Zararlı Uyaranlar Algılama için Nicel Davranışsal Okuma olarak Planarian Scrunching

Özet

Tatlı su planarians üç yürüyüş sergiler (kayma, peristalsis, ve scrunching) kantitatif davranış analizi ile ayırt edilebilir. Çeşitli zararlı uyaranlar, bunların nicelliği ve peristalsis ve süzülme ayrımı kullanılarak scrunching'i tetikleyen bir yöntem tanımladık. Gen nakavtını kullanarak, kantitatif henotipik okuma olarak scrunching özgüllüğünü gösteririz.

Özet

Tatlı su planarians normalde kendi ventral tarafında siliyer itiş yoluyla sorunsuz kayma. Ancak bazı çevre koşulları kas lara bağlı hareket biçimlerine neden olabilir: peristalsis veya scrunching. Peristalsis bir siliyer defektinden kaynaklanırken, scrunching silia fonksiyonundan bağımsızdır ve ampütasyon, zararlı sıcaklık, aşırı pH ve etanol gibi belirli uyaranlara özgü bir tepkidir. Böylece, bu iki kas odaklı yürüyüş mekanistik farklıdır. Ancak, nitel olarak ayırt etmek zor olabilir. Burada, çeşitli fiziksel ve kimyasal uyaranlar kullanılarak scrunching indükleme için bir protokol sağlar. Serbestçe kullanılabilen bir yazılım kullanarak peristalsis ve kaymadan ayırt etmek için kullanılabilen scrunching'in nicel karakterizasyonunu ayrıntılarıyla anlatıyoruz. Scrunching evrensel bir planarian yürüyüş olduğundan, karakteristik türlere özgü farklılıklar olsa da, bu protokol genel olarak planarians tüm türler için uygulanabilir, uygun hususlar kullanılarak. Bunu göstermek için, davranışsal araştırmalarda kullanılan en popüler iki planertürün yanıtını karşılaştırıyoruz, Dugesia japonica ve Schmidtea mediterranea, aynı fiziksel ve kimyasal uyaranlarla. Ayrıca, scrunching özgüllüğü bu protokolün RNA girişim ve / veya ilgili moleküler hedefler ve nöronal devreleri incelemek için farmakolojik maruz kalma ile birlikte kullanılmasına olanak sağlar, potansiyel nosiception ve nöromüsküler iletişim önemli yönleri ne mekanik anlayış sağlayan.

Giriş

Kök hücre ve rejenerasyon araştırma^1,2,,3, tatlı su planarians için popülerlik ek olarak uzun davranış çalışmaları kullanılmıştır^4,5, onların nispeten büyük boyutu yararlanarak (uzunluğu birkaç milimetre), kolay ve laboratuvar bakım düşük maliyet, ve gözlemlenebilir davranışların geniş spektrumlu. Bilgisayarlı görme ve planer davranış çalışmaları^{6,7,8,,9,10,11} için otomatik izleme giriş davranış lı fenotiplerin nicel farklılaşmasını sağlamıştır. Hayvan davranışları nöronal fonksiyonun doğrudan okunmasıdır. Planer sinir sistemi orta boy ve karmaşıklık ta olduğu için, ancak omurgalı beyin^12,13,,14ile korunmuş anahtar elementleri paylaştığı için, planer davranışların incelenmesi, daha karmaşık organizmalarda doğrudan araştırmak zor olabilecek nöronal eylemin korunmuş mekanizmalarına ışık verebilir. Böylece, planarians karşılaştırmalı nörobiyoloji çalışmaları için değerli bir model^{8,12,15,16,17,18,19,20,21}. Buna ek olarak, su ortamında kimyasallara hızlı ve kolay maruz kalma için rejenerasyon ve yetişkin planarians beyin fonksiyonu üzerindeki etkilerini incelemek için izin verir, onları nörotoksikoloji için popüler bir sistem yapma^{22,23,24,25,26}.

Planarianlar kayma, peristalsis ve scrunching olarak adlandırılan üç farklı yürüyüş, sahip. Her yürüyüş belirli koşullar altında sergilenir: kayma varsayılan yürüyüş, peristalsis siliary fonksiyonu tehlikeye oluşur^7,27, ve scrunching bir kaçış yürüyüşü - cilia fonksiyonu bağımsız – bazı zararlı uyaranlara yanıt olarak⁷. Biz scrunching belirli bir yanıt olduğunu göstermiştir, bazı kimyasal veya fiziksel ipuçları hissi tarafından ortaya, aşırı sıcaklıklar veya pH dahil, mekanik yaralanma, ya da belirli kimyasal indükleyiciler, ve böylece genel bir stres tepkisi⁷değildir^,28,29.

Özgüllüğü ve basmakalıp parametreleri nedeniyle, kolayca bu protokol kullanılarak ölçülebilir, scrunching araştırmacılar duyusal yollar ve davranış nöronal kontrol diseksiyon mekanistik çalışmalar gerçekleştirmek için olanak sağlayan güçlü bir davranışsal fenotip^25,28. Ayrıca, scrunching sinir sistemi gelişimi ve nörotoksikoloji çalışmalarında fonksiyon üzerinde olumsuz kimyasal etkileri tsay hassas bir bitiş noktası olduğu gösterilmiştir^22,24,25,30. Birkaç farklı duyusal yollar çeşitli mekanizmalar²⁸ile scrunching ikna etmek için yakınsama gibi görünüyor gibi, çeşitli çünkü scrunching diğer planer davranışlardan farklıdır, ama özel, uyaranlar farklı nöronal devreleri incelemek ve farklı sinyaller inscrunching fenotip üretmek için entegre nasıl çalışma için kullanılabilir.

Daha da önemlisi, tür farklılıkları vardır, oysa bir kimyasal bir planarian türde scrunching ortaya çıkabilir, ama başka bir farklı bir davranışsal tepki. Örneğin, biz anandamid planarian türler Dugesia japonica scrunching neden olduğunu bulduk ama Schmidtea mediterranea²⁸peristalsis neden olur . Bu örnek, farklı moleküler mekanizmaların henotibik tezahürleri olduğundan, farklı yürüyüş leri güvenilir bir şekilde ayırt edebilmenin önemini vurgulamaktadır. Ancak, peristalsis scrunching ayrım nitel gözlemsel veri kullanarak zordur, her iki gait kas odaklı ve paylaşmak nitel benzerlikler^7,,28çünkü . Bu nedenle, yürüyüş ayırt etmek için bu cilia görüntüleme veya karakteristik parametreler7 dayalı ayrım sağlayan bir nicel davranışsal çalışma yapmak için gereklidir^7,28. Çünkü cilia görüntüleme deneysel zorlu ve yüksek büyütme bileşik mikroskop ve yüksek hızlı^kamera7 gibi özel ekipman gerektirir 7^,28, bu nicel davranış analizi gibi araştırmacılar için geniş erişilebilir değildir.

Burada, (1) çeşitli fiziksel (zararlı sıcaklık, ampütasyon, yakın UV ışığı) ve kimyasal (allyl izothiocyanat (AITC), cinnamaldehit) uyaranları ve (2) serbestçe kullanılabilir yazılım kullanarak planarian davranışın kantitatif analizi kullanılarak scrunching indüksiyon uğrama için bir protokol satıyoruz. Dört parametre (vücut uzunluğu salınımları sıklığı, göreli hız, maksimum genlik ve vücut uzama ve daralma asimetrisi) ölçerek⁷, scrunching kayma ayırt edilebilir, peristalsis, ve diğer davranışdurumları literatürde bildirilen, yılan gibi hareket¹⁵ veya epilepsi esme¹⁵gibi . Ayrıca, scrunching farklı planarian türler arasında korunur iken⁷, Her türün kendi karakteristik frekans ve hız vardır; bu nedenle, bir türün kayma ve scrunching hızları belirlendikten sonra, hız tek başına kayma ve peristalsis²⁹scrunching ayırt etmek için bir araç olarak kullanılabilir. Protokol, hesaplamalı görüntü analizi veya davranış salg›r›mlar›nda önceden bir eðitim bulunmad›r ve bu nedenle lisans düzeyinde bir öğretim laboratuvar›nda planer davranış deneyleri için de uygulanabilir. Protokol adaptasyonuna yardımcı olmak için örnek veriler Ek Malzeme'de verilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Nicel planer davranış tahlilleri

1. Deneysel kurulum
   1. Düz bir yüzeye soluk led panel yerleştirin. LED paneli iki amaca hizmet eder: (1) düzgün beyaz arka plan sağlamak ve (2) uygun kontrast elde etmek için ayarlanabilir bir ışık kaynağı olarak kullanılmak üzere. LED panelüzerine 100 mm Petri çanak arena yerleştirin.
      NOT: İş bilgililiği artırmak için, çok kuyulu bir plaka arena^23,24olarak kullanılabilir, ancak daha büyük arenalar otomatik görüntü analizini kolaylaştırır.
   2. Arenanın üzerindeki bir halka standına kamera monte edin (Şekil 1A). Kamera konumunu, yüksekliğini ve odağı gerektiği gibi ayarlayın, böylece tüm arena görüş alanı içinde ortalanır ve odaktadır(Şekil 1B).
      NOT: Kamera çözünürlüğü, bir planacıyı LED panel tarafından sağlanan homojen arka plandan açıkça ayırt edecek kadar yüksek olmalıdır.
   3. Arenayı uygun pozlama ortamıyla (planarian su veya kimyasal çözelti) maksimum yarı hacimle doldurun (buna banyo denir). Bu, 100 mm petri kabı için yaklaşık 25 mL'ye karşılık gelir. LED paneli açın ve kayıt kalitesini olumsuz etkileyebilecek diğer ışık kaynaklarını kapatın (örneğin, arenaya bir parlama sağlayan yakındaki ışık kaynakları).
      DİkKAT: Tam kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyerek ve gerekirse deneysel kurulumu bir duman kaputuna taşıyarak tehlikeli kimyasal çözümleri uygun şekilde yönetin. Atık ların bertarafı ile ilgili federal ve eyalet yönetmeliklerine uyun.
   4. Bir transfer pipeti kullanarak arenanın merkezine doğru bir planarian bırakın. Kaydetmeye başla. Verileri yerel Fiji³¹ biçiminde görüntü dizileri olarak kaydedin (TIFF, GIF, JPEG, PNG, DICOM, BMP, PGM veya FITS; bkz. görüntü analizi bölümü 1.2).
      NOT: Davranışlar ve dış uyaranlara karşı duyarlılık bireysel plancılar arasında farklılık gösterdiğinden, teknik çoğaltmaların yanı sıra yeterli sayıda biyolojik çoğaltma hakkında veri toplamak da önemlidir. Aynı anda 100 mm Petri kabında 10'a kadar orta boy (4-7 mm) planarian ile çalıştık. Zaman verimli iken, Petri çanak aynı anda birden fazla planarians planarians yolları kesişebilir beri veri analizi daha zor hale getirir.
      1. Süzülme denemeleri için saniyede en az 1 kare (FPS) kullanarak kaydedin. Scrunching/peristalsis deneyleri için, planarian türlerin scrunching/peristalsis frekansının en az iki katı olan bir FPS kullanarak kayıt edin. Planer türlerin inmeden scrunching/peristalsis frekansı varsa, başlangıç noktası olarak 10 FPS kullanın ve uygun olduğunca artış/azalış.
      2. Kimyasal bir solüsyon kullanırken, kimyasal çözeltinin konsantrasyonunun önemli ölçüde değişmemesi için planarian suyu mümkün olduğunca az damla kullanarak planarian'ı aktarın.
   5. Süzülme deneyleri için, 1-2 dakikalık kayma davranışı kaydedin. Scrunching/peristalsis deneyleri için, düz bir çizgide meydana gelen en az 3 ardışık salınımı yakalayacak kadar uzun bir kayıt. Deneme tamamlandıktan sonra kaydı sonlandırın.
      NOT: Scrunching/peristalsis deneyleri için, bir planer, çoğaltmalar arasında tutarlı olması gereken ve uyarıcıya dayalı ampirik olarak belirlenen belirli bir süre içinde sonlandırma kriterini karşılamazsa, kaydı sonlandırın ve başka bir planlayıcıyı test edin.
      1. Eğer planarian sonlandırma kriterini karşılamadan arenanın sınırına ulaşırsa, planarian'ı arenanın merkezine geri getirin.
         NOT: Bu davranışını değiştirebileceğinden, bir bireyin kayıt için tekrarlanan pipetlemelerinden kaçının.
   6. Planarian(lar)ı arenadan çıkarın ve planarian suyu veya kimyasal çözeltiyi uygun atık kaplarına atın. Planarian su vardı planarians ev konteyner iade edilebilir.
      NOT: Farklı ortamlar için farklı arenalar kullanarak çapraz kontaminasyondan kaçının (örneğin, planer su deneylerinde kayma daha önce kimyasal maruzkalma ile scrunching/peristalsis deneyleri için kullanılan bir alanda çalıştırılmamalıdır).
      1. Kimyasal çözeltiye maruz kalan planarianları seri olarak durulayın, 3 temiz 100 mm Petri kabında 25 mL planer su ile doldurularak herhangi bir kimyasalı iyice seyreltin. Scrunching veya peristalsis indüklenen ise, ayrı bir konteyner bu planarians yerleştirin. Çoğu hücre o^zamanakadar teslim olurdu beri Planarians bir ay sonra kendi konteyner iade edilebilir 1 .
         NOT: Aynı planer popülasyonu için birden fazla farklı deney gerekiyorsa, örneğin, bir RNAi popülasyonu için planerlerin bir sonraki denemeyi çalıştırmadan önce 24 saat boyunca kurtarmalarına izin verin. En az invaziv deneyin ilk ve en invaziv deney (örneğin, ampütasyon) en son çalıştırılır gibi deneyler sipariş edin.
      2. Aynı arenada birden fazla deney yapıyorsanız, düzgün banyo çözeltisi atın ve çalışır arasında bir kağıt havlu ile arena silerek herhangi bir mukus izleri kaldırın.
         NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
2. Planer davranışın nicel analizi
   1. Bölüm 1.1'de açıklandığı gibi planer davranış tahlillerini gerçekleştirin.
   2. Fiji'deki bir denemeiçin ham görüntü sırasını açın(Dosya > İçe Aktar > Görüntü Sırası)ve görüntü dizisindeki ilk görüntüyü seçin. Sıra Seçenekleri penceresinde, "Adları sayısal olarak sırala" kutusunu işaretleyin ve "Tamam"ı tıklatın. Görüntü sırası yüklendikten sonra, görüntü sırasını 8-bit 'e(Resim > Yazın > 8-bit)dönüştürün ve görüntü dizisini izlemek veya kaydırmak için görüntü yığınının altındaki ok aracını veya kaydırıcıyı kullanın.
      NOT: Kayma denemeleri için, planer kayıt boyunca açıkça görülebildiği sürece tüm veriler kullanılabilir. Ancak, genellikle aşağıda açıklandığı gibi ilgili parça (lar) ayıklayarak arenanın merkezinde serbest hareket analiz etmek yeterlidir.
   3. Bir zaman dilimini ve ilgi bölgesini ayıklamak için, dikdörtgen aracını kullanarak planacının tam yolunu kapsayan bir ilgi bölgesi çizin(Şekil 2A, 2B). Resim yığınına sağ tıklayın ve Yinelenen...'u seçin, Yinelenen yığıniçin kutuyu işaretleyin, ilgi sırasının ilk ve son karelerini girin ve Tamam'ıtıklatın. Birden fazla planarians aynı anda görüntülenmiş olsaydı, arenada planerler gibi çok sayıda açık görüntü yığınları var, böylece arenada her planarian için bu bölge seçimi ve çoğaltma adımı tekrarlayın. Aşağıdaki adımlar (Adımlar 1.2.4-1.2.10) her görüntü yığınıüzerinde teker teker gerçekleştirilmelidir.
      1. Süzülme deneyleri için, planörün vücut uzunluğunun en az iki katı hareket ettiği bir kayma dönemi ayıklayın.
         NOT: Planarian başına ne kadar çok süzülen veri ayıklanırsa, veriler o kadar güvenilir olur. Planarian kayma analizi için düz bir çizgide hareket olması gerekmez.
      2. Scrunching/peristalsis deneyleri için, planerin en az üç ardışık (ideal olarak daha fazla) vücut salınımı geçirdiği bir örneği düz bir çizgide ayıklayarak, her salınımın tam bir uzama-daralma döngüsü olduğundan emin olun, çünkü frekansı doğru bir şekilde belirlemek için tam salınımlar gereklidir.
         NOT: Ne kadar çok salınım elde edilebilirse, veriler o kadar güvenilir olacaktır. Planlayıcının döndüğü sıraları kullanmayın, çünkü bunlar yanlış uzunluk ölçümlerine neden olacaktır.
   4. Görüntüyü binarize etmek ve planacıyı arka plandan ayıklamak için yinelenen görüntü yığınına(Resim > Ayarla > Eşik)bir eşik uygulayın. Tüm planarian kırmızı vurgulanır gibi gerektiği gibi sürgülü çubukları ayarlayın. Tam değerler görüntüleme kalitesine bağlıdır. Koyu arka planiçin kutuları bırakın , Yığın histogram, ve aralık işaretsiz sıfırlamayın. İyi bir eşik aralığı sağlamak için görüntü yığınında ilerleyin (örneğin, planer yığın boyunca arka plandan iyi ayrılmıştır) ve sonra Uygula'yıtıklatın.
   5. Yığın'ı İkili pencereye dönüştür penceresinde, Yöntem'i Varsayılan, Arka Planı Daışığaayarlayın. Bu penceredeki tüm kutuların işaretlerini kaldırın ve ardından Tamam'ıtıklatın. Beyaz arka plan üzerinde siyah bir planarian gösteren binarized görüntü görünür(Şekil 2C). Görüntü dizisinin tüm karelerinde tüm planacının görünür olduğundan emin olun.
      NOT: Planarian daha küçük veya daha büyük binarized görüntü dizisinde istenmeyen nesneler bir boyut filtresi(Şekil 2Ciii)kullanılarak sonraki analizde filtre olabilir.
   6. Analiz et > ÖlçümleriAyarla'yı tıklatarak ölçümleri ayarlayın. Alan, Kütle Merkezi, Yığın konumuve Fit elips için kutuları işaretleyin ve Tamam'ıtıklatın.
      NOT: Bu parametrelerin Fiji oturumu başına yalnızca bir kez ayarlanmalıdır.
   7. Açık görüntü yığınını seçin ve Analiz et > Parçacıkları Analiz Et'iseçin.
   8. Parçacıkları Çözümle penceresinde, seçilen parametrelerle algılanan tüm nesneleri gösteren yeni bir yığın açmak için Göster > Maskeler'i seçin. Bu, yalnızca planarian ölçümlerinin alınıp alındığını görsel olarak kontrol etmek için kullanılabilir. Bu adımda, planarian'ın yaklaşık alanını (piksel² birimlerinde) sağlanan alana girerek istenmeyen gürültüyü gidermek için bir boyut filtresi ayarlanabilir. Görüntü sonuçları ve Netle sonuçları için kutuları işaretleyin ve Tamam'ıtıklatın. Clear results
      NOT: Sonuçlar penceresinde, dizin (ilk sütun) tüm satırlar için dilim numarasına eşit değilse, bu çok fazla veya çok az nesnenin izlenmiş olduğu anlamına gelir. Bu tutarsızlık için bir olasılık planarian dışında diğer nesnelerin varlığı veya planarian belirli çerçevelerde izlenmedi.
   9. Panelin altındaki kaydırıcıyı kullanarak maske görüntü yığınını kaydırın. Herhangi bir gürültü varsa veya planarian olmayan çerçeveler varsa, Sonuçlar penceresini ve maske görüntü yığınını kapatın. Alan filtresini yalnızca planarian dışındaki nesneleri kaldıracak şekilde ayarlayarak 1.2.7-1.2.8 adımlarını yineleyin.
      NOT: Planlayıcı maskedeki çerçeveden eksikse, bu alan filtresinin alt sınırının çok yüksek ayarlandığını gösterir.
   10. Sonuçlar penceresinde, Dosya>Farklı Kaydet'ikullanarak verileri kaydedin. Verileri virgülden ayrılmış değerler olarak kaydetmek için dosya adına .csv uzantısını ekleyin. Görüntü yığınına ait veriler kaydedildikten sonra, ilgili görüntü yığınını ve Sonuçlar ve Maske pencerelerini kapatın.
   11. Veri alma ve daha fazla herhangi bir elektronik tablo yazılımı veya freeware kullanarak analiz. Kayma hızını hesaplamak için bölüm 1.3'e bakın. Scrunching/peristalsis tam parametre kümesini hesaplamak için bölüm 1.4'e bakın.
       NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
   12. Pikselin gerçek uzunluk dönüşümünün belirlenmesi için, Fiji'de referans uzunluğuyla (örn. arenanın çapı) bir görüntü açın. Çizgi aracını seçin ve bilinen uzunluğun üzerine bir çizgi çizin.
   13. Piksel birimlerini Analiz et > Ölçek Ayarla'yıtıklatarak standart uzunluk birimine dönüştürün. Bilinen mesafe kutusunda ki görüntüye çizilen çizgiye karşılık gelen uzunluğu girin ve uzunluk birimini pikselden seçilen standart uzunluk birimine değiştirin. Dönüştürme faktörü Ölçek'inyanına yazılır.
       NOT: 1.3 ve 1.4 bölümlerindeki süzülme veya scrunching/peristalsis analizleri için piksel dönüştürme değeri gerekmez.
3. Kayma hızının hesaplanması
   1. Bölüm 1.2'de kaydedilen veri dosyasını kullanarak, kütle (COM) x ve y koordinatlarının merkezini ve ana eksen verilerini yükleyin. Veriler virgülle ayrılmış değerler dosyası olarak kaydedilirse, bu listeler sırasıyla "XM", "YM" ve "Major" sütunlarına karşılık gelir.
   2. "XM" ve "YM" veri sütunlarını kullanarak, her kare için bir sonraki kare için planer kütle merkezinin (d) yer değiştirmesini hesaplayın. Deplasman (d) tarafından verilir:
      
      x₁ ve y_1'in bir karenin COM koordinatlarına (XM, YM) ve x₂ ve y_2'nin sonraki çerçevenin COM koordinatlarına (XM, YM) atıfta bulunduğu durumlarda.
   3. Planarian gövde uzunluğunu "Büyük" sütunun yüzde^95'i olarak ayarlayın. Plancılar bir duvar tercihi davranışı sergileyen bu yana³², Bu hesaplanan planarian vücut uzunluğu planarian²⁴uzamış olduğunda temsilcisi olmasını sağlar.
   4. Kare başına piksel yer değiştirmelerini planer gövde uzunluğuna (l)bölerek planer gövde uzunluğuna göre yer değiştirmeleri normalleştirin. Normalleştirilmiş yer değiştirme (d_n) tarafından verilir:
      
   5. Normalleştirilmiş yer değiştirmeleri kare başına geçen süreye (kaydedilen FPS'nin tersi) bölerek normalleştirilmiş hızların bir listesini oluşturun. Normalleştirilmiş kayma hızı (s_n) tarafından verilir:
      
   6. Normalleştirilmiş hızlar listesinin ortalamasını (s_n)alarak planerin normalleştirilmiş kayma hızını hesaplayın. Standart sapma planarian için bir belirsizlik ölçümü olarak kullanılabilir.
   7. Her planarian analiz edilecek için 1.3.1-1.3.6 adımları tekrarlayın. Ortalama ve planarian nüfus için sırasıyla, süzülen hız ve ilişkili belirsizlik almak için tüm planerler için kayma hızlarının standart sapma almak.
4. Tam parametre kümesini kullanarak scrunching ve peristalsis gaits ayrımı
   1. Bölüm 1.2'den kaydedilen veri dosyasından ana eksen veri listesini yükleyin. Veriler virgülle ayrılmış değerler dosyası olarak kaydedilirse, bu büyük sütuna karşılık gelir.
   2. Büyük sütundaki her veri noktasını 0ile başlayan bir liste oluşturun. Kaydedilen FPS'ye bölerek bu listeyi kare başına geçen süreye dönüştürün.
   3. Bir scrunching/peristalsis salınım çizimi oluşturmak için geçen zamana göre Ana sütun verilerini çizin (Şekil 3A). Salınım çizimini kullanarak, verileri en az üç ardışık, düz çizgili salınıma göre kırpın(Şekil 3Bi). Verileri yerel zirvelerde (maksimum salınım uzaması) veya çukurlarda (minimum salınım uzaması) başlayıp bitecek şekilde kırpın.
      NOT: Lokal ekstremalar yaklaşık olarak eşit değilse (tepe/çukurlar yüksekliklerde önemli ölçüde farklılık gösterir), bu salınımların düz çizgili olmadığını gösterir(Şekil 3Bii). En az üç ardışık, düz çizgili salınımlar başka bir dizi ayıklayın. Bölüm 1.2'ye bakın.
   4. Zamana göre kesilmiş Ana verileri yeniden çizerek, faizin salınım sırasının ayıklandığını ve düzgün bir şekilde kırpıldığını doğrulayın. Sonraki tüm hesaplamalar için bu kesilmiş veri listesini kullanın.
   5. Salınım frekansını hesaplamak için (ν_m), kesilmiş ana eksen veri listesindeki (N)toplam veri noktası sayısına salınım sayısını (O_n) bölün. Saniyede salınımlarda frekans elde etmek için FPS'yi bu değerle çarpın.
      
   6. Maksimum uzamayı hesaplamak için (|Δε| _max), mutlak minimum gövde uzunluğunu (l_dk) mutlak maksimum gövde uzunluğundan (l_max)çıkarın. Mutlak maksimum vücut uzunluğuna bölünerek uzatılmış vücut uzunluğuna normalleştirin.
      
   7. Vücut uzunluğu başına hızı hesaplamak için(v^*_m),hesaplanan maksimum uzamayı salınım frekansı ile çarpın.
      
      NOT: Hız tek başına scrunching ve peristalsis gaits⁷ayırt etmek için kullanılabilir.
   8. Uzama (f_uzaması)harcanan sürenin bir kısmını hesaplamak için, zamana göre kesilmiş ana eksen veri listesinin türevlerini alın. Pozitif veri noktalarının sayısını (örneğin, türev >0 (n_p)olduğunda, ana eksen veri listesindeki toplam veri noktası sayısına(n_t)) bölün.
      
      NOT: Scrunching planarians peristalsis gerçekleştiren planerler süre harcanan zaman asimetrik bir kısmını sergilerken, peristalsis gerçekleştiren planerler uzama ve sözleşme eşit miktarda harcamak⁷.
   9. Her planarian analiz edilecek için 1.4.1-1.4.8 adımları tekrarlayın. Her parametrenin ortalama ve standart sapması alarak belirlenen planer bir popülasyon parametresini hesaplayın.
      NOT: Parametre kümesi, salınım davranışının scrunching, peristalsis veya periyodik vücut şekli değişiklikleri ile başka bir hareket biçimi olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Hem scrunching ve peristalsis belirli bir tür için sabit parametreler var⁷, scrunching parametreleri genellikle peristalsis parametreleri daha büyük olan⁷. Parametrelerden birinin türe özgü aralığın dışına düşmesi mümkün olsa da, daha önce kimyasal indüksiyon²⁸ile gözlemlediğimiz gibi, gözlenen davranış, peristalsis veya scrunching olarak kategorize edilecek 4 yayınlanmış parametreden en az 3'ünü kabul etmelidir.

2. Scrunching indüksiyon

1. Fiziksel uyaranlar (zararlı sıcaklık, UV ışığı, ampütasyon)
   1. Tüm fiziksel uyaran deneyleri için, deneysel kurulum için Bölüm 1.1'e bakın.
      NOT: Bir pipet ve/veya jilet manevrası için daha fazla açık alan sağlamak için fiziksel uyaran deneyleri için 100 mm Petri kabı gibi büyük bir arena kullanmak en iyisidir.
   2. Zararlı sıcaklıkta scrunching indüklemek için, bir cam kabında ısı planarian su (test edilecek planarian başına en az 100 μL) için 65 ° C bir sıcak plaka üzerinde.
      1. Arenanın ortasına bir planarian yerleştirin. Planarian kendini dik yönlendirir ve kayma yada kadar bekleyin. Kaydetmeye başla.
      2. P-200 pipet kullanarak, yavaş yavaş pipet 100 ° L 65 ° C planarian su post-faringal üzerine planarian kuyruk ucu üzerine scrunching neden.
         NOT: Isıtmalı planer suyun 65°C'de kaldığından emin olun. Gerekirse, başka bir deneye başlamadan önce suyu 65°C'ye ısıtın. Basınç da scrunching neden olabilir bu yana, yavaş pipetleme gereklidir. Oda sıcaklığındaki suyu deneyde olduğu gibi pipetleme bir kontrol ve uygulama seçeneği olarak hizmet verebilir.
      3. Scrunching sona erdiğinde kaydı durdurun. Bir kurtarma kabına planarian yerleştirin ve daha fazla deney çalışan eğer taze, oda sıcaklığında planarian su ile petri kabında medya değişimi.
   3. Ampütasyon yoluyla scrunching ikna etmek için, arenanın merkezine bir planarian transfer ve planarian kendini dik yönlendirir ve kayma başlar kadar bekleyin. Kaydetmeye başla.
      1. Planarian'ı temiz bir jilet kullanarak amputate edin. Kesme konumu deneyler arasında tutarlı olduğu sürece, kesme yeri planarian boyunca herhangi bir yerde verilebilir.
         NOT: Scrunching parametreleri ön parçadan çıkarılır. Böylece, arka uçtan yaklaşarak kesme uygularken planarian bu bölümü kameranın görünümünü engellemekaçının. Plastik kapak fişleri de kesme için iyi çalışır ve özellikle bir öğretim ortamında, daha güvenli bir seçenektir.
      2. Ön parça scrunching durdu ktan sonra kaydı durdurun. Her iki parçayı çıkarın, ayrı bir kapta yerleştirin ve 7 gün boyunca yeniden izin verin. Amputated planarians bir kez rejenere ev konteyner içine yeniden dahil edilebilir.
   4. Yakın UV ışığı kullanarak scrunching ikna etmek için, kamera tarafından toplanan yansıyan yakın UV ışık miktarını azaltmak için kamera lensine uygun filtreler (örneğin, Roscolux filtreler) takın ve planacı nın tepkisini görüntüleme engelleyebilir. Bunun yerine aşağıdan arena aydınlatmak için LED paneli kullanarak, planerler duyarsız olduğu ortam kırmızı aydınlatma kullanın³³.
      1. 100 mm'lik Petri çanak arenayı planarian suyla doldurun ve arenanın ortasına tek bir planarian (5-9 mm) yerleştirin. 10 FPS'de kayda başlayın.
      2. Arenadan yaklaşık 30 cm uzaklıkta sınıf II UV lazer işaretçisi (405 ± 10 nm, çıkış gücü <5 mW) tutun. Lazer işaretçisini planlayıcıdan 45° açıyla yerleştirin ve ardından lazer işaretçisini farinksin arka ucu ile kuyruk ucu arasında 5-10 saniye boyunca parlatarak scrunching'i tetikleyin.
         NOT: Lazer işaretçisinin gücü uv ışınlarına duyarlı bir güç ölçer kullanılarak ölçülebilir.
      3. Reaksiyonun tekrarlanabilirliğini test etmek için aynı kişi üzerinde iki uyarım daha denemeden önce planerin tekrar kaymaya başlamasını bekleyin. Planacı da aynı davranışı göstermeye devam ederse, kaydı durdurun ve planarian'ı konteynerine geri koyun. Davranış uyarımlar arasında değişirse, ek testler hangi yanıtın en belirgin olduğunu gösterir.
         NOT: Planerler yakın UV ışığına duyarsızlaşabilir ve tepkivermeyi durdururlar. Ardışık stimülasyonlar 8-10 saniye dinlenme süresi gerektirir.
2. Kimyasal uyarıcı (AITC)
   1. TrPA1 agonist AITC^28,planarians ideal kimyasal bir banyo batırılmış bir kimyasal kullanarak scrunching ikna etmek için. Gerekirse bölüm 2.1.2.3'te açıklandığı şekilde pipetleme uygulanabilir.
      DİkKAT: AITC yanıcı, akut toksik, cilt ve göz tahrişine, solunum ve cilt hassasiyetine neden olabilir ve sucul yaşam için tehlikelidir. AITC yağı bir duman başlık ele alınmalıdır. AITC'nin stok çözümlerini yapmadan önce, uygun PPE(nitril eldivenve laboratuvar önlüğü) takın ve uygun katı ve sıvı tehlikeli atık bertaraf kapları ayarlayın.
   2. Bir duman kaputunda, 50 mL'lik bir santrifüj tüpte planer suda 10 mM'lik bir ait stok çözeltisi yapın. Bu stok çözümü, 4°C'de depolandığında bir aya kadar kullanılabilir.
      1. Bu stoktan, 50 mL'lik bir santrifüj tüpte planer suda 100 μM AITC'lik 25 mL çalışma çözeltisi hazırlayın. Bu 100 μM AITC çözeltisi plancılarda çıtırtıyı tetiklemek için kullanılacaktır.
         NOT: 100 μM AITC D. japonica ve S. mediterranea planarians²⁸tutarlı scrunching neden olur. Diğer su planlayıcıları için, 100 μM başlangıç konsantrasyonu olarak hizmet verebilir ve buna göre ayarlanabilir.
      2. Deneysel kurulumu ayarlayın (Bölüm 1.1'e bakın). Arenayı AITC çalışma çözümüyle doldurun ve ikincil bir konteynere yerleştirin. İkincil konteyner arenanın en az iki katı hacimde olmalıdır.
         NOT: Ekstra güvenlik için bir duman başlığı içinde deneyler yapılabilir.
      3. 10 planarians kadar arenanın merkezine transfer ve kayıt başlar.
      4. Plancılar duyarsızlaştıktan ve çıtırtıyı bıraktıktan sonra, kayıt yapmayı bırakın. Planlayıcıları AITC çözümünden çıkarın ve durulayın (Bölüm 1.1'e bakın). Katı ve sıvı AITC atıklarını uygun atık kaplarında atın.
      5. Standart protokolleri izleyerek RNAi'yi TRPA1^28'e kullanarak AITC'ye verilen yanıtın özgüllüğünü doğrulayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

S. mediterranea planarians ekstraoküler yakın UV algısı TRPA1 bağımlı ve H₂O₂ serbest¹⁷bağlantılı olduğu önerilmiştir. H₂O₂ maruziyeti S. mediterranea ve D. japonica planarians²⁸TRPA1 bağımlı scrunching neden olduğundan, Bölüm 2.1.4 adımları yakın UV ışık maruziyeti her iki türde de scrunching neden olup olmadığını test etmek için kullanılabilir. D. japonica plana...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokolü kullanarak, bir nicel fiziksel ve kimyasal uyaranların etkilerini inceleyebilirsiniz^7,28,29 veya genetik manipülasyon (RNAi)^28,29 planarian hareket üzerinde. Mekansal çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak için kamerayı arenaya mümkün olduğunca yakın hareket ettirirken tüm arenanın görüş alanında olmasını sağlamak en iyisidir. İş ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allyl isothiocyanate, 95% (AITC)	Sigma-Aldrich	377430-5G	CAUTION:  Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE.
Camera lens, 2/3 25mm F/1.4	Tamron	23FM25SP
Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated	Genesee Scientific	25-105
Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile	MedSupply Partners	62-1019-2
Cinnamaldehyde, >95%	Sigma-Aldrich	W228613-100G-K
Dimmable A4 LED Tracer Light Box	Amazon	B07HD631RP
Flea3 USB3 camera	FLIR	FL3-U3-13E4M
Heat resistant gloves	Fisher Scientific	11-394-298
Hot plate	Fisher Scientific	HP88854200
Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water	Instant Ocean	SS15-10	Prepare in deionized water at 0.5 g/L.
Montjüic salts, prepared in Milli-Q water	Sigma-Aldrich	various	Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl.
Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene	Simport	D210-7
Pipette, 20-200 μL range	Rainin	17008652
PYREX 150 mL beaker	Sigma-Aldrich	CLS1000150
Razor blade, 0.22 mm	VWR	55411-050
Roscolux color filter:  Golden Amber	Rosco	R21	Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together.
Roscolux color filter:  Medium Red	Rosco	R27
Roscolux color filter:  Storaro Red	Rosco	R2001
Samco transfer pipette, 62 µL large aperture	Thermo Fisher	691TS
Support stand	Fisher Scientific	12-947-976
Thermometer	VWR	89095-600
UV laser pointer	Amazon	B082DGS86R	This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW.