Un modèle pro-inflammatoire et dégénératif de culture d’organe pour simuler la maladie de disque intervertébral de tôt-étape.

Résumé

Ce protocole présente un modèle expérimental original de culture proinflammatory et dégénérative d’organe bovin pour simuler la dégénération intervertébrale de disque de tôt-étape.

Résumé

La dégénérescence symptomatique du disque intervertébral (IVD) (IDD) est un fardeau socio-économique majeur et se caractérise par une inflammation et une dégradation tissulaire. En raison du manque de thérapies causales, il est urgent de disposer de modèles expérimentaux novateurs de culture d’organes pour étudier les mécanismes impliqués dans la progression de la maladie, trouver des cibles thérapeutiques et réduire le besoin de modèles animaux. Nous présentons ici un nouveau, protocole tridimensionnel de modèle de culture d’organe imitant le microenvironnement proinflammatory et catabolique, qui est présent pendant IDD.

Au commencement, des IVDs caudaux bovins ont été disséqués, nettoyés, et cultivés dans le milieu de culture de tissu. La charge physiologique ou pathologique dynamique a été appliquée dans un bioréacteur fait sur mesure pendant 2 heures par jour. Des IVDs ont été assignés à un groupe témoin (milieu élevé de glucose, charge physiologique, injection saline phosphate-tamponnée) et à un groupe pathologique (milieu bas de glucose, charge pathologique, injection de facteur-alpha de nécrose tumorale) pendant quatre jours. L’analyse d’expression génique des cellules rassemblées de pulposus de noyau des IVDs et de l’analyse enzyme-liée d’immunosorbant des milieux conditionnés de culture d’organe a été exécutée.

Nos données ont indiqué une expression plus élevée des marqueurs inflammatoires et ont réduit des hauteurs de disque après chargement dans le groupe pathologique comparé au groupe témoin. Ce protocole est fiable pour simuler l’inflammation et la dégénérescence d’IVD et peut être encore élargi pour élargir son champ d’application.

Introduction

La lombalgie (LBP) peut affecter des personnes de tous âges et est l’une des principales causes d’invalidité dans le monde^1,2,3. Le coût total associé au LBP dépasse 100 milliards de dollars par an^4,5. La dégénérescence symptomatique du disque intervertébral (IVD) (IDD), une condition caractérisée par l’inflammation et la dégradation des tissus, est une cause majeure de LBP^6,7. Plus précisément, la DDI est caractérisée par une dégradation progressive de la mat....

Protocole

Les expériences ont été réalisées à l’aide de queues de bovins obtenues dans des abattoirs locaux. Les matières biologiques utilisées dans la présente étude sont extraites de la chaîne alimentaire et ne nécessitent aucune approbation éthique en droit suisse et européen.

1. Dissection du disque intervertébral bovin

1. Rincez soigneusement toute la queue avec de l’eau du robinet pour enlever la saleté et les poils à la surface.
   REMARQUE: Avec des extrémités distales intactes, un maximum de 9 IVD (coccygageal 1-9) par queue peut être utilisé pour les expériences en fonction de la taille souhaitée des IVDs. Compte tenu du diamètre sou....

Résultats

La charge dégénérative dans le milieu à faible teneur en glucose combinée à l’injection de TNF-α a provoqué une augmentation significative de l’expression génique des marqueurs pro-inflammatoires interleukine 6 (IL-6) et interleukine 8 (IL-8) par rapport au groupe témoin physiologique dans les cellules NP après 4 jours de culture(Figure 2). En revanche, nous n’avons pas observé de changements significatifs pour les gènes pro-inflammatoires interleukine 1β (IL-1β) et TNF-.......

Discussion

Nous avons ici fourni un protocole détaillé pour simuler l’IVDD dégénératif et inflammatoire. Ce protocole peut être appliqué pour des examens détaillés des voies inflammatoires menant aux effets destructeurs sur le disque. De plus, le protocole peut aider à déterminer des cibles thérapeutiques prometteuses impliquées dans la progression de la maladie.

Nous avons récemment montré que le TNF-α recombinant humain pouvait induire une inflammation dans les cellules NP bovines et .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Bromo-3-chloropropane(BCP)	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	B9673
Ascorbate-2-phosphate	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	A8960
Band saw	Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany	model 30/833
Betadine	Munndipharma, Frankfurt, Germany
Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA	Kingfisher Biotech, St. Paul, USA	DIY1028B-003
Corning ITS Premix	Corning Inc., New York, USA	354350
DMEM high glucose	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	10741574
DMEM low glucose	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	11564446
Ethanol for molecular biology	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	09-0851
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	A4766801
Non-essential amino acid solution	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	11140050
Penicillin/Streptomycin(P/S)	gibco by life technologies, Carlsbad, USA	11548876
Phosphate Buffer Solution, tablet	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P4417
Pronase	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	10165921001
Primocin	InvivoGen, Sandiego, USA	ant-pm-05
Pulsavac Jet Lavage System	Zimmer, IN,USA
TissueLyser II	Quiagen, Venlo, Netherlands	85300
Streptavidinn-HRP	Kingfisher Biotech, St. Paul, USA	AR0068-001
Superscript VILO	Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA	10704274
cDNA Synthesis Kit	Applied Biosystems by life technologies	10400745
TaqMan Universal Master Mix	Applied Biosystems by life technologies
TNF-alpha, recombinant human protein	R&D systems, Minnesota, USA	210-TA-005
TRI Reagent	Molecular Research Center, Cincinnati, USA	TR 118
Tris-EDTA buffer solution	sigma-Aldrich, St. Louis, USA	93283
Gene bIL-6	Applied Biosystems by life technologies	Custom made probes	Primer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT
Gene bIL8	Applied Biosystems by life technologies	Bt03211906_m1
Gene bTNF-alpha	Applied Biosystems by life technologies	Custom made probes	Primer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G
GENE bIL1beta	Applied Biosystems by life technologies	Custom made probes	Primer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A
RPLP0	Applied Biosystems by life technologies	Bt03218086_m1