JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, erken evre intervertebral disk dejenerasyonunu simüle etmek için proinflamatuar, dejeneratif sığır organ kültürünün yeni bir deneysel modelini sunar.

Özet

Semptomatik intervertebral disk (IVD) dejenerasyonu (IDD) önemli bir sosyoekonomik yüktür ve iltihaplanma ve doku bozulması ile karakterizedir. Nedensel tedavilerin eksikliği nedeniyle, hastalığın ilerlemesinde rol oynayan mekanizmaları incelemek, terapötik hedefler bulmak ve hayvan modellerine olan ihtiyacı azaltmak için yenilikçi deneysel organ kültürü modellerine acil ihtiyaç vardır. Burada, IDD sırasında mevcut olan proinflamatuar ve katabolik mikroçevrimini taklit eden yeni, üç boyutlu bir organ kültürü modeli protokolü sunuyoruz.

Başlangıçta, sığır kaudal IVD'leri doku kültürü ortamında parçalandı, temizlendi ve kültürlendi. Özel yapım bir biyoreaktörde günde 2 saat dinamik fizyolojik veya patolojik yükleme uygulandı. IVD'ler dört gün boyunca bir kontrol grubuna (yüksek glikoz ortamı, fizyolojik yükleme, fosfat tamponlu salin enjeksiyonu) ve patolojik bir gruba (düşük glikoz ortamı, patolojik yükleme, tümör nekroz faktörü-alfa enjeksiyonu) atandı. IVD'lerin toplanan çekirdek pulposus hücrelerinden gen ekspresyon analizi ve şartlandırılmış organ kültürü medyasının enzime bağlı immünosorbent tahlili yapıldı.

Verilerimiz, kontrol grubuna kıyasla patolojik gruba yüklendikten sonra enflamatuar belirteçlerin daha yüksek bir ekspresyonunun ve disk yüksekliklerinin azaldığını ortaya koydu. Bu protokol IVD inflamasyon ve dejenerasyon simüle etmek için güvenilirdir ve uygulama kapsamını genişletmek için daha da genişletilebilir.

Giriş

Bel ağrısı (LBP) her yaştan bireyi etkileyebilir ve dünya çapında engellilik için önde gelen bir nedendir1,2,3. LBP ile ilişkili toplam maliyet yılda 100 milyar doları aşıyor4,5. Semptomatik intervertebral disk (IVD) dejenerasyonu (IDD), iltihaplanma ve doku bozulması ile karakterize bir durum, LBP6,7'ninönemli bir nedenidir. Özellikle, IDD, IVD'nin hücre dışı matrisinin (ECM) giderek gelişen bir kırılımı ile karakterizedir, hızlandırılmış bir patolojiye, nörolojik bozukluklara ve sonunda sakatlığa yol açan birden fazla faktör tarafından indüklenir ve tetiklenir. Ayrıca, IDD proinflamatuar sitokinlerin, değiştirilmiş omurga biyomekaniklerinin, anjiogenezin ve sinir büyümesinin salınmasıyla ilişkilidir, bu da ağrı hissini arttırır, tamamen kronik LBP'ye (aktif diskopati) neden olur6,8. Bugüne kadar, tedavi seçenekleri arasında diskektomi ve bitişik omurların sonraki füzyonu, IVD protezinin implantasyonu veya IDD9hastaları için steroidal olmayan antienflamatuar ilaçlar, opioidler ve kas gevşeticiler gibi cerrahi olmayan yaklaşımlar yer almaktadır. Cerrahi ve cerrahi olmayan mevcut standart terapötik seçenekler sadece kısmen etkilidir ve alttaki biyolojik sorunu ele alamaz9,10. Erken evre dejeneratif disk hastalığı, ilk inflamatuar doku yanıtı, özellikle tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-alfa) ifadesindeki artış ile karakterizedir11. Bu erken disk değişiklikleri öncelikle disk mimarisini bozmadan hücresel düzeyde meydana gelir ve daha önce pro-enflamatuar koşullar altında beslenme eksikliği ile taklit edilebilir12. Bu nedenle, bu dejenerasyon mekanizmalarını araştırmak ve uygun terapötik hedefleri bulmak için in vivo durumun hassas simülasyonu çok önemlidir. Ek olarak, moleküler özelliklerin bu simülasyonlarında, disklerin mekanik yükleme ortamı IVD'nin patolojik ve fizyolojik değişimlerinde önemli bir rol oynar. Sonuç olarak, bu yaklaşımları birleştirmek, ivd'lerin karmaşık mikroçevrimini taklit etmek için bizi bir adım öne çıkaracaktır. Şu anda, en iyi bilgimiz olan pro-enflamatuar ve beslenme ayarı ile birlikte dinamik yüklemenin yönü göz önünde bulundurularak herhangi bir çalışma bulunmamaktadır.

Büyük hayvan modelleri potansiyel ilgili in vivo etkileşimlerinin araştırılmasına izin verse de, maliyetlidir ve yoğun çalışırlar. Ayrıca, hayvan modellerinin araştırmada kullanılması uzun zamandır tartışma konusu olduğundan, önemli araştırma sorularını yanıtlamak için gereken hayvan sayısının azaltılması büyük ilgi görüyor. Son olarak, şu anda IVD araştırmasında kimliği taklit etmek için ideal bir hayvan modeli yoktur13,14. Bu nedenle, IDD ve ilişkili enflamatuar ve dejeneratif süreçleri simüle etmek için bir organ kültürü modeli gibi uygun maliyetli ve güvenilir bir değiştirme oluşturmak gerekir. Son zamanlarda, erken evre intervertebral disk hastalığını simüle etmek için proinflamatuar ve dejeneratif bir organ kültürü modelinin kurulmasına ilişkin mevcut protokolün uygulanması, anti-enflamatuar ilaçların IDD organ kültüründeki etkisini araştırmamıza izin verdi15.

Burada, düşük besleyici ortam koşullarında tümör nekroz faktör-alfanın (TNF-α) doğrudan intradiskal enjeksiyonu ve bir biyoreaktörde dejeneratif yüklemenin neden olduğu katabolik ve proinflamatuar bir mikroçevre yoluyla sığırlar arası disklerin nasıl elde edildiğini ve erken evre IDD durumunun nasıl teşvik edildiğini açıklıyoruz. Şekil 1 deneysel modeli gösterir ve dejeneratif ve fizyolojik yükleme koşullarını simüle etmek için kullanılan biyoreaktörü gösterir.

figure-introduction-4134
Şekil 1: Deneysel kurulumun illüstrasyonu. A: sığır kuyruğu; B: parçalanmış sığır intervertebral diskler; C: diskin kültür ortamına sahip iyi bir plakaya aktarılması; D: simülasyonun bir biyoreaktöre yüklenmesi; E: intradiskal enjeksiyon tekniği; F: DAĞıTıMı ORTAYA ÇıKARMAK İçİn PBS/trypan mavi boya enjeksiyonundan sonra IVD. IDD: intervertebral disk dejenerasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

Deneyler, yerel asetoirlerden elde edilen sığır kuyrukları kullanılarak gerçekleştirildi. Mevcut çalışmada kullanılan biyolojik malzemeler besin zincirinden alınmaktadır ve İsviçre ve Avrupa hukukunda etik onay gerektirmez.

1. Sığırlar arası diskin diseksiyonu

  1. Yüzeydeki kir ve kılları temizlemek için tüm kuyruğu musluk suyuyla iyice durulayın.
    NOT: Sağlam, distal uçlu, IVD'lerin istenen boyutuna bağlı olarak deneyler için kuyruk başına en fazla 9 IVD (koksikgeal 1-9) kullanılabilir. 15-20 mm arasında istenilen çapı göz önünde bulundurarak deneyler için kuyruk başına 5 IVD ile 12 sığır kuyruğu kullandık.
  2. Tüm kuyruğu 10 dakika boyunca% 1 betadin çözeltisi içeren bir kutuya daldırin. Kuyruğu steril gazlı bezle kısaca kurulayın ve steril bir örtüye yerleştirin.
    NOT: Diskin diseksiyonu sırasında, dehidrasyonu önlemek için kuyrukları Ringer'ın çözeltisi ıslatılmış gazlı bezle nemlendirin. Tüm diseksiyon prosedürü tamamlanana kadar kuyrukları (veya kalan parçaları) ıslak gazlı bezle sarılmış olarak saklayın.
  3. SERUM'ların tanımlanmasını kolaylaştırmak için yumuşak dokuyu kaudal omurgadan mümkün olduğunca tamamen çıkarmak için bir neşter (No. 20) kullanın. Kemik çıkarma pensesi ile omurların dikenli ve enine işlemlerini çıkarın.
    NOT: İstenilen çapa sahip IVD'leri seçin. Mevcut çalışmada 15-20 mm çap aralığına sahip IVD'ler kullanılmıştır.
  4. Tek tek hareket segmentleri elde etmek için her omur gövdesinin ortasından kemik pense ile enine kesin. Hareket parçalarını Ringer'ın çözeltisi ile ıslatılmış gazlı bezli bir Petri kabına koyun.
  5. IVD ve omurları palpasyonla ve hareket segmentlerini hafifçe hareket ettirerek bulun. IVD'lerin büyüme plakasında testere ile iki paralel kesim yapın, IVD'nin her iki tarafında bir tane. IVD'den omurlara doğru yaklaşık 0,5-1 mm güvenlik mesafesine sahip diske (yumuşak) bitişik kemikli uç plakası kısmının dışbükey bölgesine (sert) dokunarak ve bularak büyüme plakasının yerini belirleyin. Omurları keserken bant testeresinin bıçağının Ringer'ın çözeltisi ile soğutulduğundan emin olun.
  6. IVD'leri Ringer'ın çözeltisi ile ıslatılmış temiz gazlı bezle temiz bir Petri kabına aktarın.
    NOT: Gazlı bez nemlendirilmeli ve IVD'lerin şişmesini önlemek için çok ıslak olmamalıdır,
  7. Omur gövdesini (kırmızı/pembe kemik), büyüme plakasını (beyaz kıkırdak) kazımak için neşter bıçağını kullanın, plakayı sağlam bırakın (sarı-pembe). Yükleme işlemi için iki yüzeyi düz ve paralel hale getirin. Kazınmış IVD'leri Ringer'ın çözeltisi ile ıslatılmış gazlı bezli taze bir Petri kabına aktarın.
    NOT: IVD'yi tutarken ve kazırken eli korumak için bir zincir posta eldiveni giyin.
  8. Disk yüksekliğini ve çapını bir kaliperle ölçün. Omur kemiğindeki kan pıhtılarını jet lavaj sistemi kullanarak Ringer'ın çözeltisi ile temizleyin.
  9. IVD'leri tüp başına bir IVD olmak üzere 50 mL plastik tüplere aktarın. IVD başına 25 mL Fosfat Tamponlu Salin (PBS) + %10 Penisilin/Streptomisin (P/S) ekleyin ve oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde 15 dakika sallanarak bırakın.
  10. Üstnatantı aspire edin ve IVD'leri durulamak için 2 dakika boyunca IVD başına 10 mL PBS +% 1 P/ S ekleyin.

2. IVD kültürü ve yükleme

  1. Diskleri IVD odalarına aktarın ve IVD kültür ortamı ekleyin (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM, fizyolojik grup için 4,5 g/L yüksek glikoz DMEM ve patolojik grup için 2 g/M düşük glikoz DMEM) + %1 P/S + %2 fetal baldır serumu + %1 ITS (5 μg/mL insülin içerir, 6 μg/mL transferrin ve 5 ng/mL selenious asit) + 50 μg/mL askorbat-2-fosfat + %1 esansiyel olmayan amino asit + birincil hücreler için 50 μg/mL antimikrobiyal ajan) ve 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin, %85 nem ve %5 CO2.
  2. Diskleri deneysel gruplara göre bir biyoreaktör sistemi içinde 4 gün boyunca kültüre edin16. Patolojik grupta, dejeneratif yükleme koşullarını 0.32-0.5 MPa, 2 saat / gün için 5 Hz'de koruyun. Fizyolojik kontrol grubunda, 2 saat / gün için 0.02-0.2 MPa, 0.2 Hz yükleme protokolü kullanın.
    NOT: Yükleme işlemleri sırasında IVD'leri 5 mL IVD ortamı içeren bölmelere yerleştirin. Hacim, biyoreaktörün yükleme odalarının boyutuna bağlıdır. Yükleme prosedürleri arasında, SERBEST şişme geri kazanımı için IVD'leri 7 mL IVD kültür ortamına sahip altı kuyulu plakalara yerleştirin.
  3. Deneysel dönemde disk yüksekliğindeki değişiklikleri analiz etmek için, disk yüksekliğini IVD diseksiyondan sonra (taban çizgisi) sonra ve serbest şişme döneminden sonra ve deneysel süre boyunca dinamik yüklemeden sonra günlük olarak bir kaliper ile ölçün.

3. İntradiskal tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) enjeksiyonu

  1. 1. gündeki ilk dinamik yükleme döngüsünden hemen sonra, IVD'leri dikey bir konumda bir Petri kabına yerleştirin ve IVD'leri bir cımbızla stabilize edin.
  2. Patolojik grubun çekirdek pulposus dokusuna 30-gauge insülin iğnesi ile rekombinant TNF-α (IVD başına 70 μL PBS'de100ng) enjekte edin. 1 dakikada yaklaşık 70 μL hızında yavaşça enjekte edin.
  3. Enjeksiyondan sonra, şırıngayı IVD'nin yarısına kadar çekin ve iğneyi ve şırıngayı IVD'den tamamen çıkarmadan önce enjekte edilen çözeltinin geri sızmasını önleyen bir vakum oluşturmak için şırınga pistonu çekin.
    NOT: Yükleme ve geceleme kültüründen sonra enjekte edilen çözeltinin dağılımını değerlendirmek için trypan mavi boya içeren PBS enjekte ederek bir pilot deney gerçekleştirin.

4. Gen ifadesi

  1. 4. günde IVD'leri hasat edin. Çekirdek pulposus (NP) dokusunu (IVD'nin ortasında jelli kısım) biyopsi zımbası ile toplayın. Dış annulus fibrosus 'u (AF) neşter bıçağıyla (No.20) toplayın.
    NOT: 0. günde taban çizgisi referansı için, RNA ekstraksiyonu için diseksiyondan hemen sonra dokuları toplayın.
  2. Deneysel tasarıma bağlı olarak gen ekspresyon analizi için gereken NP veya AF dokusu miktarını kullanın.
    NOT: Mevcut deneyler için yaklaşık 150 mg doku kullanılmıştır. Verimli ekstraksiyon için RNA izolasyon çözeltisinin doku kütlesine oranı 100-150 mg doku başına en az 2 mL olmalıdır.
  3. NP veya AF dokusunu sindirim çözeltisi ile sindirin (DMEM'de% 0.2 pronaz, filtre sterilize) ve manyetik karıştırma ile 37 ° C'de 1 saat kuluçkaya yatır18.
  4. Sıvı nitrojen kullanarak doku örneklerini flash-freeze ve ince bir toz toz haline getirin. Toz haline getirilmiş doku tozunu, monofaz çözeltisinde (RNA izolasyon çözeltisi) her biri 1 mL guanidin tiyosiyanat ve fenol içeren iki adet 2 mL tüpe eşit olarak bölün.
  5. Homojenizasyonu RNA izolasyon çözeltisi ve toz haline getirilmiş doku tozu içeren 2 mL tüplerde gerçekleştirin. Doku tozlarını 8 mm paslanmaz çelik bilye ve 30 Hz'de bir doku-lyzer ile 3 dakika boyunca homojenize edin. 12.000 x g,4 °C'de 10 dakika santrifüj ve süpernatantı taze bir tüpe aktarın. Süpernatantlar en az bir ay boyunca -80 °C'de saklanabilir.
  6. 1 mL RNA izolasyon çözeltisi başına 0,1 mL 1-bromo-3-kloropropan (BCP) ekleyin ve 15 sn boyunca kuvvetlice çalkalayın. Elde ettiği karışımı oda sıcaklığında 15 dakika yörüngesel çalkalayıcıda ve santrifüjü 12.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika saklayın.
    NOT: RNA sadece üst sulu fazda kalır.
  7. Sulu fazı taze bir tüpe aktarın ve ilk homojenizasyon için kullanılan 1 mL RNA izolasyon çözeltisi başına 0,25 mL izopropanol ve 0,25 mL yüksek tuz çökeltme çözeltisi ile RNA'yı çökeltin. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıda ve santrifüjde 12.000 x g'da 4 °C'de 8 dakika saklayın.
    NOT: Alternatif olarak, genellikle daha yüksek RNA saflığına ancak daha düşük RNA verimine yol açan sütun tabanlı RNA çıkarma yöntemini kullanın.
  8. Süpernatant çıkarın ve RNA peletini ilk homojenizasyon için kullanılan 1 mL RNA izolasyon çözeltisi başına% 75 etanol 1 mL ile yıkayın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 7.500 x g'da santrifüj.
  9. Etanol yıkamayı çıkarın ve 3-5 dakika boyunca kısa bir süre hava kuru rna pelet. Çözeltiyi bir pipet ucundan birkaç kez geçirerek ve 55-60 ° C'de 10-15 dakika kuluçkaya yatırarak RNA'yı 20 μL dietilpyrokarbonat (DEPC) arıtılmış suda çözün.
  10. Absorbansı 230 nm, 260 nm ve 280 nm (sırasıyla A230, A260 ve A280) olarak ölçün. 1.0'ın A260'ı 40 μg/mL RNA'ya karşılık gelir. 1,6-1,9 A260/A280 oranı beklenirken, kontaminasyon 1,6 < A260/A280 oranı ile sonuçlanır.
  11. 20 μL reaksiyon hacmi için ters transkriptaz (RT) reaksiyon karışımı hazırlayın. Karışım RT enzim karışımı, ribonikleaz inhibitörü, yardımcı protein, primerler, dNTP'ler, MgCl2, RNaz içermeyen su ve 0.4 μg RNA örneği içerir.
  12. Tüpün altındaki tüm bileşenleri karıştırmak için RT tüplerini kısaca santrifüjlayın.
  13. Numuneleri termosikler cihazına yerleştirin. RT için uygun programı seçin. RT'yi 25 °C'de 10 dakika çalıştırın, ardından 42 °C'de 120 dakika boyunca ters transkripsiyon adımı ve 85 °C'de 5 dakika boyunca ters transkriptazın devre dışı bırakılması, sonunda 4 °C'ye kadar soğutun.
  14. Elde edilen cDNA'yı Tris (hidroksimetil)aminometan (Tris)-etileniaminetetraasetik asit (EDTA) (TE) tamponu (1 mM EDTA ile 10 mM Tris) ile 100 μL cDNA çözeltisi başına RT için kullanılan 0,4 μg RNA nihai konsantrasyona seyreltin. CDNA örneklerini -20 °C'de saklayın.
  15. 10 μL reaksiyon hacmi kullanarak gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirin. Reaksiyon hacmi ana karışımı içerir (DNA polimeraz, urasil-DNA glikosilaz içerir, dUTP, pasif referans ve optimize tampon bileşenlerine sahip dNTP'ler), ileri astar 45 μM, ters astar 45 μM, prob 12,5 μM (probun 5' ucuna bağlı bir muhabir boyası, probun 3' ucunda küçük bir oluk bağlayıcısı ve probun 3' ucunda bir floresan olmayan quencher içerir) , 2 μL cDNA ve DEPC arıtıcı su.
  16. 2-ΔΔCT yöntemi19ile göreli niceleme için endojen bir denetim (RPLP0) çalıştırın.
  17. Yinelenenlere örnekler ekleyin ve cDNA yerine TE arabelleği ekleyerek şablon denetimi çalıştırmayın. PCR'yi standart koşullarda çalıştırın (50 °C'de 2 dk, 95 °C'de 10 dk, 95 °C'de 15 sn'lik 40 döngü ve 60 °C'de 1 dk).
  18. Karşılaştırmalı BT yöntemini izleyerek mRNA hedeflerinin göreli nicelemesini gerçekleştirin. Taban çizgisi örneğine normalleştirilen mRNA miktarı 2-ΔΔCTolarak hesaplanırken, ΔΔCT, numunenin ΔCT (CT hedefi- CT endojen kontrolü) ile taban çizgisi örneğinin ΔCT (CT hedefi ve CT endojen kontrolü) arasındaki farktır.

5. IVD ortamında protein içeriğinin ölçülmesi

  1. Ortamdaki protein içeriğini ölçmek için IVD örnekleri tarafından koşullandırılmış ortamı toplayın. Hedef proteinin protokolüne göre enzime bağlı immünorbent test (ELISA) gerçekleştirin.
  2. Sığır interlökin-8 (IL-8), üreticinin talimatına göre sığır karşıtı IL8 ELISA kiti ile ölçülür.

Sonuçlar

Düşük glikoz ortamında dejeneratif yükleme, TNF-α enjeksiyonu ile birlikte proinflamatuar belirteçlerin interlökin 6 (IL-6) ve interlökin 8 (IL-8) gen ekspresyonunun 4 günlük kültürden sonra NP hücrelerindeki fizyolojik kontrol grubuna göre önemli ölçüde artmasına neden oldu (Şekil 2). Buna karşılık, NP hücrelerinde proinflamatuar genler interlökin 1β (IL-1β) ve TNF-α için önemli değişiklikler gözlemlemedik (veriler gösterilmedi). Ayrıca, dejeneratif kült...

Tartışmalar

Burada dejeneratif ve inflamatuar IVDD'yi simüle etmek için ayrıntılı bir protokol sağladık. Bu protokol, disk üzerindeki yıkıcı etkilere yol açan enflamatuar yolların ayrıntılı muayeneleri için uygulanabilir. Ayrıca, protokol hastalığın ilerlemesinde rol oynayan umut verici terapötik hedefleri belirlemeye yardımcı olabilir.

Son zamanlarda gösterdik ki insan rekombinant TNF-α hem sığır hem de insan NP hücrelerinde iltihaplanmaya neden olabilir21<...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma AO Foundation ve AOSpine International tarafından desteklendi. Babak Saravi, Alman Omurga Vakfı ve Alman Osteoartrit Vakfı'ndan burs desteği aldı. Gernot Lang, Almanya Freiburg Üniversitesi Tıp Fakültesi İleri Klinisyen Bilim adamları için Berta-Ottenstein-Programı tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Bromo-3-chloropropane(BCP)Sigma-Aldrich, St. Louis, USAB9673
Ascorbate-2-phosphateSigma-Aldrich, St. Louis, USAA8960
Band sawExakt Apparatebau, Norderstedt, Germanymodel 30/833
BetadineMunndipharma, Frankfurt, Germany
Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISAKingfisher Biotech, St. Paul, USADIY1028B-003
Corning ITS PremixCorning Inc., New York, USA354350
DMEM high glucoseGibco by life technologies, Carlsbad, USA10741574
DMEM low glucoseGibco by life technologies, Carlsbad, USA11564446
Ethanol for molecular biologySigma-Aldrich, St. Louis, USA09-0851
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco by life technologies, Carlsbad, USAA4766801
Non-essential amino acid solutionGibco by life technologies, Carlsbad, USA11140050
Penicillin/Streptomycin(P/S)gibco by life technologies, Carlsbad, USA11548876
Phosphate Buffer Solution, tabletSigma-Aldrich, St. Louis, USAP4417
PronaseSigma-Aldrich, St. Louis, USA10165921001
PrimocinInvivoGen, Sandiego, USAant-pm-05
Pulsavac Jet Lavage SystemZimmer, IN,USA
TissueLyser IIQuiagen, Venlo, Netherlands85300
Streptavidinn-HRPKingfisher Biotech, St. Paul, USAAR0068-001
Superscript VILOInvitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA10704274
cDNA Synthesis KitApplied Biosystems by life technologies10400745
TaqMan Universal Master MixApplied Biosystems by life technologies
TNF-alpha, recombinant human proteinR&D systems, Minnesota, USA210-TA-005
TRI ReagentMolecular Research Center, Cincinnati, USATR 118
Tris-EDTA buffer solutionsigma-Aldrich, St. Louis, USA93283
Gene bIL-6Applied Biosystems by life technologiesCustom made probesPrimer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A
Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT
Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT
Gene bIL8Applied Biosystems by life technologiesBt03211906_m1
Gene bTNF-alphaApplied Biosystems by life technologiesCustom made probesPrimer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A
Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT
Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G
GENE bIL1betaApplied Biosystems by life technologiesCustom made probesPrimer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT
Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A
Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A
RPLP0Applied Biosystems by life technologiesBt03218086_m1

Referanslar

  1. Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
  2. Hoy, D., et al. Measuring the global burden of low back pain. Best Practice & Research Clinical Rheumatology. 24 (2), 155-165 (2010).
  3. Thiese, M. S., et al. Prevalence of low back pain by anatomic location and intensity in an occupational population. BMC Musculoskeletal Disorders. 15 (1), 283 (2014).
  4. Katz, J. N. Lumbar Disc Disorders and Low-Back Pain: Socioeconomic Factors and Consequences. The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 88, 21 (2006).
  5. Vlaeyen, J. W. S., et al. Low back pain. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 52 (2018).
  6. Khan, A. N., et al. Inflammatory biomarkers of low back pain and disc degeneration: a review: Biomarkers of disc degeneration and back pain. Annals of the New York Academy of Sciences. 1410 (1), 68-84 (2017).
  7. Kim, H. S., Wu, P. H., Jang, I. T. Lumbar Degenerative Disease Part 1: Anatomy and Pathophysiology of Intervertebral Discogenic Pain and Radiofrequency Ablation of Basivertebral and Sinuvertebral Nerve Treatment for Chronic Discogenic Back Pain: A Prospective Case Series and Review of Literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1483 (2020).
  8. Adams, M. A., Roughley, P. J. What is Intervertebral Disc Degeneration, and What Causes It. Spine. 31 (18), 2151-2161 (2006).
  9. Wu, P. H., Kim, H. S., Jang, I. T. Intervertebral Disc Diseases Part 2: A Review of the Current Diagnostic and Treatment Strategies for Intervertebral Disc Disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2135 (2020).
  10. Lurie, J. D., et al. Surgical Versus Nonoperative Treatment for Lumbar Disc Herniation: Eight-Year Results for the Spine Patient Outcomes Research Trial. Spine. 39 (1), 3-16 (2014).
  11. Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
  12. Ponnappan, R. K., et al. An organ culture system to model early degenerative changes of the intervertebral disc. Arthritis Research & Therapy. 13 (5), 171 (2011).
  13. O'Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animals Used in Disc Research to Human Lumbar Disc Geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
  14. Stannard, J. T., et al. Development of a whole organ culture model for intervertebral disc disease. Journal of Orthopaedic Translation. 5, 1-8 (2016).
  15. Li, Z., et al. Preclinical ex-vivo Testing of Anti-inflammatory Drugs in a Bovine Intervertebral Degenerative Disc Model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 583 (2020).
  16. Li, Z., et al. Development of an ex vivo cavity model to study repair strategies in loaded intervertebral discs. European Spine Journal. 25 (9), 2898-2908 (2016).
  17. Kazezian, Z., Li, Z., Alini, M., Grad, S., Pandit, A. Injectable hyaluronic acid down-regulates interferon signaling molecules, IGFBP3 and IFIT3 in the bovine intervertebral disc. Acta Biomaterialia. 52, 118-129 (2017).
  18. Caprez, S., Menzel, U., Li, Z., Grad, S., Alini, M., Peroglio, M. Isolation of high-quality RNA from intervertebral disc tissue via pronase predigestion and tissue pulverization. JOR Spine. 1 (2), 1017 (2018).
  19. Lopa, S., Ceriani, C., Cecchinato, R., Zagra, L., Moretti, M., Colombini, A. Stability of housekeeping genes in human intervertebral disc, endplate and articular cartilage cells in multiple conditions for reliable transcriptional analysis. European Cells & Materials. 31, 395-406 (2016).
  20. Lang, G., et al. An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2051-2061 (2018).
  21. Du, J., et al. Proinflammatory intervertebral disc cell and organ culture models induced by tumor necrosis factor alpha. JOR Spine. 3, 1104 (2020).
  22. Purmessur, D., Walter, B. A., Roughley, P. J., Laudier, D. M., Hecht, A. C., Iatridis, J. A role for TNFα in intervertebral disc degeneration: A non-recoverable catabolic shift. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 151-156 (2013).
  23. Walter, B. A., Likhitpanichkul, M., Illien-Junger, S., Roughley, P. J., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. TNFα Transport Induced by Dynamic Loading Alters Biomechanics of Intact Intervertebral Discs. PLOS One. 10 (3), 0118358 (2015).
  24. Gullbrand, S. E., et al. A large animal model that recapitulates the spectrum of human intervertebral disc degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (1), 146-156 (2017).
  25. Willems, N., et al. Safety of intradiscal injection and biocompatibility of polyester amide microspheres in a canine model predisposed to intervertebral disc degeneration: intradiscal application of pea microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (4), 707-714 (2017).
  26. Michalek, A. J., Buckley, M. R., Bonassar, L. J., Cohen, I., Iatridis, J. C. The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus. The Spine Journal. 10 (12), 1098-1105 (2010).
  27. Illien-Jünger, S., et al. The combined effects of limited nutrition and high-frequency loading on intervertebral discs with endplates. Spine. 35 (19), 1744-1752 (2010).
  28. Gantenbein, B., et al. Organ culture bioreactors--platforms to study human intervertebral disc degeneration and regenerative therapy. Current Stem Cell Research & Therapy. 10 (4), 339-352 (2015).
  29. Boubriak, O. A., Watson, N., Sivan, S. S., Stubbens, N., Urban, J. P. G. Factors regulating viable cell density in the intervertebral disc: blood supply in relation to disc height. Journal of Anatomy. 222 (3), 341-348 (2013).
  30. Maroudas, A., Stockwell, R. A., Nachemson, A., Urban, J. Factors involved in the nutrition of the human lumbar intervertebral disc: cellularity and diffusion of glucose in vitro. Journal of Anatomy. 120, 113-130 (1975).
  31. Beckstein, J. C., Sen, S., Schaer, T. P., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animal Discs Used in Disc Research to Human Lumbar Disc: Axial Compression Mechanics and Glycosaminoglycan Content. Spine. 33 (6), 166-173 (2008).
  32. Walter, B. A., Illien-Jünger, S., Nasser, P. R., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. Development and validation of a bioreactor system for dynamic loading and mechanical characterization of whole human intervertebral discs in organ culture. Journal of Biomechanics. 47 (9), 2095-2101 (2014).
  33. Rajan, N. E., et al. Toll-Like Receptor 4 (TLR4) Expression and Stimulation in a Model of Intervertebral Disc Inflammation and Degeneration. Spine. 38 (16), 1343-1351 (2013).
  34. vanden Akker, G. G., Rorije, A. J., Davidson, E. N. B., vander Kraan, P. M. Phenotypic marker genes distinguish inner and outer annulus fibrosus from nucleus pulposus tissue in the bovine intervertebral disc. Osteoarthritis and Cartilage. 25, 402 (2017).
  35. Du, J., et al. Functional cell phenotype induction with TGF-β1 and collagen-polyurethane scaffold for annulus fibrosus rupture repair. European Cells & Materials. 39, 1-17 (2020).
  36. Risbud, M. V., et al. Defining the phenotype of young healthy nucleus pulposus cells: recommendations of the Spine Research Interest Group at the 2014 annual ORS meeting. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 33 (3), 283-293 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 168intervertebral diskinflamasyonomurga3Rorgan k lt rdeneysel modeldisk dejenerasyonubiyoreakt r

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır