Damlacık Arayüzü Bilayer'in Sıcaklık Kontrollü Montajı ve Karakterizasyonu

Özet

Bu protokol, yüksek erime sıcaklıklarına sahip lipitler için lipid monolayer montajını ve damlacık arayüzü bilayer oluşumunu teşvik etmek için geri bildirim sıcaklığı kontrollü bir ısıtma sisteminin kullanımını ve membrandaki sıcaklık odaklı değişiklikleri karakterize etmek için kapasitans ölçümlerini detaylandırıyor.

Özet

Lipid bilayerlerin montajı için damlacık arayüzü bilayer (DIB) yöntemi (örn. DİB'ler) yağdaki lipid kaplı sulu damlacıklar arasında diğer yöntemlere göre önemli faydalar sunar: DİB'ler kararlı ve genellikle uzun ömürlüdür, bilayer alanı ters yönde ayarlanabilir, broşür asimetrisi damlacık bileşimleri ile kolayca kontrol edilebilir ve doku benzeri çift katman ağları birçok damlacığın bitişik olmasıyla elde edilebilir. DiB'lerin oluşturulması, lipitlerin damlacıkların yüzeylerinde yüksek yoğunluklu lipid monolayerlere kendiliğinden bir şekilde bireyi gerektirmektedir. Bu, yaygın sentetik lipitler için oda sıcaklığında kolayca meydana gelse de, bazı hücresel lipit özleri de dahil olmak üzere oda sıcaklığının üzerinde erime noktalarına sahip lipitler için benzer koşullarda yeterli bir monolayer veya stabil iki katmanlı oluşmaz. Bu davranış, model membran çalışmalarındaKI DDB'lerin bileşimlerini ve belki de biyolojik alaka düzeyini sınırlamıştır. Bu sorunu gidermek için, DIB damlacıklarını barındıran yağ rezervuarını dikkatlice ısıtmak ve sıcaklığın lipid zarı üzerindeki etkilerini karakterize etmek için deneysel bir protokol sunulmaktadır. Özellikle, bu protokol, daha geniş bir lipit tipi kümesi için monolayer montajını ve bilayer oluşumunu iyileştiren yüksek sıcaklıkları reçete etmek için bir geri bildirim döngüsü tarafından kontrol edilen termal iletken alüminyum fikstürün ve dirençli ısıtma elemanlarının nasıl kullanılacağını göstermektedir. Zarın yapısal özellikleri ve bilayerden oluşan lipitlerin termotropik faz geçişleri, DIB'nin elektrik kapasitansındaki değişiklikler ölçülerek ölçülür. Birlikte, bu prosedür, çok bileşenli lipit karışımları için etkili bir erime sıcaklığı(T_M)belirlemek de dahil olmak üzere çeşitli sıcaklıklarda model membranlarındaki biyofiziksel olayların değerlendirilmesinde yardımcı olabilir. Bu özellik, model membranlarında doğal faz geçişlerinin daha yakın bir şekilde çoğaltilmesine izin verecek ve hücresel meslektaşlarının heterojenliğini daha iyi yakalayanlar da dahil olmak üzere daha geniş bir membran bileşenlerinden model membranların oluşumunu ve kullanımını teşvik edecektir.

Giriş

Hücresel zarlar, tüm canlı hücreleri kapsülleyen ve alt bölümlere ayıran binlerce lipit tip^1,protein, karbonhidrat ve sterolden oluşan seçici geçirgen bariyerlerdir. Kompozisyonlarının işlevlerini nasıl etkilediğini anlamak ve doğal ve sentetik moleküllerin hücresel zarlarla nasıl etkileşime girdiğini, bunlara nasıl yapıştığını, bozulduğunu ve yer değiştirmesini, bu nedenle biyoloji, tıp, kimya, fizik ve malzeme mühendisliğinde geniş kapsamlı etkileri olan önemli araştırma alanlarıdır.

Bunlar, hücresel karşılıklarının bileşimini, yapısını ve taşıma özelliklerini taklit eden sentetik veya doğal olarak oluşan lipitlerd....

Protokol

1. Isıtmalı fikstür hazırlığı

1. Genişlik ve uzunluk olarak 25 mm x 40 mm'ye kesilmiş 1 mm kalınlığında 2 adet yalıtımlı kauçuk toplayın, sırasıyla, 25 mm x 40 mm olan 6 mm kalınlığında bir kauçuğun 2 parçası, hazırlanmış bir alüminyum taban fikstür tertibatı ve alüminyum taban fikstürünün görüntüleme penceresine sığan akrilik bir yağ haznesi (imalat ve patlayan montaj görünümü hakkında ayrıntılar için S1, S2 ve S3 şekillerine bakın). Alüminyum fikstürü ilk olarak fikstürün altına UV kürlenebilir yapıştırıcılı bir cam kapaklı görüntüleme penceresi takarak ve fikstürün her 25 mm x 25 mm yan flanşının üstüne 1 dirençli ısıtma elemanı yapıştırarak....

Sonuçlar

Şekil 1, dib oluşumu için mikroskop aşamasında alüminyum fikstürün ve akrilik yağ rezervuarın nasıl hazırlandığını göstermektedir. Montaj adımları 1.2-1.4, fikstürü daha verimli ısıtma için sahneden termal olarak yalıtmaya yarar. 1.5-1.7 arası adımlar termokuplün fikstüre nasıl düzgün bir şekilde takılacağını ve yağ haznesinin nasıl konumlandırılacağını gösterir ve 1.8 -1.9 adımları bu parçalara yağ dağıtmak için önerilen yerleri gösterir.......

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol, DIB oluşturmak için kullanılan yağ ve damlacıkların sıcaklığını kontrol etmek için deneysel bir sistemin montajı ve işletilme talimatları sağlar. Özellikle RT'nin üzerinde erime sıcaklıklarına sahip lipitler kullanılarak DIB oluşumunu sağlamak için faydalıdır. Ayrıca, yağ rezervuarının sıcaklığını tam olarak değiştirerek, bilayer sıcaklığı, yüksek sıcaklıkların kapasitans, alan, kalınlık, indüklenmiş termotropik faz değişiklikleri, membran a.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2)	Any		Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2)	Any		Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid	Sigma Aldrich	M3183	Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate	Fabricated in house	HTD_STG_2	~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture	Fabricated in house	HTD_STG_1	Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements
Brain Total Lipid Extract	Avanti	131101C-100mg	25 mg/mL porcine lipid extract
Compact DAQ Chassis (cDAQ)	National Instruments	cDAQ-9174	Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ)	Molecular Devices	Digidata 1440A	High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply	Hewlitt Packard	HP 6826A	Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip	Corning	CLS284525	Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2)	Omega	KHLV-101/5	25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit.
M3 Stainless Steel Screw	McMaster Carr	90116A150	Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	AxoPatch 200B	Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer	Any		Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P3911	Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module	National Instruments	NI 9211	Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple	Omega	JMTSS-020U-6	U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive	Loctite	19739	Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module	National Instruments	NI 9263	Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator	Agilent	33210A	Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform