Yüzey Plazmon Rezonansı ile Antiviral Ajanların Mühendisliği

Özet

Mevcut protokol, HA, S glikoproteini, ilgili hibrid tip glikanlar ve yüksek mannoz oligosakkaritlerine CV-N bağlanmasını incelemek için SPR bağlanma testleri için yeni araçları açıklamaktadır. SPR, bu glikanlara dimerik veya monomerik CV-N'yi bağlamak için K_D'yi belirlemek için kullanılır.

Özet

Yüzey plazmon rezonansı (SPR), etki alanı ile değiştirilen Siyanovirin-N (CV-N) DIMERINE HEMAGLUTININ (HA) BAĞLANMASıNı ÖLÇMEK VE MANNOSILLENMIŞ PEPTITLER ILE CV-N'nin yüksek afiniteli bağlanma bölgesi arasındaki etkileşimleri izlemek için kullanılır. Virüs zarfı sivri uçları gp120, HA ve Ebola glikoprotein (GP) 1,2'nin dimerik CVN2 üzerinde hem yüksek hem de düşük afiniteli bağlanma bölgelerine bağlandığı bildirilmiştir. Dimannosile HA peptidi ayrıca iki düşük afiniteli bağlanma bölgesinde, ilgili ligand için yüksek afiniteli bir bölge taşıyan ve karbonhidrat bağlayıcı cepteki stabilize edici bir disülfür bağının yerini almak için mutasyona uğrayan ve böylece çok değerli bağlanmayı doğrulayan mühendislik ürünü bir CVN2 molekülüne bağlanır. HA bağlanması, oligomerizasyon yoluyla insan immün yetmezlik virüsü tip 1'i (HIV-1) daha da nötralize eden 275 nM'lik bir ayrışma sabitinde (K_D) psödo-antikor CVN2'nin yüksek afiniteli bir bağlanma bölgesine gösterilmiştir. Alan değiştirilmiş CVN2'deki disülfür köprülerinin sayısının ilişkilendirilmesi, sistinlerin polar kalıntı çiftleri glutamik asit ve arginin ile değiştirilmesiyle 4'ten 2'ye düşürülür, bu da HA'ya bağlanma afinitesinin azalmasına neden olur. En güçlü etkileşimler arasında, Ebola GP1,2, transmembran alanı olmayan zarf glikanını kullanarak alt nanomolar aralıkta iki yüksek afiniteli bağlanma bölgesi olan CVN2 ile bağlanır. Bu çalışmada, multispesifik monomerik CV-N'nin şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) başak (S) glikoproteinine bağlanması, nanomolar K_D ile karşılaştırıldığında diğer virüs sivri uçlarına kıyasla K_D = 18.6 μM'de ve orta μ-molar aralığındaki reseptör bağlama alanı aracılığıyla ölçülmüştür.

Giriş

Teterin ile ilişkili antiviral aktivite, interferon α tarafından indüklenir ve enfekte hücre yüzeylerinde tam olarak oluşturulmuş viryonların tutulmasına yol açan protein bazlı tetherleri içerir¹. Virüs salınımının inhibisyonunda tetherin glikozilasyonun gerekliliği belirsizliğini korumaktadır, bu da in vitro çalışmalar için rekombinant olarak eksprese edilen glikanlar üzerinde glikozilasyon paternlerinin önemini ima etmektedir^1,2, (influenza virüsü durumunda) yüzeyde eksprese edilen influenza hemaglutinin HA ^3,4'ün konformasyonuna bağlıdır. . N'ye bağlı glikozilasyona bağlı oligosakkaritin modifikasyonunun, HIV tip-1 salınım^2'nin tetherin aracılı kısıtlaması için yeterli olduğu, dimerizasyonun virüs salınımını önlemede önemli bir rol oynadığı, böylece tomurcuklanan viryonları bağlamak için transmembran alanını veya glikozil-fosfatidil-inositol (GPI)-çapayı içerdiği belirtilmiştir⁵ . İnsan ve murin tetherininin birden fazla zarflı virüsü, retrovirüsleri ve filovirüsleri bloke etmesi için benzersiz özellikler tanımlanmıştır. BST-2 / tetherin, doğuştan gelen bağışıklık 1,6'nın interferon ile indüklenebilen bir antiviral proteinidir^, geniş spektrumlu antiviral aktivite ile etki eder ve tetherini translokasyona sokmak veya tetherin ^6'nın yapısını bozmak için zarf glikoproteinleri⁵ tarafından antagonize edilir. Örneğin, influenza A virüsü üzerinde yüzeyde eksprese edilen zarf glikoprotein HA ve nöraminidaz tetherin antagonizması için suşa özgü bir şekilde^{iyi bilinir 7}, konakçı reseptör bağlanma bölgelerinin tanınmasını kolaylaştırır⁸. Glikan hedefleme antikorları, HA üzerindeki hızla özelleştirilen glikan kalkanları ile etkileşimlerinin stokiyometrisinde incelenmiştir, bu da influenza A H3N2 ve H1N1 alt tiplerine bağlanma afinitesi ile sonuçlanır⁴.

Antiviral ajanlar ile virüs zarfı sivri uçları, yani karbonhidrat ligandları ve tamamlayıcı immünolojik ve spektroskopik yöntemler arasındaki bağlanma mekanizmalarını aydınlatmak için mono-, di- ve tri-mannoz moieties kimyasal olarak sentezlenir. Mannosillenmiş peptitler, glikozil {beta}-perasetatların azido glikozilasyonu yoluyla 1,2-trans glikozil azid transformasyonu^9'a kadar oluşturulur ve tipik olarak bulunan N-asetil glukozamin ve hayatı tehdit eden virüslerin yüzeyinde yüksek mannoz oligosakkaritlerini taklit eder. Triazol biyoisosterleri, HA peptid^10'un mannosillenmiş kalıntısını oluşturan bağlantıları taklit etmek ve HA kafa alanındaki ikinci N-bağlantılı glikozilasyon noktası etrafında antiviral CV-N türevleri ile bölgeye özgü etkileşimleri kolaylaştırmak için kullanılır (4 N-bağlantılı glikan N54, N97, N181, N301 ile HA tepesi)8,11,12 . Glutamik asit (Glu) ve arginin (Arg) ve sonuçta ortaya çıkan sarmal dipol arasındaki etkileşimler, hem model peptitlerin hem de proteinlerin iyi stabilitesini göstermiştir, ancak SPR kullanılarak görselleştirilmiştir. Glikan moietilerine reseptör bağlanmasını doğrudan inhibe ederek HA¹⁰ üzerinde kimyasal olarak sentezlenmiş tek bir glikozilasyon bölgesini tanımakla karşılaştırılırsa, dört bölgeli mutasyona uğramış bir Fc yapısının reseptörüne daha yüksek bir afinitesinin in vivo olarak efektör fonksiyonlarını ortaya çıkardığı ve Fc mutantına bağlı N-bağlı glikanların ilgisiz bileşiminin mekanik olarak belirlendiğini ortaya koyduğu gösterilmiştir¹³.

CV-N, HIV 14,15, influenza¹⁶ ve Ebola virüsüne karşı antiviral aktivite gösterir; bu, zarf başak proteinleri^12,17,18,19 üzerindeki yüksek mannoz oligosakkarit modifikasyonlarına nanomolar bağlanmanın aracılık ettiği bir durumdur. CV-N'de bir yüksek afiniteli karbonhidrat bağlanma bölgesine (H) veya kovalent olarak bağlı dimerik CVN2'de iki Hs'ye bağlanan influenza HA'nın sırasıyla denge ayrışma sabitlerine (K D) = 5.7 nM (Şekil 1A) ve K_D = 2.7 nM'ye sahip olduğu belirlenmiştir. Hem CV-N hem de CVN2, bir veya iki düşük afiniteli karbonhidrat bağlama bölgesini (L)^12,17,20,21 olarak barındırır. Ebola GP1,2, CVN2'nin 2H'sine alt nanomolar aralıkta (K_D = 26 nM) afinitelerle bağlanır. Ebola GP1,2 ve HA'ya bağlanan CV-N WT, K_D = 34 nM'den K_D = 5.7 nM'ye (A / New York / 55/04) ¹² arasında yakınlıklar gösterir. Özellikle viral zarflar üzerindeki yüksek mannoz glikanlarını hedef alan CV-N gibi lektinler, hepatit C virüsü, SARS-CoV, herpes virüsü, Marburg virüsü ve kızamık virüsü^22'nin replikasyonunu daha da inhibe eder.

Küçük CV-N molekülü, viral girişi inhibe etmek için çok çeşitli virüsleri bağlamak için işlevselleştirildiği için 20 yıldan fazla bir süredir kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır^16,18. Yapısal analizler ve bağlanma afinite testleri, viral zarf glikoproteinlerine olan tutkuyu arttırmak için mikromolar aralıkta iki valan bağlanma ile alan değiştirilmiş bir CVN2 dimerindeki iki ^L'nin çapraz bağlandığını göstermektedir^10,19. Manα1-2Manα'nın Man(8) D1D3 kolları ve Man(9) üzerindeki seçici bağlanması, karşıt protein protomerleri²⁰ üzerinde bulunan farklı afinitelerin iki bağlanma bölgesini içerir ve böylece nanomolar bağlanma afinitelerine ulaşır (Şekil 1B). Bu nedenle, CVN2, virüs nötralize edici antikorlara benzer şekilde, HIV gp120 üzerindeki epitopları bağlamak için uygulanmasıyla ilgili olarak psödo-bir^antikor olarak kabul edilir. Burada yazar, CVN2'nin reseptör bağlama alanı (RBD) aracılığıyla SARS-CoV-2 spike'ına potansiyel bağlanmasını araştırmakla ilgilenmektedir. İmmobilize insan anjiyotensin dönüştürücü enziminin (ACE)-2'nin SARS-CoV-2 RBD ile bağlanma eğrileri, biyolojik olarak ilgili bu bağlanma etkileşimi için K_D = 4.7 nM ile sonuçlanır²³.

Buna karşılık, seçilen immünoglobulin sınıfları, membrana implante HA bölgelerinde afinite olgunlaşması için bir substrat veren spesifik ve tutarlı yapısal protein paternlerini tanır²⁴. CV-N, hemen hemen tüm influenza A ve B virüsleri^16'da oldukça güçlü aktivite gösterir ve geniş ölçüde nötralize edici bir antiviral ajandır. HA1 ve HA2'nin gövdesi üzerinde, muhtemelen yüksek oranda nötralize edici antikorlarla glikan hedefleme için epitopik yapıları içeren ve lektin bağlayıcı²⁵ ile karşılaştırıldığında, hedeflenen epitopların yeri hakkında bilgimiz eksiktir.

Şekil 1: CV-N için SPR bağlanma testinin virüs zarfı sivri uçlarına şematik gösterimi. (A) CVV-N'nin ligandaya bağlanması için SPR Testi: HA tam uzunlukta protein (90 kDa). Kinetik veri seti (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM) influenza HA A/New-York/55/04 (H3N2) ile gerçek zamanlı çift referanslı bağlanmayı göstermektedir. (B) CVN2L0 varyantı V2, 500 nM ila 16 μM konsantrasyon aralığında hareketsiz ligand DM'ye bağlanır. H kalıntıları gri renkle vurgulanır. E58 ve R73, vahşi tip proteindeki sisteinlerin yerine geçer ve V2'yi dört disülfür bağı yerine üç ile kararlı bir protein kıvrımı yapar Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Membran-distal HA üst kısmındaki glikan kalkanı CV-N 12'ye yüksek afiniteli bağlanmayı indüklerken, HA üst kısmının disülfür köprüsüne bitişik olarak HA'ya bağlanan CVN2, düşük afiniteli bölgelerinde^10,12'de daha fazla gözlenmiştir. CV-N ile karbonhidrat bağlanmasında çeşitli polar etkileşimler ve etkileşim bölgeleri tanımlanmıştır. Bu etkileşimler, bağlanma afinitelerini in siliko öngörülen glikozilasyon¹² ile ilişkilendirmek için bağlanma bölgesinde nakavt varyantları üretilerek doğrulanır. Bu nedenle, proje, bağlanma afinitesi ve özgüllüğünde daha önce test edilmiş kimyasal olarak mannosillenmiş HA peptidlerini, SARS ile ilişkili 2019-nCoV sivri uçlarından ve SARS-CoV-2'den elde edilen kısa peptid dizileri ile karşılaştırmayı amaçlamaktadır. doğal olarak az sayıda farklı N-bağlı glikozilasyon bölgesi ve O'ya bağlı glikozilasyon ile modifiye edilmiştir. Kriyo-elektron mikroskobu ve bağlayıcı testler kullanarak, Pinto ve meslektaşları, Sarbecovirus alt cinsi içinde korunmuş bir glikan içeren SARS-CoV-2 spike proteini üzerindeki bir epitopu potansiyel olarak tanıyan bir monoklonal antikor olan S309'u rapor^ettiler. Bu çalışmanın protokolü, CV-N ve CVN2'nin SPR teknolojisi^10,12 kullanılarak glikozile proteinlere ve sentetik mannosillenmiş peptitlere nasıl bağlandığını incelemek için CV-N varyantlarının tasarlanması^, eksprese edilmesi ve karakterize edilmesinin ne kadar önemli olduğunu açıklamaktadır^.

Tandem bağlantılı dimer CVN2L0²⁷ ve bağlanma yeri varyantları (V2-V5) rekombinant olarak eksprese edilir ve varyantlar disülfit bağ replasmanları (C58E ve C73R) ile birlikte (Şekil 2A). Ayrıca, tek noktalı mutasyon E41A'ya sahip bir mutant hazırlanır, çünkü bu pozisyon moleküller arası çapraz temas kalıntısı olarak görülmüştür. Bu mutant, lektin ve yüksek mannoz oligosakkaritler arasındaki SPR bağlanma ölçümleri için bağlanma alanlarını deşifre eden ve dimerik form ile karşılaştırmaya izin veren bir başka ilginç moleküldür. CVN2'nin etki alanı ile değiştirilen kristal yapısı, 49 ila 54 kalıntı arasında uzanan esnek bir bağlayıcı gösterir. İki alan, menteşe etrafında katı cisimler olarak hareket etmeye devam edebilir, ya molekül içi etki alanı etkileşimleri yoluyla bir monomer geliştirebilir (alan A -kalıntıları 1-39; 90-101- B alanı -kalıntıları 40-89 ile) ya da moleküller arası etki alanı [etki alanı A (ilk monomerin) B alanı (ikinci) ile ve B alanı (ilk monomerin) A alanı (ikinci kopyanın) ile] değiştirilerek bir dimer geliştirir. İki protomerin A ve B alanları arasında, Glu41²⁸ hariç, yakın bir etkileşim yoktur. CV-N geni, 40-mer sentezlenmiş oligolar²⁹ ile tekrarlayan bir PCR yöntemi kullanılarak geliştirilebilir ve daha sonra Keeffe, J.R.27 tarafından tanımlandığı gibi elektroremejyen hücrelere transformasyon (elektroporasyon) için pET11a'nın NdeI ve BamHI bölgelerine alt klonlanır. İlgili kristal yapıya (PDB ID 3S3Y) ulaşmak için kullanılan protein, bir N-terminal 6-histidin saflaştırma etiketi ve ardından bir Faktör Xa proteaz bölünme bölgesi içerir. Bölgeye yönelik mutagenez, nokta mutasyonları yapmak, kodonları değiştirmek ve amino asit değişimi için tek veya çoklu bazlar veya kodonlar eklemek veya silmek için kullanılır. Bu dönüşümler, protein fonksiyonu ve yapısı hakkında paha biçilmez bir fikir verir. Rekombinant olarak eksprese edilen ve saflaştırılan CV-N, CVN2 ve CVN3, biyofiziksel olarak iyi çalışılmış^20,21,27, üretilmesi ucuzdur ve bu nedenle SPR sensör çipleri üzerine hareketsiz hale getirilmiş glikanlara bağlanma tahlillerini karakterize etmek için kullanılmıştır. Konvansiyonel enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA), glikan ligandlarının immobilizasyon tekniği ile ilgili daha az tekrarlanabilirlik sağlar ve SPR için gösterilen çeşitli bağlanma yeri varyantlarının gerçek zamanlı bağlanmasını son nokta analizlerine dönüştürür.

Bağlanma-afinite varyantı CVN2L0-V2 (disülfit köprü ikamesi¹⁰ ile homodimerik CV-N'nin sağlam bir kıvrımı), Escherichia coli'de (E. coli) bir His-etiketi ile ifade edilir, afinite kromatografisi uygulayan Ni-NTA sütunu üzerinde saflaştırılır ve HA'ya (H3N2) bağlanma için test edilir, monomannosillenmiş HA-peptid ve SPR kullanılarak dimannosile HA-peptid. Kimyasal olarak mannosile edilmiş peptitler veya HA ve S proteini, hepsi hidrofilik çip yüzeyine bağlanmış ligandlar ve amindir. reaktif esterler veya biotin-streptavidin protein mühendisliği yoluyla. Aynı sıralı çalışma prosedürü^{, aşağıda açıklandığı} gibi moleküler etkileşim analizleri için kinetik bilgi elde etmek için çeşitli CV-N seyreltimleri ve CV-N (ve CVN2) varyantları enjekte edilen bu ligandlara uygulanır. RBD-immobilize SPR sensör çipi, CV-N'den S peptidlerine bağlanma çalışmaları için kullanılır ve afiniteler, insan ACE2 ile SARS-CoV-2 bağlanmasıyla karşılaştırılır.

Protokol

Bu çalışmada, enzime bağlı immünosorbent tahlillerinde CV-N yerine CVN-küçük ubikitin benzeri modifiye edici (SUMO) füzyon proteini kullanılmıştır ve hücre bazlı tahliller için uygundur. Rekombinant tam uzunlukta influenza A virüsü HA H3 proteini ticari olarak elde edilir ( bakınız Malzeme Tablosu) veya standart protokollere göre memeli HEK293 hücre hatları ve bakülovirüs ile enfekte böcek hücrelerinde eksprese edilir¹². Wuhan-1 spike proteini, memeli HEK293 hücrelerinde eksprese edilir. Monomannosillenmiş peptid (MM) ve dimannosile peptid (DM) sentezi, CVN2 ve monomannosillenmiş küçük molekül^10'a homojen ligandların saptanmasını sağlar.

1. CV-N yapıları oluşturma

1. CVN2 varyantlarının ve CVN2L0 proteininin (PDB ID 3S3Y) her biri için , ticari kaynaklardan bir N-terminal pelB lider dizisi ve pET27b (+) vektöründe His-etiketi ile gen yapısını elde edin (bkz.
2. CVN2L0 ve varyantlarını (V2, V3, V4 ve V5; Şekil 2A,C) her CV-N tekrarı için iki ayrı DNA dizisinden oluşan CVN2L0 şablon geninin arka planında.
3. Liyofilize plazmid DNA'sını steril deiyonize damıtılmış suda (ddH₂O) 100 ng / μL'lik bir son konsantrasyona kadar çözün.

2. Plazmid DNA'sına dönüştürülmüş hücrelerle LB-agar plakalarının hazırlanması

1. ddH₂O'da 10 g / L pepton, 5 g / L maya ekstraktı ve 5 g / L NaCl çözerek kültür ortamı LB-Lennox hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu) ve pH'ı 7.4'e ayarlayın. Daha önce yayınlanmış bir rapor 10'u takiben kimyasal yöntemle her varyant (V2-V5) için yetkin E. coli BL21'e (DE3) dönüşümü gerçekleştirin.
2. Çözeltiyi (900 μL ve 100 μL) bölün, LB-agar plakalarına (50 μg / mL kanamisin) 100 μL aktarın ve nazikçe steril bir hücre dağıtıcı kullanın. Agar plakalarını gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.

3. Klonlama

1. CV-N genini, referans^27'yi takiben elektroremejman hücrelere transformasyon (elektroporasyon) için pET11a'nın NdeI ve BamHI bölgelerine (bakınız Malzeme Tablosu) alt klonlayın.

4. Sahaya yönelik mutagenezi

1. Her CV-N tekrarı için iki ayırt edici DNA dizisi içeren bir CVN2L0 şablon geninin arka planında CVN2L0²⁹ ve mutant CVN-E41A üretmek için²⁷.
2. PCR^31'i çalıştırmak için bölgeye yönelik bir mutagenez kiti (bakınız Malzeme Tablosu) ve spesifik mutajenik primerler 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' ve 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' kullanarak mutasyonlar yapın.
   1. 5-50 ng arasında değişen çift sarmallı DNA (dsDNA) şablonunun çoklu konsantrasyonlarını kullanarak bir dizi örnek reaksiyonu başlatın (örneğin, 5, 10, 20 ve 50 ng dsDNA şablonu). Astar konsantrasyonunu sabit tutun.
      NOT: PCR karışımı ve termal döngü protokolü genellikle sahaya yönelik mutagenez kiti³² kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi kullanılır.
3. Dpn I kısıtlama enzimini (1 μL, 10 U/μL , bkz. Reaksiyonları iyice ve nazikçe karıştırın, 1 dakika boyunca masa üstü bir mikrosantrifüjde döndürün ve ebeveyn süper sarmal dsDNA'yı sindirmek için 1 saat boyunca 37 ° C'de hemen inkübe edin.

5. Bakteriyel hücrelerin dönüşümü

1. XL1-Blue süper yetkin hücreleri (bakınız Malzeme Tablosu) yavaşça buz üzerinde çözün. Her kontrol ve numune reaksiyonunu dönüştürmek için, süper yetkin hücreleri (50 μL) önceden soğutulmuş bir polipropilen yuvarlak tabanlı tüpe (14 mL) alikot edin.
   1. Her kontrol ve numune reaksiyonundan (mutasyona uğramış ssDNA) Dpn I ile muamele edilmiş tek sarmallı DNA'nın (ssDNA) 1 μL'sini, tamamlayıcı ipliği sentezleyen süper yetkin hücrelerin alikotlarını ayırmak için aktarın. Reaksiyonları 30 dakika boyunca buz üzerinde karıştırmak ve inkübe etmek için dönüşüm reaksiyonlarını dikkatlice döndürün.
      NOT: Dpn I ile muamele edilmiş DNA'yı transformasyon reaksiyonuna aktarmadan önce, kalan mineral yağların pipet ucundan dikkatlice çıkarılması önerilir. İsteğe bağlı bir kontrol olarak, XL1-Blue süper yetkin hücrelerin dönüşüm verimliliğinin, pUC18 kontrol plazmidinin (1 μL) 0,1 ng / μL'si ile süper yetkin hücrelerin 50 μL'lik bir alikotunun karıştırılmasıyla kontrol edilmesi gerekir.
2. 45 s boyunca 42 ° C'deki dönüşüm reaksiyonlarına ısı darbesi uygulayın ve ardından reaksiyonları 2 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin.
   NOT: Uygulanan ısı darbesi, polipropilen yuvarlak tabanlı borularda (14 mL) belirtilen koşullar için zaten optimize edilmiştir.
3. 0,5 mL NZY+ et suyu (litre başına: 10 g NZ amin (kazein hidrolizat), 5 g maya ekstresi, 5 g NaCl, 12,5 mL 1 M MgCl 2, 12,5 mL 1 M MgSO₄, 10 mL 2 M glikoz, pH 7,5 ve₄₂ °C'ye önceden ısıtılmış) ekleyin ve dönüşüm reaksiyonlarını 37 °C'de 1 saat boyunca 225-250 rpm'de çalkalayarak inkübe edin. LB-ampisilin agar plakaları üzerindeki her bir transformasyon reaksiyonunun doğru hacmini (kontrol plazmid dönüşümünden 5 μL; numune dönüşümünden 250 μL) plakalayın.
   NOT: Transformasyon kontrolleri ve mutagenez için, 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid (X-gal, 80 μg / mL) ve izopropil-1-tiyo-β-D-galaktopiranosid (IPTG, 20 mM) içeren LB-ampisilin agar plakaları üzerindeki hücreleri yayınlayın (bkz. Hücre kültürlerinin 50 mL'sini dönüştürülmüş E'nin tek bir kolonisi ile aşılayın. Mutasyona uğramış plazmid DNA'sını saflaştırmak için coli hücreleri. Mutagenez, harici bir tesiste DNA dizilimi ile doğrulanır.

6. İfade ve protein saflaştırma

1. Büyük ölçekli bir kültür için, dönüştürülmüş plakadan tek bir koloni ile az miktarda LB (ampisilin içeren) aşılayın.
2. Gece kültürünü kullanarak, ekspresyon kültürünü 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄ ve 20 mM glikoz gibi katkı maddeleri ile aşılayın ve tohum kültürünü 1/100'e seyreltin.
   1. 37 ° C'de kuvvetli sallanan hücreleri büyütün. Hücreleri 20 ° C'ye soğutmadan önce hücreleri 0.4-0.6 (orta log fazı) arasında bir Abs 600 nm'ye kadar büyütün. 1 mM IPTG ile indükleyin ve bir gecede büyüyün.
   2. Daha sonra, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüj yaparak hücreleri toplayın ve süpernatantı bir pipetle atın.
3. Hücre peletini fosfat tamponlu salin (PBS) tamponunda yeniden askıya alın ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca 4.000 x g'de yeniden santrifüj yapın. Ardından, süpernatantı bir pipetle atın. Kalan peleti 10 mL lizis tamponunda yeniden askıya alın ve süspansiyonu 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin.
   NOT: Lizis tamponunun bileşimi: (50 mM NaH 2 PO₄, 300 mM NaCl, %2 Triton-X100, 500 ng/mL lizozim, 1 mM fenilmetilsülfonilflorür (PMSF), 1 mM ditiyotreitol, 1 mM MgCl₂, pH 8, bkz.
   1. Karışımı iki donma-çözülme döngüsüne (-80 °C) maruz bırakın. Çözünür ve çözünmeyen fraksiyonları, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüjleme ile ayırın ve poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE), özellikle sodyum dodesil sülfat (SDS)-PAGE³³ (Şekil 2B, C) kullanarak analiz edin.
      NOT: Hücreler, donma-çözülme, sonikasyon, homojenizasyon, enzimatik lizis veya bu yöntemlerin bir kombinasyonu gibi çeşitli şekillerde lize edilebilir. Yüksek protein verimi toplamak için inklüzyon cisimciklerinden saflaştırma önerilir²⁶.
4. Ni-NTA kolon kromatografisini kullanarak proteinleri saflaştırın (bakınız Malzeme Tablosu). Çözünür fraksiyonu rejenere edilmiş bir Ni-NTA boncuk sütununa (1 mL/dak) yükleyin. Bir gradyanı başlatmadan (60 dakika boyunca TBS'de% 0-100 500 mM imidazol) ve fraksiyonları (1 mL / dak) toplamadan önce sistemi TBS tamponu (50 mM Tris, 150 mM sodyum klorür, pH 7.5) ile yıkayın. Biyokimyasal karakterizasyon için saflaştırılmış proteinleri 100 mM PBS'ye karşı diyalize edin (Şekil 2C,D).
5. Alternatif olarak, sırasıyla 20 mM imidazol ve²⁵⁰ mM imidazol içeren tampon çözeltilerde etiketli rekombinant olarak eksprese edilen CV-N'yi bağlamak ve yeniden askıya almak için 14 mL tüplerde His-Select Ni 2+ afinite jeli ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın. Toplu halde en az 30 dakika inkübe edin.
   NOT: Bu yarı saflaştırılmış proteinleri, tampon değişimi ve biyolojik numunelerin, örneğin immobilize metal afinite kromatografisinden 1-1,5 mL elüat yükleyebilen karbonhidratların ve proteinlerin temizlenmesi için tek kullanımlık önceden paketlenmiş bir kolona uygulayın.
6. Protein çözeltilerini 10 kDa kesme filtreli santrifüjleme tüplerine aktarın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 4.500 x g ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüj yaparak konsantre edin. SPR ölçümleri için, analit çözeltilerini 10 mM HEPES, 150 mM sodyum klorür, 3 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA ) ve %0,05 Tween20, pH 7,4 (HBS-EP(+), bkz.
   1. Bu SPR çalışma tamponunu 1:10 seyreltme faktörüne ekleyin ve 4.500 x g ve 4 °C'de 10 dakika boyunca başlangıç hacmine dört kez santrifüj yapın.
7. 23.474^Da 34 büyüklüğünde bir boyut gösteren CVN2L0 ana proteini için hesaplanan yok olma katsayısına (20.440 ^{M-1 cm-1}) dayanan bir NanoDrop ^UV-Vis spektrofotometresi (Malzeme Tablosu'na bakınız) kullanarak 280 nm'deki protein konsantrasyonunu belirleyin. PBS (100 mM, pH 7.0) veya SPR tamponunu boş olarak kullanın ve protein konsantrasyonunu üç seyreltme adımında (1:1, 1:10 ve 1:100) ölçün.

Şekil 2: CV-N dizileri ve ekspresyonu . (A) Her CV-N tekrarı (her biri 101 amino asit) ile dört disülfit köprüsü arasında bir bağlayıcı olmadan CVN2, E'de pET11a vektöründe ifade edilir. coli. (B) CV-N (monomer) ve CVN2 (dimer) için iki bağımsız koloninin ifadeleri. (C) Disülfür bağ varyantları SDS-PAGE üzerinde saflaştırılır ve analiz edilir. Referans olarak düşük moleküler ağırlıklı bir belirteç (6 μL) kullanılır. WT = CVN2L0, (A) ile işaretlenmiş dört disülfür köprüsü taşır. V2, 58 ve 73 pozisyonlarındaki polar kalıntılarla disülfür bağının değiştirilmesine sahip bir varyanttır. V3-V5, kalan iki S-S bağı ve ya polar (C58E-C73R) ya da polar olmayan (C58W-C73M) amino asitlerin yerini alan ya da bu kalıntı çifti ikamelerinin bir kombinasyonu olan varyantlardır. (D) Saflaştırılmış CVN2L0'ın HPLC kromatogramları, 30 dk üzerinde A tamponundaki %5-%65 tampon B'den doğrusal bir gradyan ile 1 mL/dak akış hızında elimine edilir. Tampon A: ddH₂O'da %0,1 (v/v) trifloroasetik asit, tampon B: %0,08 (v/v) trifloroasetik asit asetonitrilde. Protein, 214 nm ve 280 nm'de yüksek performanslı bir silika jel 300-5-C4 (150 x 4.6 mm) sütun üzerinde analiz edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

7. SPR spektroskopisi

1. Rejenerasyon tamponu olarak HBS-EP(+) ve 10 mM glisin HCl pH 1.5-1.6 çalışan tamponlu Çift Kanallı SPR sistemini ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın. Cihazı, degazörü, otomatik numune alma cihazını açın ve pompalayın ve tüm sistemi ddH₂0 ile 1 saat boyunca yıkayın. Kullanıma hazır çalışan tamponu ayrı bir şişeye yerleştirin.
2. Dedektörün üzerine emersion yağı bırakın ve ince bir altın film ile kaplanmış ve karboksimetildekstran hidrojel ile işlevselleştirilmiş üst tarafa doğrudan üç portlu akış hücresinin altındaki dedektöre bir cam sensör çipi ( Malzeme Tablosuna bakınız) monte edin. Taşıma işlemini aşağı çekerek ayarı düzeltin.
   NOT: C19RBDHC30M 200 nm streptavidin, orta yoğunlukta biyotinile şiddetli akut solunum sendromu koronavirüsü-2 RBD proteini ile türetilmiş karboksimetildekstran hidrojel, önceden hareketsiz hale getirilmiş ligand ile kullanıma hazır bir sensör çipidir.

8. HA, S proteini ve RBD'ye CV-N bağlanması için SPR bağlanma testi

1. Aşağıdaki adımları izleyerek proteinli ligandları sensör çiplerine hareketsiz hale getirin.
   1. Menü çubuğunda Form'a ve entegre SPRAutoLink yazılımında Tablo Düzenleyicisi'ni Çalıştır'a tıklayarak bir çalıştırma tablosu açın (bkz. Kullanılabilir çalıştırma tabloları listesinden BASIC_Immobilization seçip tıklayın ve bilgisayar ekranındaki deneysel prosedürün adımlarını izleyin. Kullanılan ilgili Örnek Editör sağ üst köşede gösterilir.
   2. Daha fazla analiz için otomatik numune alma cihazına yerleştirilen iki rafın reaktif listesini doldurmak için Form bölümündeki Örnek Kümesi Düzenleyicisi'ne tıklayın. Rafları öne veya eve getirmek için menü çubuğunda Otomatik Örnekleyici Doğrudan Kontrolü'ne "Araç" olarak tıklayın. Çalışma sıcaklığı olarak 4 °C'yi seçin.
      NOT: SPR yazılımı, ilgili aletleri seçerek , otomatik numune alma cihazının kullanımını seçerek ve Form'a tıklayarak "SPR Cihazı Doğrudan Kontrolü" ve "Pompa Doğrudan Kontrolü" ne izin verir; ayrıca veri analizi gerçekleştirmek için Run Table Editor, Data-Plot veya Post-Processing seçilebilir. Dosyalar doğrudan varsayılan dizine kaydedilir ve Son İşlem penceresinden scrubber.files olarak dışa aktarılır.
2. Araçlar ve Pompa Doğrudan Kontrolü'ne tıklayarak ddH₂0'ı demlemek için pompayı başlatın ve SPR Cihazı Doğrudan Kontrolü'ne tıklayarak verileri kaydedin ve her seferinde yeni açılan pencerelerde başlatın. Kaplin reaktiflerini (adım 8.3) 300 μL şişelere koyun, otomatik numune alma raflarına koyun ve Çalıştır'a tıklayarak çalıştırma tablosunu başlatın.
   NOT: Talaş yüzeyleri ya 10 mM glisin tamponu pH 9.0 ile şartlandırılır ya da EDC/NHS aktivasyon karışımı³⁰ için karboksil türevli talaş yüzeyini koşullandırmak üzere 1 M sodyum klorür, 0,1 M sodyum borat tampon pH 9,0 ile yıkanmış olabilir.
3. Bu basit protein-protein etkileşimi için, CMD500D çipini kullanın (bkz. Malzeme Tablosu) bir mikro-kırılma indisi birimi (μRIU) = immobilize HA ile 2500 - 3000 akış hücresi ve başak proteinli μRIU = 400 akış hücresi oluşturun. 15 μL / dak'lık bir infuse akış hızında, aşağıdaki sıralı adımları uygulayarak 0.4 M N-etil-N'-(dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorür (EDC * HCl) ve 0.1 M N-hidroksisüksinamid (NHS) sulu ve eşit bir karışımını enjekte edin.
   1. 25.000 μL/dk'da dolum pompası dolumu, 30 sn için taban çizgisi ayarı yapın, 6 dk temas süresi boyunca 90 μL numune aktivasyon çözeltisi (EDC/NHS) enjekte edin ve ardından 5 dakika daha bekletin.
   2. 20 μg / mL'de kimyasal olarak sentezlenmiş peptitler 10, HA ve spike proteinini enjekte etmek ve hareketsiz hale getirmek için yalnızca sol akış hücresinde (mavi) 10 μL / dak'da 1 dakika boyunca¹⁰ μL / dak'da 1 dakika boyunca çalışan taban çizgisinden sonra bu döngüyü tekrarlayın ve aktive edilmiş talaş yüzeyini 1 M etanolamin HCl pH 8.5 ile söndürmeden önce 1,5 dakika boyunca ddH₂O ile sonraki temel ayarlamaya izin verin.
4. Tüpleri sıvı numune alma cihazından ddH₂0'dan degazöre HBS-EP(+) özellikli şişeye geçirin (Ek Şekil 1).
5. SPR sensorgramlarını analiz edin.
   1. Kinetik çalışmalar yapmak için, her enjeksiyondan sonra bir rejenerasyon adımı ve farklı analitlerden sonra boş ölçümler ile çeşitli analit konsantrasyonları (^10-5-10-8 M) kullanın. Akış hızını 10 μL/dk olarak değiştirin ve 4 dk temas süresi, ardından 5 dk bazal üretim ve her biri 30 sn aralıklarla 2 dakikalık iki rejenerasyon adımı için enjeksiyonlara başlayın.
   2. Farklı protein konsantrasyonlarını normalleştirmek için sensör gramları numune çalışmalarından çıkarılan boş ölçümler için tampon çözeltisini enjekte edin.
6. Form'a tıklayın, aşağı kaydırın ve bu işlem modunu tıklatarak "İşlem Sonrası" na geçin. Her akış hücresi için Veri Grafiği Formunda zaman içinde oluşturulan bağlama eğrilerini seçmek için Ekle'ye tıklayın ve bindirmeyi bir yıkayıcı dosyası (.ovr) olarak dışa aktarın. Dosya kaydetme seçeneklerini açmak için Dosya'ya tıklayın. Sol ve sağ eğrileri hizalayarak ve ikinci referans kanalının sinyallerini ligand kanalınınkilerden çıkararak yanıt eğrileri elde edin.
   NOT: Veriler, sensorgramlar hesaplamalı olarak tanımlanarak "İşlem Sonrası" nda çalıştırılır. Sol ve sağ akış hücrelerinden sensorgramların bir bindirmesine yerleştirilir veya her iki kanalın farkından sensorgramlar olarak temsil edilir.
7. Tüm akışkanları 50-100 mM glisin tamponu pH 9.5, su ve% 20 etanol ile temizleyin, tuz izlerini veya herhangi bir protein kontaminasyonunu veya daha sıkı% 0.5 SDS ve glisin ile gidermek için bağlama ölçümlerinden önce ve sonra.
   NOT: Cihazın hasar görmesini önlemek için, talaşlar tampon altında veya %100 nemde saklanmışsa, talaş kartuşunu cihaza yeniden takmadan önce cam talaşının mekanik stabilitesinin kontrol edilmesi önerilir.

Sonuçlar

Dimerik etki alanı ile değiştirilen CVN2L0 molekülü, üç ayrı SPR deneyinde HA üst bölgesine bağlanma açısından test edilir ve bağlanma afinitesi K_D değerlerinde sunulur. Etki alanı B'nin, bir disülfür bağının iyonik kalıntılara dönüştürülmesiyle etkilenen H-bağlanma bölgelerini içerdiği varsayılır ve A alanı L ^10,18'i oluşturur. CVN2L0'ın tek enjeksiyonları ve V2 varyantları (üç disülfür köprüsü) ve V5 (ik...

Tartışmalar

CV-N'nin bağlanma afinitesi, işlevsel bağlama sitelerinin sayısıyla ilişkilidir [B etki alanlarında 2H ve etki alanı değiştirilen dimer olarak tasarlandığında A etki alanlarında 2L]. Değiştirilmiş bağlanma afinitesine sahip bir varyant (CVN2L0-V2, bir disülfit köprü nakavtını içeren CV-N'nin homodimerik kararlı bir kıvrımı) E. coli'de ifade edilir, saflaştırılır ve SPR¹⁰ kullanılarak HA-proteinine (H3N2) bağlanma için pozitif olarak test edilir ve HA'nı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Äkta primeplus	Cytiva
Amicon tubes	Merck	C7715
Ampillicin	Sigma-Aldrich	A5354
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge	Beckman Coulter	B06320
Cell spreader	Sigma-Aldrich	HS86655	silver stainless steel, bar L 33 mm
Custom DNA Oligos	Sigma-Aldrich	OLIGO
Custom Gensynthesis	GenScript	#1390661	cloning vector: pET27b(+)
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL	Thermo Scientific	50-105-5354
Dionex UlitMate 3000	Thermo Scientific	IQLAAAGABHFAPBMBFB
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL)	Fisher Scientific	ER1701
DTT	Merck	DTT-RO
EDC	Merck	39391
EDTA	Merck	E9884
Eppendorf Safe-Lock Tubes	Eppendorf	30120086
Eppendorf Safe-Lock Tubes	Eppendorf	30120094
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge	Sigma-Aldrich	Z606235
Ethanol	Merck	51976
Ethanolamine HCl	Merck	E6133
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack	Corning	352057
Glucose	Merck	G8270
Glycine HCl	Merck	55097
HA H3 protein	Abcam	ab69751
HEPES	Merck	H3375
His-select Ni2+	Merck	H0537
Imidazole	Merck	I2399
IPTG	Merck	I6758
Kanamycin A	Sigma-Aldrich	K1377
Kromasil 300-5-C4	Nouryon
LB agar	Merck	52062
LB agar	Merck	19344
LB Lennox	Merck	L3022
Lysozyme	Merck	10837059001
Magnesium chloride	Merck	M8266
Magnesium sulfate	Merck	M7506
NaH2P04	Merck	S0751
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000CLAPTOP
NaOH	Merck	S5881
NHS	Merck	130672
NZ amine (casein hydrolysate)	Merck	C0626
PBS	Merck	806552
PD MidiTrap G-10	Sigma-Aldrich	GE28-9180-11
Peptone	Merck	70171
pET11a	Merck Millipore (Novagen)	69436
PMSF	Merck	PMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)	Qiagen	27106X4
Reichert Software Package Autolink1-1-9	Reichert
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System	Reichert
Scrubber2-2012-09-04 for data analysis	Reichert
SDS	Merck	11667289001
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid	Stratagene	#200518
Sodim chloride	Merck	S9888
Sodium acetate.Trihydrate	Merck	236500
SPR sensor chip C19RBDHC30M	XanTec bioanalytics	SCR C19RBDHC30M
SPR sensor chip CMD500D	XanTec bioanalytics	SCR CMD500D
Sterilin Standard 90mm Petri Dishes	Thermo Scientific	101R20
TBS	Merck	T5912	10x, solution
Triton-X100	Merck	T8787
Tryptone	Merck	93657
Tween20	Merck	P1379
Vortex-Genie 2 Mixer	Merck	Z258423
X-gal	Merck	XGAL-RO
XL1-Blue Supercompetent Cells	Stratagene	#200236
Yeast extract	Merck	Y1625