Scrunching planaire comme une lecture comportementale quantitative pour la détection de stimuli nocifs

Résumé

Les planaires d’eau douce présentent trois démarches (glisse, péristalse et scrunching) qui se distinguent par l’analyse comportementale quantitative. Nous décrivons une méthode pour induire le scrunching utilisant divers stimuli nocifs, quantification de celui-ci, et la distinction du péristaltisme et de la glisse. En utilisant le knockdown de gène, nous démontrons la spécificité du scrunching comme lecture phénotypique quantitative.

Résumé

Les planaires d’eau douce glissent normalement en douceur à travers la propulsion ciliaire sur leur côté ventral. Certaines conditions environnementales, cependant, peuvent induire des formes de locomotion axées sur la musculature : péristalse ou scrunching. Tandis que le péristaltisme résulte d’un défaut ciliaire, le scrunching est indépendant de la fonction de cils et est une réponse spécifique à certains stimuli, y compris l’amputation, la température nocive, le pH extrême, et l’éthanol. Ainsi, ces deux démarches musculature-conduites sont mécanistement distinctes. Cependant, ils peuvent être difficiles à distinguer qualitativement. Ici, nous fournissons un protocole pour induire scrunching en utilisant divers stimuli physiques et chimiques. Nous détaillons la caractérisation quantitative du scrunching, qui peut être utilisé pour le distinguer du péristaltisme et du glissement, en utilisant des logiciels librement disponibles. Étant donné que le scrunching est une démarche planaire universelle, bien qu’avec des différences spécifiques aux espèces caractéristiques, ce protocole peut être largement appliqué à toutes les espèces de planaires, lorsqu’il s’agit de prendre des considérations appropriées. Pour le démontrer, nous comparons la réponse des deux espèces planaires les plus populaires utilisées dans la recherche comportementale, Dugesia japonica et Schmidtea mediterranea, au même ensemble de stimuli physiques et chimiques. En outre, la spécificité du scrunching permet à ce protocole d’être utilisé en conjonction avec l’interférence de l’ARN et /ou l’exposition pharmacologique pour disséquer les cibles moléculaires et les circuits neuronaux impliqués, fournissant potentiellement un aperçu mécaniste dans les aspects importants de la nociception et de la communication neuromusculaire.

Introduction

En plus de leur popularité pour les cellules souches et la recherche de régénération^1,2,3, planaires d’eau douce ont longtemps été utilisés dans les études comportementales^4,5, en profitant de leur taille relativement grande (quelques millimètres de longueur), la facilité et le faible coût de l’entretien de laboratoire, et un large spectre de comportements observables. L’introduction de la vision par ordinateur et du suivi automatisé aux études de comportement planaire^{6,7,8,9,10,11} ont permis la différenciation quantitative des phénotypes comportementaux. Le comportement animal est une lecture directe de la fonction neuronale. Parce que le système nerveux planaire est de taille moyenne et la complexité, mais partage les éléments clés conservés avec le cerveau vertébré^12,13,14, l’étude du comportement planaire peut fournir un aperçu des mécanismes conservés de l’action neuronale qui peut être difficile à sonder directement dans les organismes plus complexes. Ainsi, les planaires sont un modèle précieux pour les études comparatives de neurobiologie^{8,12,15,16,17,18,19,20,21}. En outre, l’environnement aquatique permet une exposition rapide et facile aux produits chimiques pour étudier leur effet sur le fonctionnement du cerveau chez les planaires régénérants et adultes, ce qui en fait un système populaire pour la neurotoxicologie^{22,23,24,25,26}.

Les planaires possèdent trois démarches distinctes, appelées glisse, péristalse et scrunching. Chaque démarche est exposée dans des circonstances spécifiques : le glissement est la démarche par défaut, le péristaltisme se produit lorsque la fonction ciliaire est compromise^7,27, et le scrunching est une démarche d’évasion – indépendamment de la fonction de cils – en réponse à certains stimuli nocifs⁷. Nous avons montré que le scrunching est une réponse spécifique, provoquée par la sensation de certains indices chimiques ou physiques, y compris les températures extrêmes ou le pH, les blessures mécaniques, ou des inducteurs chimiques spécifiques, et n’est donc pas une réponse générale de stress^7,28,29.

En raison de sa spécificité et de ses paramètres stéréotypés, qui peuvent facilement être quantifiés à l’aide de ce protocole, le scrunching est un phénotype comportemental puissant qui permet aux chercheurs d’effectuer des études mécanistes disséquant les voies sensorielles et le contrôle neuronal du comportement^25,28. En outre, le scrunching s’est avéré être un critère d’évaluation sensible aux effets chimiques indésirables de l’essai sur le développement du système nerveux et la fonction dans les études de neurotoxicologie^22,24,25,30. Comme plusieurs voies sensorielles différentes semblent converger pour induire scrunching à travers divers mécanismes²⁸, scrunching diffère des autres comportements planaires parce que divers, mais spécifiques, stimuli peuvent être utilisés pour disséquer des circuits neuronaux distincts et d’étudier comment différents signaux sont intégrés pour produire le phénotype scrunching.

Fait important, il existe des différences d’espèces, dans lesquelles un produit chimique peut provoquer des scrunching dans une espèce planaire, mais une réponse comportementale différente dans une autre. Par exemple, nous avons constaté que l’anandamide induit scrunching dans l’espèce planaire Dugesia japonica mais induit le péristaltisme dans Schmidtea mediterranea²⁸. Cet exemple souligne l’importance de pouvoir distinguer de manière fiable les différentes démarches, parce qu’elles sont les manifestations phénotypiques de mécanismes moléculaires distincts. Cependant, la distinction entre le scrunching du péristaltisme est difficile à l’aide de données d’observation qualitatives, parce que les deux démarches sont axées sur la musculature et partagent des similitudes qualitatives^7,28. Ainsi, pour distinguer les démarches, il est nécessaire d’effectuer l’imagerie cilia ou une étude comportementale quantitative, qui permet la distinction basée sur les paramètres caractéristiques^7,28. Parce que l’imagerie par cils est expérimentalement difficile et nécessite un équipement spécialisé comme un microscope composé à grossissement élevé et une caméra à grande vitesse^7,28, il n’est pas aussi largement accessible aux chercheurs que l’analyse comportementale quantitative.

Ici, nous présentons un protocole pour (1) l’induction de scrunching en utilisant divers stimuli physiques (température nocive, amputation, lumière quasi-UV) et chimiques (allol isothiocyanate (AITC), stimuli cinnamaldéhyde) et (2) l’analyse quantitative du comportement planaire à l’aide de logiciels librement disponibles. En quantifiant quatre paramètres (fréquence des oscillations de longueur du corps, vitesse relative, amplitude maximale, et asymétrie de l’élongation et de la contraction du corps)^7,le scrunching peut être différencié de la glisse, du péristaltisme, et d’autres états comportementaux rapportés dans la littérature, tels que la locomotion^{de serpent-comme 15} ou les épilepsies¹⁵. En outre, tandis que le scrunching est conservé entre les différentes espèces planaires⁷, chaque espèce a sa propre fréquence caractéristique et la vitesse; par conséquent, une fois que les vitesses de glisse et de scrunching d’une espèce ont été déterminées, la vitesse seule peut être utilisée comme un moyen de distinguer le scrunching de la glisse et du péristalse²⁹. Le protocole suppose qu’aucune formation préalable en analyse d’image computationnelle ou en études comportementales et peut donc également être appliqué pour des expériences comportementales planaires dans un contexte de laboratoire d’enseignement au premier cycle. Des exemples de données pour faciliter l’adaptation du protocole sont fournies dans le matériel supplémentaire.

Protocole

1. Essais quantitatifs de comportement planaire

1. Configuration expérimentale
   1. Placez un panneau LED dimmable sur une surface plane. Le panneau LED sert à deux fins : (1) fournir un fond blanc uniforme et (2) être utilisé comme source lumineuse réglable pour obtenir un contraste approprié. Placez une arène de 100 mm de plat Petri sur le panneau LED.
      REMARQUE : Pour augmenter le débit, une plaque multi puits peut être utilisée comme arène^23,24,mais les grandes arènes facilitent l’analyse automatisée de l’image.
   2. Montez une caméra sur un anneau au-dessus de l’arène (Figure 1A). Ajuster la position de la caméra, la hauteur et la mise au point au besoin afin que toute l’arène soit centrée dans le champ de vision et soit au point de mire (figure 1B).
      REMARQUE : La résolution de la caméra doit être suffisamment élevée pour distinguer clairement un planaire du fond homogène fourni par le panneau LED.
   3. Remplissez l’aréna avec les milieux d’exposition appropriés (eau planaire ou solution chimique) à un volume demi-maximum (ce qu’on appellera un bain). Cela correspond à environ 25 mL pour une boîte de Pétri de 100 mm. Allumez le panneau LED et éteignez toutes les autres sources lumineuses qui peuvent nuire à la qualité de l’enregistrement (c.-à-d. les sources lumineuses à proximité qui produisent un éblouissement sur l’arène).
      ATTENTION : Gérez les solutions chimiques dangereuses de manière appropriée en portant un équipement de protection individuelle complet (EPI) et en déplaçant la configuration expérimentale vers une hotte de fumée si nécessaire. Suivez les règlements fédéraux et étatiques sur l’élimination des déchets.
   4. Déposez un planaire vers le centre de l’arène à l’aide d’une pipette de transfert. Commencez l’enregistrement. Enregistrer les données sous forme de séquences d’images dans un format Fidji³¹ natif (TIFF, GIF, JPEG, PNG, DICOM, BMP, PGM ou FITS; voir la section d’analyse d’image 1.2).
      REMARQUE : Étant donné que les comportements et la sensibilité aux stimuli externes varient d’un planaire à l’autre, il est important de recueillir des données sur un nombre suffisamment élevé de répliques biologiques, en plus d’effectuer des répliques techniques. Nous avons travaillé avec jusqu’à 10 planaires de taille moyenne (4-7 mm) dans une boîte de Pétri de 100 mm à la fois. Bien que le temps efficace, les planaires multiples dans la boîte de Pétri à la fois rendre l’analyse des données plus difficile puisque les planaires peuvent se croiser.
      1. Pour les expériences de glisse, enregistrez à l’aide d’au moins 1 image par seconde (FPS). Pour les expériences de scrunching/péristalse, enregistrez à l’aide d’un FPS qui est au moins deux fois la fréquence de scrunching/péristalse de l’espèce planaire. Si l’espèce planaire a une fréquence inconnue de scrunching/péristalse, utilisez 10 FPS comme point de départ et augmentez/diminuez selon le cas.
      2. Lors de l’utilisation d’une solution chimique, transférer le planaire en utilisant le moins de gouttes d’eau planaire que possible afin que la concentration de la solution chimique ne soit pas modifiée de façon significative.
   5. Pour les expériences de glisse, enregistrez 1-2 minutes de comportement de glisse. Pour les expériences de scrunching/péristalse, enregistrez assez longtemps pour capturer au moins 3 oscillations consécutives se produisant en ligne droite. Une fois l’expérience terminée, terminez l’enregistrement.
      REMARQUE : Pour les expériences de scrunching/péristalse, si un planarien ne satisfait pas au critère de terminaison dans un délai fixe qui doit être cohérent entre les répliques et est déterminé empiriquement en fonction du stimulus, terminez l’enregistrement et testez un autre planaire.
      1. Si le planaire atteint la limite de l’aréna sans satisfaire au critère de résiliation, pipette le planaire de retour au centre de l’arène.
         REMARQUE : Évitez le pipetage répété d’un individu pour l’enregistrement, car cela peut changer son comportement.
   6. Retirez le ou les planaires de l’aréna et jetez l’eau planaire ou la solution chimique dans les contenants de déchets appropriés. Les planaires qui étaient dans l’eau planaire peuvent être retournés à leur conteneur à la maison.
      REMARQUE : Évitez la contamination croisée en utilisant différents arénas pour différents milieux (c.-à-d. que les expériences de glisse dans l’eau planaire ne doivent pas être menées dans un aréna précédemment utilisé pour des expériences de scrunching/péristalse avec exposition chimique).
      1. Rincez en série les planaires exposés à une solution chimique dans 3 plats petri propres de 100 mm remplis de 25 mL d’eau planaire pour diluer complètement tous les produits chimiques. Si le scrunching ou le péristalse a été induit, placez ces planaires dans un récipient séparé. Les planaires peuvent être retournés à leur conteneur à la maison après un mois puisque la plupart des cellules se seraient retournées à ce^{moment-là 1}.
         REMARQUE : Si plusieurs expériences différentes sont nécessaires pour la même population de planaires, par exemple pour une population de l’RNAi, permettez aux planaires de récupérer pendant 24 heures avant d’exécuter la prochaine expérience. Commandez les expériences de telle sorte que l’expérience la moins invasive est la première et l’expérience la plus invasive (p. ex., amputation) est menée en dernier.
      2. Si vous exécutez plusieurs expériences dans la même arène, disposer correctement de la solution de bain et enlever les traces de mucus en essuyant l’arène avec une serviette en papier entre les pistes.
         REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
2. Analyse quantitative du comportement planaire
   1. Effectuez des tests de comportement planaires tels que décrits à la section 1.1.
   2. Ouvrez la séquence d’image brute pour une expérience à Fidji (Fichier > Importer > Séquence d’images) et sélectionnez la première image de la séquence d’images. Dans la fenêtre Options de séquence, activez la case « Trier les noms numériquement » et cliquez sur « OK ». Une fois la séquence d’image chargée, convertissez la séquence d’image en 8 bits (Image > Type > 8 bits) et utilisez l’outil de flèche ou le curseur en bas de la pile d’images pour regarder ou parcourir la séquence d’image.
      REMARQUE : Pour les expériences de glisse, toutes les données peuvent être utilisées aussi longtemps que le planaire peut être clairement vu tout au long de l’enregistrement. Cependant, il suffit généralement d’analyser le mouvement libre au centre de l’arène en extrayant les parties pertinentes telles que décrites ci-dessous.
   3. Pour extraire une période de temps et une région d’intérêt, dessiner une région d’intérêt englobant le chemin complet d’un planaire à l’aide de l’outil rectangle (Figure 2A, 2B). Cliquez avec le bouton droit sur la pile d’images et sélectionnez Duplicate..., cochez la case pour Duplicate stack, entrez les premières et dernières images de la séquence d’intérêt, puis cliquez sur OK. Si plusieurs planaires ont été photographiés simultanément, répétez cette étape de sélection et de duplication de la région pour chaque planaire dans l’arène afin qu’il y ait autant de piles d’images ouvertes qu’il y a de planaires dans l’arène. Les étapes suivantes (étapes 1.2.4-1.2.10) doivent être effectuées sur chaque pile d’images, une à la fois.
      1. Pour les expériences de glisse, extraire une période de glisse où le planaire se déplace au moins deux fois sa longueur de corps.
         REMARQUE : Plus les données de glisse sont extraites par planaire, plus les données seront fiables. Le planaire n’a pas besoin de se déplacer en ligne droite pour l’analyse de glisse.
      2. Pour les expériences de scrunching/péristalse, extraire une instance où le planaire subit un minimum de trois oscillations corporelles consécutives (idéalement plus) en ligne droite, en s’assurant que chaque oscillation est un cycle complet d’élongation-contraction, car des oscillations complètes sont nécessaires pour déterminer avec précision la fréquence.
         REMARQUE : Plus il y aura d’oscillations qui peuvent être extraites, plus les données seront fiables. N’utilisez pas de séquences où le planaire tourne, car ceux-ci entraîneront des mesures de longueur inexactes.
   4. Appliquez un seuil à la pile d’images dupliquées (Image > Ajuster > Seuil) pour binariser l’image et extraire le planaire de l’arrière-plan. Ajuster les barres coulissantes au besoin de sorte que l’ensemble du planaire soit mis en évidence en rouge. Les valeurs exactes dépendent de la qualité de l’imagerie. Laissez les cases pour l’arrière-plan sombre, Empilez l’histogrammeet ne réinitialisez pas la plage non cochée. Faites défiler la pile d’images pour assurer une bonne plage de seuil (c.-à-d. que le planaire est bien séparé de l’arrière-plan dans toute la pile), puis cliquez sur Appliquer.
   5. Dans la fenêtre Convertir la pile en binaire, définissez la méthode par défaut et l’arrière-plan sur la lumière. Décochez toutes les cases de cette fenêtre, puis cliquez sur OK. Une image binariée montrant un planaire noir sur fond blanc apparaîtra (Figure 2C). Assurez-vous que l’ensemble du planaire est visible dans tous les cadres de la séquence d’image.
      REMARQUE : Les objets indésirables de la séquence d’image binarisée qui sont plus petits ou plus grands que le planaire peuvent être filtrés dans l’analyse suivante à l’aide d’un filtre de taille (Figure 2Ciii).
   6. Définissez des mesures en cliquant sur Analyser > Définir les mesures. Cochez les cases pour Area, Center of Mass, Stack position, et Fit ellipse et cliquez sur OK.
      REMARQUE : Ces paramètres ne doivent être réglés qu’une fois par session aux Fidji.
   7. Sélectionnez la pile d’images ouverte et sélectionnez Analyser > Analyser les particules.
   8. Dans la fenêtre Analyser les particules, sélectionnez Afficher > Masques pour ouvrir une nouvelle pile montrant tous les objets détectés avec les paramètres choisis. Cela peut être utilisé pour vérifier visuellement que seules les mesures du planaire sont prises. Un filtre de taille peut être défini à cette étape pour éliminer le bruit indésirable en entrant la zone approximative du planaire (en pixel² unités) dans l’espace fourni. Cochez les cases pour afficher les résultats et effacer les résultats, puis cliquez sur OK.
      REMARQUE : Dans la fenêtre Résultats, si l’index (première colonne) n’égale pas le nombre de tranches pour toutes les lignes, cela signifie que trop ou trop peu d’objets ont été suivis. Une possibilité pour cet écart est la présence d’autres objets en dehors du planaire ou que le planaire n’a pas été suivi dans des cadres spécifiques.
   9. Traversez la pile d’images du masque à l’aide du curseur en bas du panneau. S’il y a du bruit ou s’il y a des cadres qui n’ont pas de planaire, fermez la fenêtre Résultats et la pile d’images de masque. Répétez les étapes 1.2.7-1.2.8 en ajustant le filtre de zone pour supprimer uniquement les objets autres que le planaire.
      REMARQUE : Si le planaire est absent du cadre du masque, cela suggère que la limite inférieure du filtre de zone a été trop haute.
   10. Dans la fenêtre Résultats, enregistrez les données à l’aide de File>Save As. Ajoutez l’extension .csv au nom de fichier pour enregistrer les données en tant que valeurs séparées par virgule. Une fois que les données de la pile d’images sont enregistrées, fermez la pile d’images respective et les fenêtres Résultats et Masque.
   11. Importer des données et analyser davantage à l’aide de n’importe quel logiciel de feuille de calcul ou freeware. Pour calculer la vitesse de glisse, reportez-vous à la section 1.3. Pour calculer l’ensemble complet de paramètres scrunching/peristalsis, reportez-vous à la section 1.4.
       REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
   12. Pour déterminer le pixel à la conversion de longueur réelle, ouvrez une image aux Fidji avec une longueur de référence (par exemple, le diamètre de l’arène). Sélectionnez l’outil de ligne et tracez une ligne sur la longueur connue.
   13. Convertir les unités de pixels en une unité de longueur standard en cliquant sur Analyser > Définir l’échelle. Entrez la longueur correspondant à la ligne tracée sur l’image dans la zone distance connue et changez l’unité de longueur du pixel à l’unité de longueur standard choisie. Le facteur de conversion est écrit à côté de l’échelle.
       REMARQUE : Une valeur de conversion de pixels n’est pas requise pour les analyses de glisse ou de scrunching/peristalsis dans les sections 1.3 et 1.4.
3. Calcul de la vitesse de glisse
   1. À l’aide du fichier de données enregistré dans la section 1.2, chargez le centre des coordonnées de masse (COM) x et y et les données de l’axe principal. Si les données sont enregistrées en tant que fichier de valeurs séparés par virgule, ces listes correspondent respectivement aux colonnes « XM », « YM » et « Major ».
   2. Calculez le déplacement (d) du centre planaire de masse en pixels pour chaque image par rapport au cadre suivant à l’aide des colonnes de données « XM » et « YM ». Le déplacement d) est donné par:
      
      où_les coordonnées com (XM, YM) d’un cadre et x₂ et y_{2 se} réfèrent aux coordonnées COM (XM, YM) du cadre suivant.
   3. Définissez la longueur du corps planaire comme le 95^e percentile de la colonne « major ». Puisque les planaires présentent un comportement de préférence de mur³², ceci assure que la longueur calculée de corps planaire est représentative du moment où le planaire est allongé²⁴.
   4. Normaliser le déplacement par longueur du corps planaire en divisant les déplacements de pixels par image par la longueur du corps planaire (l). Le déplacement normalisé (d_n) est donné par:
      
   5. Générer une liste de vitesses normalisées en divisant les déplacements normalisés par le temps écoulé par image (inverse du FPS enregistré). La vitesse de glisse normalisée (s_n) est donnée par:
      
   6. Calculer la vitesse de glisse normalisée du planaire en prenant la moyenne de la liste des vitesses normalisées (s_n). L’écart type peut être utilisé comme mesure de l’incertitude pour le planaire.
   7. Répétez les étapes 1.3.1-1.3.6 pour chaque planaire à analyser. Moyenne et prendre l’écart type des vitesses de glisse pour tous les planaires pour obtenir la vitesse de glisse et l’incertitude associée, respectivement, pour une population planaire.
4. Distinction des démarches de scrunching et de péristalse à l’aide de l’ensemble complet de paramètres
   1. Chargez la liste de données de l’axe principal à partir du fichier de données enregistré à partir de la section 1.2. Si les données sont enregistrées en tant que fichier de valeurs séparés par virgule, cela correspond à la colonne Major.
   2. Créez une liste qui numérote chaque point de données dans la colonne Major, en commençant par 0. Convertissez cette liste en temps écoulé par image en divisant par le FPS enregistré.
   3. Tracez les données de la colonne principale en ce qui concerne le temps écoulé pour générer une parcelle d’oscillation scrunching/peristalsis (Figure 3A). À l’aide de la parcelle d’oscillation, réduire les données à au moins trois oscillations consécutives en ligne droite (Figure 3Bi). Couper les données pour commencer et terminer à des pics locaux (élongation maximale de l’oscillation) ou des creux (allongement minimal de l’oscillation).
      REMARQUE : Si les extrema locaux ne sont pas à peu près égaux (les pics/creux diffèrent considérablement en hauteur), cela suggère que les oscillations ne sont pas en ligne droite (Figure 3Bii). Extraire une autre séquence d’au moins trois oscillations consécutives en ligne droite. Reportez-vous à la section 1.2.
   4. Confirmez que la séquence d’intérêt d’oscillation a été extraite et coupée correctement en replotant les données principales coupées en ce qui concerne le temps. Utilisez cette liste de données découpée pour tous les calculs ultérieurs.
   5. Pour calculer la fréquence d’oscillation (ν_m),divisez le nombre d’oscillations (O_n) par le nombre total de points de données dans la liste de données de l’axe majeur (N). Multipliez le FPS par cette valeur pour obtenir la fréquence dans les oscillations par seconde.
      
   6. Pour calculer l’allongement maximal (|Δε| _max), soustraire la longueur minimale absolue du corps (l_min) de la longueur maximale absolue du corps (l_max). Normalisez à la longueur du corps allongée en divisant par la longueur maximale absolue du corps.
      
   7. Pour calculer la vitesse par longueur de corps (v^*_m),multipliez l’élongation maximale calculée par la fréquence d’oscillation.
      
      NOTE : La vitesse seule peut être utilisée pour distinguer entre les démarches de scrunching et de péristalse⁷.
   8. Pour calculer la fraction du temps passé à allonger (f_elong), prenez le dérivé de la liste de données de l’axe majeur paré en ce qui concerne le temps. Divisez le nombre de points de données positifs (c.-à-d. lorsque le dérivé est >0 (n_p), par le nombre total de points de données dans la liste de données de l’axe principal (n_t)).
      
      REMARQUE : Les planaires scrunching présentent une fraction asymétrique du temps passé à s’allonger alors que les planaires qui exécutent le péristaltisme passent autant de temps à allonger et à contracter⁷.
   9. Répétez les étapes 1.4.1-1.4.8 pour chaque planaire à analyser. Calculez un paramètre de population planaire défini en prenant l’écart moyen et standard de chaque paramètre.
      REMARQUE : L’ensemble de paramètres peut être utilisé pour déterminer si le comportement d’oscillation est scrunching, péristalse ou une autre forme de locomotion avec des changements périodiques de forme du corps. Le scrunching et le péristalse ont des paramètres fixes pour une espèce^{donnée 7}, avec des paramètres scrunching généralement étant plus grands que les paramètres de péristalse⁷. Bien qu’il soit possible que l’un des paramètres puisse tomber en dehors de l’aire de répartition spécifique à l’espèce, comme nous l’avons déjà observé avec l’induction chimique²⁸, le comportement observé doit être d’accord avec au moins 3 des 4 paramètres publiés à classer comme péristalse ou scrunching.

2. Induction scrunching

1. Stimuli physiques (température nocive, lumière UV, amputation)
   1. Pour toutes les expériences de stimuli physiques, reportez-vous à la section 1.1 pour la configuration expérimentale.
      REMARQUE : Il est préférable d’utiliser une grande arène, comme une boîte de Pétri de 100 mm, pour des expériences de stimuli physiques afin de permettre plus d’espace ouvert pour manœuvrer une pipette et/ou une lame de rasoir.
   2. Pour induire le scrunching par la température nocive, chauffer l’eau planaire dans un bécher en verre (au moins 100 μL par planaire à tester) à 65 °C sur une plaque chauffante.
      1. Placez un planaire au centre de l’arène. Attendez que le planaire s’oriente debout et commence à glisser. Commencez l’enregistrement.
      2. À l’aide d’une pipette P-200, pipette lentement 100 μL de l’eau planaire de 65 °C post-pharyngeally sur l’extrémité arrière du planaire pour induire le scrunching.
         REMARQUE : Assurez-vous que l’eau planaire chauffée reste à 65°C. Si nécessaire, réchauffer l’eau à 65°C avant de commencer une autre expérience. Puisque la pression peut également induire le scrunching, le pipeting lent est nécessaire. Le canalage de l’eau de température ambiante de la même manière que dans l’expérience peut servir d’option de contrôle et de pratique.
      3. Arrêtez l’enregistrement une fois que le scrunching a cessé. Placez le planaire dans un récipient de récupération et échangez les supports dans la boîte de Pétri avec de l’eau planaire fraîche et de température ambiante si vous exécutez plus d’expériences.
   3. Pour induire le scrunching par amputation, transférer un planaire au centre de l’arène et attendre que le planaire s’oriente debout et commence à glisser. Commencez l’enregistrement.
      1. Amputer le planaire à l’aide d’une lame de rasoir propre. Les amputations peuvent être faites n’importe où le long du planaire tant que l’emplacement de coupe est cohérent entre les expériences.
         REMARQUE : Les paramètres de scrunching sont extraits de la pièce antérieure. Ainsi, évitez d’obstruer la vue de la caméra de cette partie du planaire lors de l’application de la coupe en s’approchant de l’extrémité postérieure. Les feuillets de couverture en plastique fonctionnent également bien pour la coupe et sont une option plus sûre, en particulier dans un cadre d’enseignement.
      2. Arrêtez l’enregistrement une fois que la pièce antérieure a cessé de scrunching. Retirez les deux morceaux, placez-les dans un récipient séparé et laissez-les se régénérer pendant 7 jours. Les planaires amputés peuvent être réincorporés dans le contenant domestique une fois régénérés.
   4. Pour induire le scrunching à l’aide de la lumière quasi-UV, attachez les filtres appropriés (p. ex., filtres Roscolux) à l’objectif de la caméra afin de réduire la quantité de lumière quasi-UV réfléchie recueillie par la caméra et peut interférer avec la réponse du planaire. Au lieu d’utiliser le panneau LED pour éclairer l’arène d’en bas, utilisez l’éclairage rouge ambiant auquel les planaires sont insensibles³³.
      1. Remplissez une arène de 100 mm de plat Petri avec de l’eau planaire et placez un seul planarian (5-9 mm) au centre de l’arène. Commencez l’enregistrement à 10 FPS.
      2. Tenez un pointeur laser UV de classe II (405 ± 10 nm, puissance de sortie <5 mW) à environ 30 cm de l’arène. Placez le pointeur laser à un angle de 45° du planaire de glisse, puis faites briller le pointeur laser pendant 5-10 secondes à mi-chemin entre l’extrémité postérieure du pharynx et la pointe de la queue pour induire le scrunching.
         REMARQUE : La puissance du pointeur laser peut être mesurée à l’aide d’un compteur de puissance proche des UV.
      3. Attendez que le planaire recommence à glisser avant de tenter deux autres stimulations sur la même personne pour tester la reproductibilité de la réaction. Si le planaire continue à afficher le même comportement, arrêtez d’enregistrer et remettez le planaire dans son conteneur. Si le comportement change entre les stimulations, des tests supplémentaires montreront quelle réponse est la plus importante.
         REMARQUE : Les planaires peuvent devenir désensibilisés à la lumière quasi-UV et cesseront de réagir. Les stimulations consécutives nécessitent une période de repos de 8-10 secondes.
2. Stimulus chimique (AITC)
   1. Pour induire le scrunching à l’aide d’un produit chimique, par exemple, l’agoniste RAITC²⁸trpa1 , les planariens sont idéalement immergés dans un bain du produit chimique. Si nécessaire, le pipetage peut être appliqué comme décrit à la section 2.1.2.3.
      ATTENTION : L’AITC est inflammable, extrêmement toxique, peut causer une irritation de la peau et des yeux, une sensibilisation respiratoire et cutanée, et est dangereuse pour la vie aquatique. L’huile d’AITC doit être manipulée dans un capot de fumée. Avant de fabriquer des solutions de stock d’AITC, mettre en PPE approprié (gants de nitrille et une couche de laboratoire) et mettre en place des contenants appropriés d’élimination des déchets solides et liquides dangereux.
   2. Dans un capot de fumée, faire une solution de stock de 10 mM d’AITC dans l’eau planaire dans un tube de centrifugeuse de 50 mL. Cette solution de stock peut être utilisable jusqu’à un mois lorsqu’elle est stockée à 4°C.
      1. À partir de ce stock, préparer une solution de travail de 25 mL de 100 μM AITC dans l’eau planaire dans un tube de centrifugeuse de 50 mL. Cette solution AITC de 100 μM sera utilisée pour induire le scrunching chez les planaires.
         NOTE : 100 μM AITC induit des scrunchings cohérents dans D. japonica et S. mediterranea planarians²⁸. Pour les autres planaires aquatiques, 100 μM peuvent servir de concentration de départ et peuvent être ajustés en conséquence.
      2. Configurer la configuration expérimentale (voir la section 1.1). Remplissez l’arène avec la solution de travail AITC et placez-la dans un conteneur secondaire. Le conteneur secondaire doit contenir au moins deux fois le volume de l’aréna.
         REMARQUE : Des expériences peuvent être effectuées à l’intérieur d’une hotte de fumée pour plus de sécurité.
      3. Transférer jusqu’à 10 planaires au centre de l’arène et commencer l’enregistrement.
      4. Une fois que les planaires deviennent désensibilisés et cessent de scrunching, arrêtez d’enregistrer. Retirez les planaires de la solution AITC et rincez (voir la section 1.1). Éliminer les déchets solides et liquides de l’AITC dans des contenants de déchets appropriés.
      5. Vérifiez la spécificité de la réponse à l’AITC à l’aide de l’ARNI à TRPA1²⁸ en suivant les protocoles standard.

Résultats

La perception extraoculaire proche des UV chez les planaires de S. mediterranea dépend de TRPA1 et a été proposée pour être liée à H₂O₂ version¹⁷. Étant donné que l’exposition à H₂O₂ induit des scrunchings dépendants de trpa1 dans S. mediterranea et D. japonica planarians²⁸, les étapes de la section 2.1.4 peuvent être utilisées pour vérifier si l’exposition à la lumière quasi-UV indu...

Discussion

En utilisant ce protocole, on peut étudier quantitativement les effets des stimuli physiques et chimiques^7,28,29 ou manipulation génétique (RNAi)^28,29 sur la locomotion planaire. Pour maximiser la résolution spatiale, il est préférable de déplacer la caméra aussi près que possible de l’arène tout en s’assurant que l’ensemble de l’arène est dans le cham...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allyl isothiocyanate, 95% (AITC)	Sigma-Aldrich	377430-5G	CAUTION:  Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE.
Camera lens, 2/3 25mm F/1.4	Tamron	23FM25SP
Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated	Genesee Scientific	25-105
Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile	MedSupply Partners	62-1019-2
Cinnamaldehyde, >95%	Sigma-Aldrich	W228613-100G-K
Dimmable A4 LED Tracer Light Box	Amazon	B07HD631RP
Flea3 USB3 camera	FLIR	FL3-U3-13E4M
Heat resistant gloves	Fisher Scientific	11-394-298
Hot plate	Fisher Scientific	HP88854200
Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water	Instant Ocean	SS15-10	Prepare in deionized water at 0.5 g/L.
Montjüic salts, prepared in Milli-Q water	Sigma-Aldrich	various	Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl.
Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene	Simport	D210-7
Pipette, 20-200 μL range	Rainin	17008652
PYREX 150 mL beaker	Sigma-Aldrich	CLS1000150
Razor blade, 0.22 mm	VWR	55411-050
Roscolux color filter:  Golden Amber	Rosco	R21	Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together.
Roscolux color filter:  Medium Red	Rosco	R27
Roscolux color filter:  Storaro Red	Rosco	R2001
Samco transfer pipette, 62 µL large aperture	Thermo Fisher	691TS
Support stand	Fisher Scientific	12-947-976
Thermometer	VWR	89095-600
UV laser pointer	Amazon	B082DGS86R	This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW.