Montagem controlada por temperatura e caracterização de um Bilayer de interface de gotícula

Resumo

Este protocolo detalha o uso de um sistema de aquecimento controlado pela temperatura para promover a montagem de monocamadas lipídicas e a formação de bicamadas de interface de gotícula para lipídios com temperaturas elevadas de fusão e medidas de capacitância para caracterizar mudanças orientadas pela temperatura na membrana.

Resumo

O método de bicamadas de interface de gota (DIB) para a montagem de bicamadas lipídicas (ou seja, DIBs) entre gotículas aquosas revestidas de lipídios no óleo oferece benefícios importantes em relação a outros métodos: os DIBs são estáveis e, muitas vezes, a área bicamada de longa duração pode ser reversivelmente ajustada, a assimetria de folhetos é facilmente controlada através de composições de gotículas, e redes semelhantes a tecidos de bicamadas podem ser obtidas por muitas gotículas adjacentes. A formação de DIBs requer montagem espontânea de lipídios em monocamadas lipídicas de alta densidade nas superfícies das gotículas. Embora isso ocorra prontamente à temperatura ambiente para lipídios sintéticos comuns, uma monocamide ou bicamadas estáveis suficientes não se formam em condições semelhantes para lipídios com pontos de fusão acima da temperatura ambiente, incluindo alguns extratos lipídes celulares. Esse comportamento provavelmente limitou as composições — e talvez a relevância biológica — dos DIBs em estudos de membrana modelo. Para resolver esse problema, um protocolo experimental é apresentado para aquecer cuidadosamente o reservatório de óleo que hospeda gotículas DIB e caracterizar os efeitos da temperatura na membrana lipídica. Especificamente, este protocolo mostra como usar uma luminária de alumínio termicamente condutora e elementos de aquecimento resistivos controlados por um loop de feedback para prescrever temperaturas elevadas, o que melhora a montagem de monocamadas e a formação de bicamadas para um conjunto mais amplo de tipos lipídes. Características estruturais da membrana, bem como as transições de fase termotrópica dos lipídios que compõem a bicamada, são quantificadas medindo as alterações na capacitância elétrica do DIB. Em conjunto, este procedimento pode auxiliar na avaliação de fenômenos biofísicos em membranas modelo sobre várias temperaturas, incluindo a determinação de uma temperatura de fusão eficaz (T_M) para misturas lipídicas multicomponidais. Essa capacidade permitirá, assim, uma replicação mais próxima das transições de fases naturais nas membranas do modelo e incentivará a formação e o uso de membranas modelo a partir de uma faixa mais ampla de constituintes de membrana, incluindo aquelas que melhor captam a heterogeneidade de suas contrapartes celulares.

Introdução

As membranas celulares são barreiras seletivamente permeáveis compostas por milhares de lipídios^{tipos 1,}proteínas, carboidratos e esteróis que encapsulam e subdividem todas as células vivas. Entender como suas composições afetam suas funções e revelar como moléculas naturais e sintéticas interagem, aderem, interrompem e translocam membranas celulares são, portanto, áreas importantes da pesquisa com implicações de grande alcance na biologia, medicina, química, física e engenharia de materiais.

Esses objetivos para a descoberta se beneficiam diretamente de técnicas comprovadas para montar, manipular e estudar membranas....

Protocolo

1. Preparação aquecida da luminária

1. Reúna 2 peças de borracha isolante de 1 mm de espessura aparadas a 25 mm x 40 mm de largura e comprimento, respectivamente, 2 peças de borracha de 6 mm de espessura que também são de 25 mm x 40 mm, um conjunto de luminárias de alumínio preparadas e um reservatório de óleo acrílico que se encaixa na janela de visualização da luminária base de alumínio (ver Figuras S1, S2 e S3 para detalhes sobre a fabricação e uma visão explodida de montagem). Prepare a luminária de alumínio primeiro anexando ao fundo da luminária uma janela de visualização de tampas de vidro com adesivo curável UV e aderindo 1 elemento de ....

Resultados

A Figura 1 mostra como a luminária de alumínio e o reservatório de óleo acrílico são preparados no estágio do microscópio para a formação de DIB. As etapas de montagem 1.2-1.4 servem para isolar termicamente a luminária do palco para um aquecimento mais eficiente. As etapas 1.5-1.7 mostram como fixar adequadamente o termopar à luminária e posicionar o reservatório de óleo, e as etapas 1.8 -1.9 mostram locais recomendados para a distribuição de óleo nessas peças.

Discussão

O protocolo aqui descrito fornece instruções para a montagem e operação de um sistema experimental para controlar a temperatura do óleo e gotículas usadas para formar DIBs. É especialmente benéfico para permitir a formação de DIB usando lipídios que têm temperaturas de fusão acima de RT. Além disso, variando precisamente a temperatura do reservatório de óleo, a temperatura bicamada pode ser manipulada para estudar os efeitos das temperaturas elevadas em várias propriedades e características da membrana,.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2)	Any		Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2)	Any		Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid	Sigma Aldrich	M3183	Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate	Fabricated in house	HTD_STG_2	~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture	Fabricated in house	HTD_STG_1	Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements
Brain Total Lipid Extract	Avanti	131101C-100mg	25 mg/mL porcine lipid extract
Compact DAQ Chassis (cDAQ)	National Instruments	cDAQ-9174	Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ)	Molecular Devices	Digidata 1440A	High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply	Hewlitt Packard	HP 6826A	Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip	Corning	CLS284525	Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2)	Omega	KHLV-101/5	25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit.
M3 Stainless Steel Screw	McMaster Carr	90116A150	Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	AxoPatch 200B	Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer	Any		Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P3911	Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module	National Instruments	NI 9211	Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple	Omega	JMTSS-020U-6	U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive	Loctite	19739	Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module	National Instruments	NI 9263	Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator	Agilent	33210A	Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform