliştirilmesi teşvik vardır. Herhangi bir görüntüleme analizi, uygun montaj ve tamir örnekleri arasında en önemli sorunlar vardır. Bu çalışmada geliştirilen Arabidopsis bırakır montaj yaşam basit ve çok yönlü yöntemi uygulanan ve çeşitli görüntüleme deneyler için en iyi duruma getirilmiş.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	BD biosciences	214010
Bacto Protease Peptone No. 3	BD biosciences	211693
Bacto Yeast Extract	BD biosciences	212750
BM2 soil	Berger
Glycerol	nacalai tesque	17017-35
Kanamycin sulfate	Wako	113-00343
Leica M205FA with DFC365FX, LED_MCI and Leica EL6000 (Las X software-regulated)	Leica Microsystems		Yellow fluorescent protein (YFP) and Texas Red (TXR) filters installed
Magnesium Chloride Hexahydrate	Wako	135-00165
Micro Slide Glass (Size: 76 mm × 26 mm, Thickness: 1.0–1.2 mm)	MATSUNAMI	S1112
Micropore Surgical Tape (1.25 cm × 9 m)	3M	1530-0
Needleless 1 ml plastic syringe	Terumo	SS-01T
Plastic cell plug tray (cell size: 44 mm  × 44mm × 44 mm)	Tanaka sangyo, Japan	htray-bk72	Any  tray with similar sized cells can be used
Rifampicin	nacalai tesque	30259-81
Plastic Tape (0.2 mm thick × 19 mm wide × 10 m long)	Yamato	No0200-19-1	Any plastic/vinyl tape with  similar thickness can be used