Ingegneria di agenti antivirali tramite risonanza plasmonica di superficie

Riepilogo

Il presente protocollo descrive nuovi strumenti per i saggi di legame SPR per esaminare il legame CV-N a HA, glicoproteina S, glicani di tipo ibrido correlati e oligosaccaridi ad alto mannosio. SPR è usato per determinare il K_D per legare CV-N dimerico o monomerico a questi glicani.

Abstract

La risonanza plasmonica di superficie (SPR) viene utilizzata per misurare il legame dell'emoagglutinina (HA) al dimero di cianovirina-N (CV-N) scambiato di dominio e per monitorare le interazioni tra peptidi mannosilati e sito di legame ad alta affinità di CV-N. I picchi dell'involucro virale gp120, HA e glicoproteina di Ebola (GP) 1,2 sono stati segnalati per legare entrambi i siti di legame ad alta e bassa affinità su CVN2 dimerico. Il peptide HA dimannosilato è anche legato nei due siti di legame a bassa affinità a una molecola ingegnerizzata di CVN2, che porta un sito ad alta affinità per il rispettivo ligando e muta per sostituire un legame disolfuro stabilizzante nella tasca di legame dei carboidrati, confermando così il legame multivalente. Il legame con l'HA è mostrato in un sito di legame ad alta affinità dello pseudo-anticorpo CVN2 a una costante di dissociazione (K_D) di 275 nM che neutralizza ulteriormente il virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) attraverso l'oligomerizzazione. Correlando il numero di ponti disolfuro in CVN2 scambiati di dominio, che sono diminuiti da 4 a 2 sostituendo le cistine in coppie di residui polari di acido glutammico e arginina, si ottiene una ridotta affinità di legame con l'HA. Tra le interazioni più forti, Ebola GP1,2 è legato da CVN2 con due siti di legame ad alta affinità nell'intervallo nanomolare inferiore utilizzando il glicano dell'involucro senza un dominio transmembrana. Nel presente studio, il legame della glicoproteina monomerica multispecifica CV-N alla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) è misurato a K D = 18,6 μM rispetto al nanomolare K_D a quegli altri picchi virali e attraverso il suo dominio di legame del recettore nell'intervallo medio-μ-molare.

Introduzione

L'attività antivirale associata alla terina è indotta dall'interferone-α e comprende legami a base di proteine, che portano alla ritenzione di virioni completamente formati sulle superfici cellulari infette¹. La necessità della glicosilazione della teterina nell'inibizione del rilascio del virus rimane incerta, il che implica l'importanza dei pattern di glicosilazione sui glicani espressi in modo ricombinante per gli studi in vitro ^1,2, che dipende dalla conformazione dell'emoagglutinina ^{HA 3,4} dell'influenza espressa in superficie (nel caso del virus dell'influenza) . È stato notato che la modifica dell'oligosaccaride legato alla glicosilazione legata all'N è sufficiente per la restrizione tetherin-mediata dell'HIV di tipo 1 rilascio², mentre la dimerizzazione svolge un ruolo essenziale nel prevenire il rilascio del virus, coinvolgendo così il dominio transmembrana o l'ancora glicosil-fosfatidil-inositolo (GPI) per legare i virioni in erba⁵ . Sono descritte caratteristiche uniche per il tetherin umano e murino per bloccare più virus, retrovirus e filovirus con involucro. BST-2/tetherin è una proteina antivirale inducibile dall'interferone dell'immunità innata^1,6, che agisce con attività antivirale ad ampio spettro ed è antagonizzata dalle glicoproteine dell'involucro⁵ per traslocare tetherin o interrompere la struttura della tetherin ⁶. Ad esempio, la glicoproteina HA dell'involucro espressa in superficie e la neuraminidasi sul virus dell'influenza A sono ben note per l'antagonismo delle teterine in modo specifico del ceppo 7, facilitando il riconoscimento dei siti di legame^del recettore ospite⁸. Gli anticorpi mirati ai glicani sono studiati nella stechiometria delle loro interazioni con gli scudi glicani in rapida personalizzazione sull'HA, con conseguente affinità di legame con l'influenza A H3N2 e H1N1 sottotipi⁴.

Per chiarire i meccanismi di legame tra agenti antivirali e picchi di involucro virale, cioè ligandi di carboidrati, e metodi immunologici e spettroscopici complementari, vengono sintetizzate chimicamente porzioni mono-, di- e tri-mannosio. I peptidi mannosilati sono creati tramite glicosilazione azidica dei glicosil {beta}-peracetati alla trasformazione 1,2-trans glicosil azide⁹, imitando la N-acetil glucosamina e gli oligosaccaridi ad alto mannosio sulla superficie di virus potenzialmente letali. I bioisosteri triazolici sono utilizzati per imitare i legami che formano il residuo mannosilato del peptide HA¹⁰ e facilitare le interazioni sito-specifiche con i derivati antivirali CV-N attorno al secondo punto di glicosilazione N-linked sul dominio di testa dell'HA (HA top con 4 glicani N-linked N54, N97, N181, N301)^8,11,12 . Le interazioni tra acido glutammico (Glu) e arginina (Arg) e il dipolo dell'elica risultante hanno manifestato una buona stabilità sia dei peptidi modello che delle proteine, ma sono visualizzate utilizzando SPR. Se confrontato con il riconoscimento di un singolo sito di glicosilazione sintetizzato chimicamente su HA¹⁰ inibendo direttamente il legame del recettore sulle porzioni dei glicani, una maggiore affinità di una struttura Fc mutata a quattro siti al suo recettore è mostrata per suscitare funzioni effettrici in vivo, rivelando la composizione non correlata dei glicani N-linked attaccati al mutante Fc da determinare meccanicamente¹³.

CV-N mostra attività antivirale contro l'HIV 14,15, l'influenza¹⁶ e il virus Ebola, che è mediata dal legame nanomolare alle modificazioni oligosaccaridiche ad alto mannosio sulle proteine spike dell'involucro^12,17,18,19. Il legame dell'influenza HA a un sito di legame dei carboidrati ad alta affinità (H) in CV-N o due H in CVN2 dimerico legato covalentemente è determinato per avere costanti di dissociazione all'equilibrio (K D) = 5,7 nM (Figura 1A) e K_D = 2,7 nM, rispettivamente. Sia CV-N che CVN2 ospitano altri uno o due siti di legame dei carboidrati a bassa affinità (L) 12,17,20,21. Ebola GP1,2 si lega a 2H di CVN2 con affinità nell'intervallo nanomolare inferiore (K_D = 26 nM). Il legame di CV-N WT a Ebola GP1,2 e HA mostra affinità da K D = 34 nM a K_D = 5,7 nM (A/New York/55/04)¹². Le lectine, come CV-N, che colpiscono specificamente i glicani ad alto mannosio sugli involucri virali, inibiscono ulteriormente la replicazione del virus dell'epatite C, SARS-CoV, herpesvirus, virus Marburg e virus del morbillo²².

La piccola molecola CV-N è stata studiata a fondo per più di 20 anni in quanto si funzionalizza per legare una vasta gamma di virus per inibire l'ingresso virale^16,18. Analisi strutturali e saggi di affinità di legame indicano il cross-linking di due L in un dimero CVN2 scambiato di dominio mediante legame bivalente nell'intervallo micromolare per aumentare l'avidità alle glicoproteine dell'involucro virale^10,19. Il legame selettivo di Manα1-2Manα sui bracci Man(8) D1D3 e Man(9) comprende due siti di legame di affinità diverse situati su protomeri proteici opposti²⁰, raggiungendo così affinità di legame nanomolare (Figura 1B). Pertanto, CVN2 è considerato uno pseudo-anticorpo per quanto riguarda la sua applicazione per legare epitopi su HIV gp120, simile agli anticorpi neutralizzanti il virus¹⁷. Qui, l'autore è interessato a studiare il potenziale legame di CVN2 al picco SARS-CoV-2 attraverso il suo dominio di legame del recettore (RBD). Le curve di legame dell'enzima di conversione dell'angiotensina umana immobilizzata (ACE)-2 con il SARS-CoV-2 RBD danno come risultato K_D = 4,7 nM per questa interazione di legame biologicamente rilevante²³.

Al contrario, classi di immunoglobuline selezionate riconoscono modelli proteici strutturali specifici e coerenti, che conferiscono un substrato per la maturazione dell'affinità nelle regioni HA ancorate alla membrana²⁴. CV-N mostra un'attività molto potente in quasi tutti i virus dell'influenza A e B¹⁶ ed è un agente antivirale ampiamente neutralizzante. Le nostre conoscenze sono incomplete sulla posizione di epitopi mirati sul gambo di HA1 e HA2 che potrebbero coinvolgere strutture epitopiche per il targeting dei glicani da anticorpi altamente neutralizzanti e rispetto al legame della lectina²⁵.

Figura 1: Rappresentazione schematica del saggio di legame SPR per CV-N ai picchi dell'involucro virale. (A) Saggio SPR per il legame CV-N al ligando: proteina a lunghezza intera HA (90 kDa). Set di dati cinetici (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 0 nM) che mostrano in tempo reale il doppio legame con l'influenza HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 variante V2 che si lega al ligando immobilizzato DM entro un intervallo di concentrazione compreso tra 500 nM e 16 μM. Sequenza: i residui di L sono evidenziati in giallo. I residui di H sono evidenziati in grigio. E58 e R73 sono un sostituto delle cisteine nella proteina wildtype e rendono V2 una piega proteica stabile con tre invece di quattro legami disolfuro Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Mentre lo scudo glicano sulla parte superiore distale della membrana HA induce un legame ad alta affinità con CV-N 12, il legame CVN2 all'HA adiacente a un ponte disolfuro della parte superiore dell'HA è stato ulteriormente osservato nei suoi siti a bassa affinità^10,12. Varie interazioni polari e siti di interazione sono identificati nel legame dei carboidrati da CV-N. Queste interazioni sono verificate generando varianti knock-out nel sito di legame per correlare le affinità di legame alla glicosilazione 12 prevista in silico. Pertanto, il progetto mira a confrontare peptidi HA mannosilati chimicamente precedentemente testati in affinità e specificità di legame con brevi sequenze peptidiche da picchi di 2019-nCoV correlati al SARS e SARS-CoV-2, presenti in natura modificati da un piccolo numero di diversi siti di glicosilazione N-linked e glicosilazione O-linked. Utilizzando la microscopia crioelettronica e saggi di legame, Pinto e collaboratori riportano un anticorpo monoclonale, S309, che potenzialmente riconosce un epitopo sulla proteina spike SARS-CoV-2 contenente un glicano conservato all'interno del sottogenere Sarbecovirus, senza competere con l'attaccamento del recettore²⁶. Il protocollo di questo studio descrive come la progettazione, l'espressione e la caratterizzazione delle varianti di CV-N siano importanti per studiare come CV-N e CVN2 si legano alle proteine glicosilate e ai peptidi mannosilati sintetici utilizzando la tecnologia SPR^10,12.

Il dimero legato al tandem CVN2L0²⁷ e le varianti del sito di legame (V2-V5) sono espressi in modo ricombinante e le varianti sono con sostituzioni del legame disolfuro (C58E e C73R) (Figura 2A). Inoltre, un mutante con una mutazione a punto singolo E41A è preparato perché questa posizione è stata vista come un residuo intermolecolare cross-contact. Questo mutante è un'altra molecola interessante per le misure di legame SPR tra la lectina e gli oligosaccaridi ad alto mannosio che decifra i domini di legame e consente il confronto con la forma dimerica. La struttura cristallina di CVN2 mostra un linker flessibile, che si estende tra 49 e 54 residui. I due domini possono continuare a muoversi attorno alla cerniera come corpi rigidi, sviluppando un monomero attraverso interazioni intramolecolari (dominio A -residui 1-39;90-101- con dominio B -residui 40-89) o un dimero mediante scambio di dominio intermolecolare [dominio A (del primo monomero) con dominio B (del secondo) e dominio B (del primo monomero) con dominio A (della seconda copia)]. Non ci sono interazioni strette tra i domini A e B dei due protomeri, ad eccezione di Glu41²⁸. Il gene per CV-N può essere sviluppato utilizzando un metodo PCR ripetitivo con oligo sintetizzati 40-mer²⁹ e viene quindi subclonato nei siti NdeI e BamHI di pET11a per la trasformazione (elettroporazione) in cellule elettrocompetenti come descritto da Keeffe, J.R.27. La proteina, che viene utilizzata per ottenere la rispettiva struttura cristallina (PDB ID 3S3Y), include un tag di purificazione N-terminale 6-istidina seguito da un sito di scissione della proteasi del fattore Xa. La mutagenesi sito-diretta viene utilizzata per fare mutazioni puntiformi, cambiare codoni e inserire o eliminare basi o codoni singoli o multipli per lo scambio di amminoacidi. Queste trasformazioni forniscono informazioni preziose sulla funzione e la struttura delle proteine. CV-N, CVN2 e CVN3 espressi e purificati in modo ricombinante sono stati biofisicamente ben studiati^20,21,27, sono economici da produrre e quindi utilizzati per caratterizzare saggi di legame ai glicani immobilizzati su chip di sensori SPR. Il saggio di immunoassorbimento enzimatico convenzionale (ELISA) fornisce una minore riproducibilità per quanto riguarda la tecnica di immobilizzazione dei ligandi glicani e trasforma il legame in tempo reale di varie varianti del sito di legame, che viene mostrato per SPR, in saggi endpoint.

La variante di affinità di legame CVN2L0-V2 (una piega intatta di CV-N omodimerico con una sostituzione del ponte disolfuro¹⁰) è espressa con un His-tag in Escherichia coli (E. coli), purificata su colonna Ni-NTA applicando cromatografia di affinità e testata per il legame con HA (H3N2), peptide HA monomannosilato e peptide HA dimannosilato usando SPR. I peptidi mannosilati chimicamente, o proteine HA e S, sono tutti ligandi e ammina accoppiati alla superficie del chip idrofilo tramite esteri reattivi o ingegneria proteica biotina-streptavidina. La stessa procedura di esecuzione sequenziale viene applicata a questi ligandi, iniettando varie diluizioni di CV-N e varianti di CV-N (e CVN2) per ottenere informazioni cinetiche per le analisi di interazione molecolare come descritto di seguito³⁰. Il chip sensore SPR immobilizzato RBD viene utilizzato per studi di legame sui peptidi CV-N a S e le affinità vengono confrontate con il legame SARS-CoV-2 con l'ACE2 umano.

Protocollo

Per il presente studio, una proteina di fusione CVN-small ubiquitina-like modifier (SUMO) è stata utilizzata nei saggi di immunoassorbimento enzimatico invece di CV-N ed è adatta per saggi basati su cellule. La proteina H3 ricombinante a lunghezza intera del virus dell'influenza A HA è ottenuta commercialmente (vedi tabella dei materiali) o espressa in linee cellulari HEK293 di mammiferi e cellule di insetti infettate da baculovirus secondo i protocolli standard¹². La proteina spike Wuhan-1 è espressa nelle cellule HEK293 dei mammiferi. La sintesi del peptide monomannosilato (MM) e del peptide dimannosilato (DM) permette la rilevazione di ligandi omogenei a CVN2 e monomannosilata piccola molecola¹⁰.

1. Creazione di costrutti CV-N

1. Per ciascuna delle varianti di CVN2 e della proteina CVN2L0 (PDB ID 3S3Y), ottenere il costrutto genico con una sequenza leader pelB N-terminale e His-tag nel vettore pET27b(+) da fonti commerciali (vedi Tabella dei Materiali, File Supplementare 1).
2. Ottenere CVN2L0 e le sue varianti (V2, V3, V4 e V5; Figura 2A,C) sullo sfondo di un gene modello CVN2L0 costituito da due distinte sequenze di DNA per ogni ripetizione CV-N.
3. Sciogliere il DNA plasmidico liofilizzato in acqua distillata deionizzata sterile (ddH₂O) fino ad una concentrazione finale di 100 ng/μL.

2. Preparazione di piastre di agar LB con cellule trasformate di DNA plasmidico

1. Preparare il terreno di coltura LB-Lennox sciogliendo 10 g/L di peptone, 5 g/L di estratto di lievito e 5 g/L di NaCl in ddH₂O (vedere Tabella dei materiali) e regolare il pH a 7,4. Eseguire la trasformazione in E. coli BL21 competente (DE3) per ciascuna variante (V2-V5) con metodo chimico seguendo un rapporto precedentemente pubblicato¹⁰.
2. Dividere la soluzione (900 μL e 100 μL), trasferire 100 μL su piastre di agar LB (50 μg/mL di kanamicina) e utilizzare delicatamente uno spargitore di cellule sterili. Incubare le piastre di agar per una notte a 37 °C.

3. Clonazione

1. Subclonare il gene per CV-N nei siti NdeI e BamHI di pET11a (vedi Tabella dei Materiali) per la trasformazione (elettroporazione) in cellule elettrocompetenti seguendo il riferimento²⁷.

4. Mutagenesi sito-diretta

1. Generare CVN2L0²⁹ e CVN-E41A mutante sullo sfondo di un gene modello CVN2L0 contenente due sequenze di DNA distinte per ogni CV-N ripetere²⁷.
2. Effettuare mutazioni utilizzando un kit di mutagenesi sito-diretto (vedi Tabella dei materiali) e primer mutageni specifici 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' e 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' per l'esecuzione della PCR³¹.
   1. Avviare una serie di reazioni campione utilizzando concentrazioni multiple di DNA a doppio filamento (dsDNA) modello che vanno da 5-50 ng (ad esempio, 5, 10, 20 e 50 ng di modello di dsDNA). Mantenere costante la concentrazione del primer.
      NOTA: La miscela PCR e il protocollo di ciclo termico sono generalmente utilizzati come descritto nel manuale di istruzioni per il kit di mutagenesi sito-diretta³².
3. Aggiungere l'enzima di restrizione Dpn I (1 μL, 10 U/μL, vedere Tabella dei materiali) sotto il rivestimento dell'olio minerale. Mescolare accuratamente e delicatamente le reazioni, centrifugare in una microcentrifuga da tavolo per 1 minuto e incubare immediatamente a 37 °C per 1 ora per digerire il dsDNA superarrotolato parentale.

5. Trasformazione delle cellule batteriche

1. Scongelare delicatamente le cellule supercompetenti XL1-Blue (vedi Tabella dei materiali) sul ghiaccio. Per trasformare ogni reazione di controllo e campione, aliquotare le celle supercompetenti (50 μL) in un tubo a fondo tondo di polipropilene prerefrigerato (14 ml).
   1. Trasferire 1 μL di DNA a singolo filamento trattato con Dpn I (ssDNA) da ciascuna reazione di controllo e campione (ssDNA mutato) in aliquote separate delle cellule supercompetenti, che sintetizzano il filamento complementare. Ruotare attentamente le reazioni di trasformazione per mescolare e incubare le reazioni sul ghiaccio per 30 minuti.
      NOTA: Prima di trasferire il DNA trattato con Dpn I alla reazione di trasformazione, si raccomanda di rimuovere con cautela l'olio minerale residuo dalla punta della pipetta. Come controllo opzionale, l'efficienza di trasformazione delle cellule supercompetenti XL1-Blue deve essere verificata miscelando 0,1 ng/μL del plasmide di controllo pUC18 (1 μL) con un'aliquota di 50 μL delle cellule supercompetenti.
2. Applicare un impulso termico alle reazioni di trasformazione a 42 °C per 45 s, quindi posizionare le reazioni sul ghiaccio per 2 minuti.
   NOTA: L'impulso termico applicato è già stato ottimizzato per le condizioni menzionate nei tubi a fondo tondo in polipropilene (14 ml).
3. Aggiungere 0,5 mL di brodo NZY+ (contenente per litro: 10 g di ammina NZ (idrolizzato di caseina), 5 g di estratto di lievito, 5 g di NaCl, 12,5 mL di 1 M MgCl 2, 12,5 mL di 1 M MgSO₄, 10 mL di₂ M glucosio, pH 7,5 e preriscaldato a 42 °C) e incubare le reazioni di trasformazione a 37 °C agitando a 225-250 rpm per 1 h. Placcare il volume corretto di ciascuna reazione di trasformazione (5 μL dalla trasformazione del plasmide di controllo; 250 μL dalla trasformazione del campione) su piastre di agar dell'ampicillina LB.
   NOTA: Per i controlli di trasformazione e la mutagenesi, diffondere cellule su piastre di agar LB-ampicillina contenenti 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopirananoside (X-gal, 80 μg/ml) e isopropil-1-tio-β-D-galattopiranoside (IPTG, 20 mM) (vedere Tabella dei materiali). Inoculare 50 ml di colture cellulari con una singola colonia di E trasformato. cellule coli per purificare il DNA plasmidico mutato per le analisi. La mutagenesi è confermata dal sequenziamento del DNA in una struttura esterna.

6. Espressione e purificazione delle proteine

1. Per una coltura su larga scala, inoculare una piccola quantità di LB (contenente ampicillina) con una singola colonia dalla piastra trasformata.
2. Utilizzando la coltura durante la notte, inoculare la coltura di espressione con additivi, come 10 mM di MgCl₂, 10 mM di MgSO₄ e 20 mM di glucosio, diluendo la coltura di semi a 1/100.
   1. Coltivare cellule con agitazione vigorosa a 37 °C. Far crescere le cellule a un Abs 600 nm tra 0,4-0,6 (fase intermedia) prima di raffreddare le cellule a 20 °C. Indurre con 1 mM IPTG e crescere durante la notte.
   2. Quindi, raccogliere le cellule centrifugando a 4.000 x g per 15 minuti a 4 °C e scartare il surnatante con una pipetta.
3. Risospendere il pellet cellulare in tampone salino tamponato fosfato (PBS) e centrifugare nuovamente a 4.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Quindi, scartare il surnatante con una pipetta. Risospendere il pellet rimanente in 10 mL di tampone di lisi e incubare la sospensione per 1 ora a 37 °C.
   NOTA: Composizione del tampone di lisi: (50 mM di NaH 2 PO₄, 300 mM di NaCl, 2% di Triton-X100, 500 ng/mL di lisozima, 1 mM di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), 1 mM di ditiotreitolo, 1 mM di MgCl₂, pH 8, vedere Tabella dei materiali).
   1. Sottoporre la miscela a due cicli di gelo-disgelo (-80 °C). Separare le frazioni solubili e insolubili mediante centrifugazione a 4.000 x g per 15 minuti a 4 °C e analizzarle utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE), in particolare il dodecilsolfato di sodio (SDS)-PAGE³³ (Figura 2B, C).
      NOTA: Le cellule possono essere lisate in diversi modi, come congelamento-disgelo, sonicazione, omogeneizzazione, lisi enzimatica o una combinazione di questi metodi. La purificazione dai corpi di inclusione è raccomandata per la raccolta di alte rese proteiche²⁶.
4. Purificare le proteine mediante cromatografia su colonna Ni-NTA (vedi Tabella dei materiali). Caricare la frazione solubile su una colonna di sfere Ni-NTA rigenerata (1 mL/min). Lavare il sistema con tampone TBS (50 mM di Tris, 150 mM di cloruro di sodio, pH 7,5) prima di iniziare un gradiente (0-100% 500 mM di imidazolo in TBS su 60 min) e raccogliere le frazioni (1 mL/min). Dializzare le proteine purificate per la caratterizzazione biochimica contro 100 mM PBS (Figura 2C,D).
5. In alternativa, utilizzare il gel di affinità His-Select Ni 2+ (vedere la tabella dei materiali) in provette da 14 mL per legare e risospendere il CV-N espresso in modo ricombinante marcato in soluzioni tampone rispettivamente con 20 mM di imidazolo e²⁵⁰ mM di imidazolo. Incubare in batch per almeno 30 min.
   NOTA: Applicare queste proteine semi-purificate a una colonna preconfezionata monouso per lo scambio tampone e la pulizia di campioni biologici, ad esempio carboidrati e proteine, che possono caricare 1-1,5 ml di eluato dalla cromatografia ad affinità metallica immobilizzata.
6. Trasferire le soluzioni proteiche in provette di centrifugazione con un filtro di intercettazione da 10 kDa (vedere Tabella dei materiali) e concentrarle centrifugando per 10 minuti a 4.500 x g e 4 °C. Per le misurazioni SPR, sostituire le soluzioni dell'analita con 10 mM HEPES, 150 mM di cloruro di sodio, 3 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e 0,05% Tween20, pH 7,4 (HBS-EP(+), vedere Tabella dei materiali).
   1. Aggiungere questo tampone di funzionamento SPR a un fattore di diluizione di 1:10 e centrifugare quattro volte al volume iniziale per 10 minuti a 4.500 x g e 4 °C.
7. Determinare la concentrazione della proteina a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis NanoDrop (vedi Tabella dei materiali) in base al coefficiente di estinzione calcolato (20.440 M-1 ^cm-1) per la proteina principale CVN2L0 che mostra una dimensione di 23.474 Da³⁴. Utilizzare PBS (100 mM, pH 7,0) o tampone SPR come bianco e misurare la concentrazione proteica in tre fasi di diluizione (1:1, 1:10 e 1:100).

Figura 2: Sequenze ed espressione di CV-N. (A) CVN2 senza un linker tra ogni ripetizione CV-N (101 amminoacidi ciascuno) e quattro ponti disolfuro è espresso nel vettore pET11a in E. coli. (B) Espressioni di due colonie indipendenti per CV-N (monomero) e CVN2 (dimero). (C) Le varianti del legame disolfuro sono purificate e analizzate su SDS-PAGE. Un marcatore a basso peso molecolare (6 μL) viene utilizzato come riferimento. WT = CVN2L0 recante quattro ponti disolfuro come indicato in (A). V2 è una variante con un legame disolfuro sostituito da residui polari nelle posizioni 58 e 73. V3-V5 sono varianti con due legami S-S rimanenti e amminoacidi polari (C58E-C73R) o non polari (C58W-C73M) sostitutivi o una combinazione di queste sostituzioni di coppie di residui. (D) I cromatogrammi HPLC di CVN2L0 purificato sono eluiti a una portata di 1 mL/min con un gradiente lineare dal 5% al 65% del tampone B nel tampone A oltre 30 min. Il tampone A è: 0,1% (v/v) di acido trifluoroacetico in ddH₂O, il tampone B è: 0,08% (v/v) di acido trifluoroacetico in acetonitrile. La proteina viene analizzata su una colonna di gel di silice ad alte prestazioni 300-5-C4 (150 x 4,6 mm) a 214 nm e 280 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

7. Spettroscopia SPR

1. Utilizzare il sistema SPR a doppio canale (vedere la tabella dei materiali) con tampone di corsa HBS-EP(+) e 10 mM di glicina HCl pH 1,5-1,6 come tampone di rigenerazione. Accendere lo strumento, il degasatore, l'autocampionatore, pompare e lavare l'intero sistema con ddH₂0 per 1 h. Posizionare il buffer di esecuzione pronto all'uso in una bottiglia separata.
2. Far cadere l'olio di emersione sul rivelatore e montare un chip sensore di vetro (vedi Tabella dei materiali) rivestito con una sottile pellicola dorata e sul lato superiore funzionalizzato con carbossimetildestrano idrogel direttamente sul rivelatore sotto la cella di flusso a tre porte. Fissare l'impostazione tirando verso il basso la gestione.
   NOTA: C19RBDHC30M 200 nm streptavidina derivatizzata carbossimetildextrane idrogel con una media densità di sindrome respiratoria acuta grave biotinilata coronavirus-2 proteina RBD, è un sensorchip pronto all'uso con il ligando pre-immobilizzato.

8. Saggio di legame SPR per il legame CV-N a HA, proteina S e RBD

1. Immobilizzare i ligandi proteici nei chip del sensore seguendo i passaggi seguenti.
   1. Aprire una tabella di esecuzione facendo clic su Form nella barra dei menu e su Run Table Editor nel software integrato SPRAutoLink (vedere Tabella dei materiali). Scegli e fai clic su BASIC_Immobilization dall'elenco delle tabelle di esecuzione disponibili e segui i passaggi della procedura sperimentale sullo schermo del computer. Il rispettivo editor di esempio utilizzato è mostrato nell'angolo in alto a destra.
   2. Fare clic su Sample Set Editor nella sezione Form per compilare l'elenco dei reagenti per due rack posizionati nell'autocampionatore per ulteriori analisi. Fare clic su Controllo diretto dell'autocampionatore come "Strumento" nella barra dei menu per portare i rack avanti o indietro a casa. Scegliere 4 °C come temperatura di esercizio.
      NOTA: Il software SPR consente "SPR Instrument Direct Control" e "Pump Direct Control" selezionando gli strumenti corrispondenti, nonché gestendo l'autocampionatore e facendo clic su Form; è inoltre possibile scegliere Run Table Editor, Data-Plot o Post-Processing per eseguire l'analisi dei dati. I file vengono salvati direttamente nella directory predefinita ed esportati come scrubber.files dalla finestra Post-elaborazione.
2. Avviare la pompa per infondere ddH₂0 facendo clic su Strumenti e Controllo diretto pompa e registrare i dati facendo clic su SPR Instrument Direct Control e ogni volta avviare nelle finestre appena visualizzate. Inserire i reagenti di accoppiamento (punto 8.3) in flaconcini da 300 μL, inserirli nei rack degli autocampionatori e avviare la tabella di esecuzione facendo clic su Esegui.
   NOTA: Le superfici dei chip sono condizionate con tampone glicina da 10 mM pH 9,0 o possono essere state lavate con cloruro di sodio 1 M, tampone borato di sodio 0,1 M pH 9,0 per condizionare la superficie del chip derivato carbossilico per il mix di attivazione EDC/NHS³⁰.
3. Per questa semplice interazione proteina-proteina, utilizzare il chip CMD500D (vedi Tabella dei materiali) per generare unità di indice di micro-rifrazione (μRIU) = 2500 - 3000 celle a flusso con HA immobilizzato e μRIU = 400 celle a flusso con proteina spike. A una velocità di flusso di infusione di 15 μL/min, iniettare una miscela acquosa e uniforme di 0,4 M N-etil-N'-(dimetilamminopropil) carbodiimmide cloridrato (EDC*HCl) e 0,1 M N-idrossisuccinimide (NHS) applicando i seguenti passaggi sequenziali.
   1. Riempire la pompa di ricarica a 25.000 μL/min, eseguire la regolazione basale per 30 s, iniettare 90 μL di soluzione di attivazione del campione (EDC/NHS) per un tempo di contatto di 6 minuti, quindi tenere premuto per altri 5 minuti.
   2. Ripetere questo ciclo dopo aver eseguito il basale per 1 minuto a 10 μL/min solo sulla cella di flusso sinistra (blu) per iniettare e immobilizzare i peptidi sintetizzati chimicamente 10, HA e la proteina spike a²⁰ μg/mL, e consentire il successivo aggiustamento basale con ddH₂O per 1,5 minuti prima di spegnere la superficie del chip attivato con 1 M etanolammina HCl pH 8,5.
4. Commutare le provette dal campionatore liquido al degasatore da ddH₂0 al flacone con HBS-EP(+) (figura supplementare 1).
5. Analizzare i sensorgrammi SPR.
   1. Per eseguire studi cinetici, utilizzare varie concentrazioni di analita (^10-5-10-8 M), con una fase di rigenerazione dopo ogni iniezione e misurazioni in bianco dopo diversi analiti. Modificare la portata a 10 μL/min e iniziare le iniezioni per un tempo di contatto di 4 minuti, quindi una generazione basale di 5 minuti e due fasi di rigenerazione di 2 minuti ciascuna con un intervallo di 30 s.
   2. Iniettare la soluzione tampone per misurazioni in bianco i cui sensogrammi vengono sottratti dalle corse dei campioni per normalizzare diverse concentrazioni proteiche.
6. Fare clic su Modulo, scorrere verso il basso e passare a "Post-elaborazione" facendo clic su questa modalità operativa. Fate clic su Aggiungi (Add ) per selezionare le curve di binding generate nel tempo nel modulo grafico dati per ciascuna cella di flusso ed esportare la sovrapposizione come file di scrubber (.ovr). Fare clic su File per aprire le opzioni di salvataggio dei file. Ottenere curve di risposta allineando le curve sinistra e destra e sottraendo i segnali del secondo canale di riferimento da quelli del canale ligando.
   NOTA: i dati vengono gestiti in "Post-Processing" definendo i sensorgramma computazionalmente. Viene inserito in una sovrapposizione di sensorgram dalle celle di flusso sinistra e destra o rappresentato come sensorgram dalla differenza di entrambi i canali.
7. Pulire l'intera fluidica con tampone glicina da 50-100 mM pH 9,5, acqua e etanolo al 20% prima e dopo le misurazioni di legame per rimuovere tracce di sale o qualsiasi contaminazione proteica, o più rigoroso, con SDS 0,5% e glicina.
   NOTA: Per evitare danni allo strumento, si consiglia di verificare la stabilità meccanica del chip di vetro prima di reinserire la cartuccia in chip nello strumento se i trucioli sono stati conservati sotto buffer o al 100% di umidità.

Risultati

Una molecola CVN2L0 scambiata di dominio dimerico viene testata per il legame alla regione superiore dell'HA in tre esperimenti SPR separati e l'affinità di legame è presentata in valori K_D. Si presume che il dominio B comprenda siti di legame H, che sono influenzati dalla sostituzione di un legame disolfuro in residui ionici, e il dominio A forma L^10,18. Le singole iniezioni di CVN2L0 e delle varianti V2 (tre ponti disolfuro) e V5 (due ponti disolfu...

Discussione

L'affinità di legame di CV-N è correlata al numero di siti di legame funzionali [2H sui domini B e 2L sui domini A quando progettati come dimero scambiati di dominio]. Una variante con un'alterata affinità di legame (CVN2L0-V2, una piega omodimerica stabile di CV-N comprendente un knock-out del ponte disolfuro) è espressa in E. coli, purificata e testata positivamente per il legame alla proteina HA (H3N2) usando SPR¹⁰, e mostra un cambiamento conformazionale dopo aver legato HA con si...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Äkta primeplus	Cytiva
Amicon tubes	Merck	C7715
Ampillicin	Sigma-Aldrich	A5354
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge	Beckman Coulter	B06320
Cell spreader	Sigma-Aldrich	HS86655	silver stainless steel, bar L 33 mm
Custom DNA Oligos	Sigma-Aldrich	OLIGO
Custom Gensynthesis	GenScript	#1390661	cloning vector: pET27b(+)
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL	Thermo Scientific	50-105-5354
Dionex UlitMate 3000	Thermo Scientific	IQLAAAGABHFAPBMBFB
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL)	Fisher Scientific	ER1701
DTT	Merck	DTT-RO
EDC	Merck	39391
EDTA	Merck	E9884
Eppendorf Safe-Lock Tubes	Eppendorf	30120086
Eppendorf Safe-Lock Tubes	Eppendorf	30120094
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge	Sigma-Aldrich	Z606235
Ethanol	Merck	51976
Ethanolamine HCl	Merck	E6133
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack	Corning	352057
Glucose	Merck	G8270
Glycine HCl	Merck	55097
HA H3 protein	Abcam	ab69751
HEPES	Merck	H3375
His-select Ni2+	Merck	H0537
Imidazole	Merck	I2399
IPTG	Merck	I6758
Kanamycin A	Sigma-Aldrich	K1377
Kromasil 300-5-C4	Nouryon
LB agar	Merck	52062
LB agar	Merck	19344
LB Lennox	Merck	L3022
Lysozyme	Merck	10837059001
Magnesium chloride	Merck	M8266
Magnesium sulfate	Merck	M7506
NaH2P04	Merck	S0751
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000CLAPTOP
NaOH	Merck	S5881
NHS	Merck	130672
NZ amine (casein hydrolysate)	Merck	C0626
PBS	Merck	806552
PD MidiTrap G-10	Sigma-Aldrich	GE28-9180-11
Peptone	Merck	70171
pET11a	Merck Millipore (Novagen)	69436
PMSF	Merck	PMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)	Qiagen	27106X4
Reichert Software Package Autolink1-1-9	Reichert
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System	Reichert
Scrubber2-2012-09-04 for data analysis	Reichert
SDS	Merck	11667289001
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid	Stratagene	#200518
Sodim chloride	Merck	S9888
Sodium acetate.Trihydrate	Merck	236500
SPR sensor chip C19RBDHC30M	XanTec bioanalytics	SCR C19RBDHC30M
SPR sensor chip CMD500D	XanTec bioanalytics	SCR CMD500D
Sterilin Standard 90mm Petri Dishes	Thermo Scientific	101R20
TBS	Merck	T5912	10x, solution
Triton-X100	Merck	T8787
Tryptone	Merck	93657
Tween20	Merck	P1379
Vortex-Genie 2 Mixer	Merck	Z258423
X-gal	Merck	XGAL-RO
XL1-Blue Supercompetent Cells	Stratagene	#200236
Yeast extract	Merck	Y1625