Engenharia de Agentes Antivirais via Ressonância de Plasmon de Superfície

Resumo

O presente protocolo descreve novas ferramentas para ensaios de ligação ao SPR para examinar a ligação de CV-N ao AH, glicoproteína S, glicanos do tipo híbrido relacionados e oligossacarídeos com alto teor de manose. O SPR é usado para determinar o K_D para ligar o CV-N dimérico ou monomérico a esses glicanos.

Resumo

A ressonância plasmônica de superfície (SPR) é usada para medir a ligação da hemaglutinina (HA) ao dímero de cianovirina-N (CV-N) trocado por domínio e para monitorar interações entre peptídeos manosilados e o local de ligação de alta afinidade do CV-N. Foram relatados picos de envelope de vírus gp120, HA e glicoproteína (GP) de Ebola (GP) 1,2 para se ligar a locais de ligação de alta e baixa afinidade na CVN2 dimérica. O peptídeo HA dimanosilado também está ligado nos dois locais de ligação de baixa afinidade a uma molécula modificada de CVN2, que está carregando um local de alta afinidade para o respectivo ligante e mutado para substituir uma ligação dissulfeto estabilizadora na bolsa de ligação de carboidratos, confirmando assim a ligação multivalente. A ligação ao AH é mostrada a um local de ligação de alta afinidade do pseudo-anticorpo CVN2 em uma constante de dissociação (K_D) de 275 nM que neutraliza ainda mais o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) através da oligomerização. A correlação do número de pontes dissulfeto na CVN2 trocada por domínio, que é diminuída de 4 para 2 pela substituição de cistinas em pares de resíduos polares de ácido glutâmico e arginina, resulta em afinidade de ligação reduzida ao AH. Entre as interações mais fortes, o Ebola GP1,2 é ligado por CVN2 com dois locais de ligação de alta afinidade na faixa nanomolar inferior usando o glicano de envelope sem um domínio transmembrana. No presente estudo, a ligação da glicoproteína spike (S) monomérica multiespecífica CV-N à glicoproteína spike (S) do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) é medida em K D = 18,6 μM em comparação com a K_D nanomolar para esses outros picos de vírus, e através de seu domínio de ligação ao receptor na faixa μ molar média.

Introdução

A atividade antiviral associada à tetherin é induzida por α interferon, e compreende amarras à base de proteínas, que levam à retenção de virions totalmente formados em superfícies celulares infectadas¹. A necessidade de glicosilação por amarrina na inibição da liberação do vírus permanece incerta, implicando a importância dos padrões de glicosilação em glicanos expressos recombinantemente para estudos in vitro ^1,2, o que depende da conformação de (no caso do vírus da gripe) hemaglutinina da gripe expressa superficialmente ^3,4 . Observou-se que a modificação do oligossacarídeo amarrado à glicosilação ligada a N é suficiente para a restrição mediada por teia da liberação do HIV tipo 1², enquanto a dimerização desempenha um papel essencial na prevenção da liberação do vírus, envolvendo assim o domínio transmembrana ou a âncora glicosil-fosfatidil-inositol (GPI) para amarrar os virions em brotamento⁵ . Características exclusivas são descritas para a amarrina humana e murina para bloquear vários vírus envelopados, retrovírus e filovírus. A BST-2/tetherin é uma proteína antiviral induzível por interferon da imunidade inata^1,6, atuando com atividade antiviral de amplo espectro e é antagonizada pelas glicoproteínas^{do envelope 5} para translocar a tetherin ou interromper a estrutura da tetherin ⁶. Por exemplo, a glicoproteína HA do envelope expresso superficialmente e a neuraminidase no vírus influenza A são bem conhecidas pelo antagonismo da teina de maneira específica da cepa⁷, facilitando o reconhecimento dos locais de ligação do receptor hospedeiro⁸. Os anticorpos direcionados ao glicano são estudados na estequiometria de suas interações com os escudos glicanos de rápida personalização no AH, resultando em afinidade de ligação aos subtipos 4 H3N2 e H1N1^da influenza A.

Para elucidar os mecanismos de ligação entre agentes antivirais e picos de envelope de vírus, ou seja, ligantes de carboidratos e métodos imunológicos e espectroscópicos complementares, metades mono, di- e tri-manose são sintetizadas quimicamente. Os peptídeos manosilados, são criados via glicosilação azida de glicosil {beta}-peracetato para a transformação de azidas de glicosila 1,2-trans⁹, imitando a N-acetilglucosamina tipicamente encontrada e oligossacarídeos de alto manose na superfície de vírus com risco de vida. Os bioisósteros triazólicos são utilizados para imitar ligações que formam o resíduo manosilado do peptídeo HA¹⁰ e facilitar interações site-specific com derivados antivirais CV-N em torno do segundo ponto de glicosilação ligado a N no domínio da cabeça de AH (topo de AH com 4 glicanos ligados a N N54, N97, N181, N301)8,11,12 . As interações entre o ácido glutâmico (Glu) e a arginina (Arg) e o dipolo de hélice resultante manifestaram boa estabilidade de ambos os peptídeos modelo e proteínas, mas são visualizadas usando SPR. Se comparado com o reconhecimento de um único sítio de glicosilação quimicamente sintetizado no HA¹⁰, inibindo diretamente a ligação do receptor nas metades de glicano, uma maior afinidade de uma estrutura Fc mutada de quatro locais ao seu receptor é mostrada para provocar funções efetoras in vivo, revelando a composição não relacionada de glicanos ligados a N ligados ao mutante Fc a ser determinada mecanicamente¹³.

O CV-N apresenta atividade antiviral contra o HIV 14,15, influenza¹⁶ e vírus Ebola, que é mediada pela ligação nanomolar a modificações de oligossacarídeos de alta manose em proteínas spike do envelope^12,17,18,19. Determina-se que a ligação do AH influenza a um sítio de ligação a carboidratos (H) de alta afinidade em CV-N ou dois Hs em CVN2 dimérico covalentemente ligado tem constantes de dissociação de equilíbrio (K D) = 5,7 nM (Figura 1A) e K_D = 2,7 nM, respectivamente. Tanto o CV-N quanto o CVN2 abrigam outro um ou dois sítios de ligação a carboidratos (L) de baixa afinidade 12,17,20,21. O Ebola GP1,2 liga-se a 2H de CVN2 com afinidades na faixa nanomolar inferior (K_D = 26 nM). A CV-N WT vinculando-se ao Ebola GP1,2 e HA apresenta afinidades de K D = 34 nM a K_D = 5,7 nM (A/New York/55/04)¹². As lectinas, como a CV-N, que visam especificamente glicanos de alta manose nos envelopes virais, inibem ainda mais a replicação do vírus da hepatite C, SARS-CoV, herpesvírus, vírus de Marburg e vírus do sarampo²².

A pequena molécula CV-N tem sido estudada minuciosamente há mais de 20 anos, pois se funcionaliza para se ligar a uma ampla gama de vírus para inibir a entrada viral^16,18. Análises estruturais e ensaios de afinidade de ligação indicam reticulação de dois Ls em um dímero CVN2 trocado por domínio por ligação bivalente na faixa micromolar para aumentar a avidez às glicoproteínas do envelope viral^10,19. A ligação seletiva de Manα1-2Manα nos braços D1D3 de Man(8) e Man(9) compreende dois locais de ligação de diferentes afinidades localizados em protômeros de proteínas opostas²⁰, alcançando, assim, afinidades de ligação nanomolar (Figura 1B). Assim, o CVN2 é considerado um pseudo-anticorpo quanto à sua aplicação para ligar epítopos na gp120 do HIV, semelhante aos anticorpos neutralizantes do vírus¹⁷. Neste documento, o autor está interessado em investigar a potencial ligação do CVN2 ao pico do SARS-CoV-2 através do seu domínio de ligação ao receptor (RBD). Curvas de ligação da enzima conversora de angiotensina humana imobilizada (ECA)-2 com o SARS-CoV-2 RBD resultam em K_D = 4,7 nM para essa interação de ligação biologicamente relevante²³.

Por outro lado, classes selecionadas de imunoglobulinas reconhecem padrões proteicos estruturais específicos e consistentes, que conferem um substrato para a maturação por afinidade nas regiões de AH ancoradas na membrana²⁴. O CV-N mostra atividade altamente potente em quase todos os vírus influenza A e B¹⁶, sendo um agente antiviral amplamente neutralizante. Nosso conhecimento é incompleto sobre a localização de epítopos direcionados no caule de HA1 e HA2 que possivelmente envolvem estruturas epitópicas para direcionamento de glicano por anticorpos altamente neutralizantes e em comparação com a ligação à^{lectina 25}.

Figura 1: Representação esquemática do ensaio de ligação SPR para CV-N a espículas de envelope de vírus. (A) Ensaio SPR para ligação de CV-N ao ligante: proteína de comprimento total HA (90 kDa). Conjunto de dados cinéticos (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 0 nM) mostrando ligação duplamente referenciada em tempo real à influenza HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) Ligação da variante V2 do CVN2L0 ao ligante imobilizado DM dentro de uma faixa de concentração de 500 nM a 16 μM. Sequência: Os resíduos de L são destacados em amarelo. Os resíduos de H são destacados em cinza. E58 e R73 são um substituto para cisteínas na proteína selvagem e fazem da V2 uma dobra proteica estável com três em vez de quatro ligações dissulfeto Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Enquanto o escudo glicano na parte superior do AH membrana-distal induz uma ligação de alta afinidade ao CV-N 12, a ligação do CVN2 ao AH adjacente a uma ponte dissulfeto da parte superior do AH tem sido observada em seus locais de baixa afinidade^10,12. Várias interações polares e locais de interação são identificados na ligação a carboidratos pelo CV-N. Essas interações são verificadas por meio da geração de variantes knock-out no sítio de ligação para correlacionar afinidades de ligação com a glicosilação predita in silico ¹². Assim, o projeto visa comparar peptídeos HA quimicamente manosilados previamente testados em afinidade e especificidade de ligação com sequências peptídicas curtas de picos de 2019-nCoV relacionados ao SARS e SARS-CoV-2, ocorrendo naturalmente modificados por um pequeno número de diferentes locais de glicosilação ligados a N e glicosilação ligada a O. Usando microscopia crioeletrônica e ensaios de ligação, Pinto e colaboradores relatam um anticorpo monoclonal, S309, que potencialmente reconhece um epítopo na proteína spike SARS-CoV-2 contendo um glicano conservado dentro do subgênero Sarbecovirus, sem competir com a ligação do receptor²⁶. O protocolo deste estudo descreve como projetar, expressar e caracterizar variantes de CV-N são importantes para estudar como CV-N e CVN2 se ligam a proteínas glicosiladas e peptídeos manosilados sintéticos utilizando a tecnologia SPR^10,12.

O dímero ligado a tandem CVN2L0²⁷ e as variantes de local de ligação (V2-V5) são expressas de forma recombinante e as variantes estão com substituições de ligação dissulfeto (C58E e C73R) (Figura 2A). Além disso, um mutante com uma mutação de ponto único E41A é preparado porque esta posição tem sido vista como um resíduo de contato cruzado intermolecular. Este mutante é outra molécula interessante para medições de ligação SPR entre a lectina e oligossacarídeos de alta manose decifrando domínios de ligação e permite a comparação com a forma dimérica. A estrutura cristalina trocada por domínio do CVN2 mostra um ligador flexível, que se estende entre 49 e 54 resíduos. Os dois domínios podem continuar se movendo ao redor da dobradiça como corpos rígidos, desenvolvendo um monômero através de interações de domínio intramolecular (domínio A -resíduos 1-39;90-101- com domínio B -resíduos 40-89) ou um dímero por troca de domínio intermolecular [domínio A (do primeiro monômero) com domínio B (do segundo) e domínio B (do primeiro monômero) com domínio A (da segunda cópia)]. Não há interações próximas entre os domínios A e B dos dois protômeros, com exceção de Glu41²⁸. O gene para CV-N pode ser desenvolvido usando um método de PCR repetitivo com oligos^{sintetizados 40-mer 29} e é então subclonado nos sítios NdeI e BamHI de pET11a para transformação (eletroporação) em células eletrocompetentes, conforme descrito por Keeffe, J.R.27. A proteína, que é usada para alcançar a respectiva estrutura cristalina (PDB ID 3S3Y), inclui uma etiqueta de purificação N-terminal de 6 histidinas seguida por um local de clivagem da protease do Fator Xa. A mutagênese dirigida ao local é utilizada para fazer mutações pontuais, alternar códons e inserir ou excluir bases ou códons únicos ou múltiplos para troca de aminoácidos. Essas transformações fornecem informações inestimáveis sobre a função e a estrutura das proteínas. CV-N, CVN2 e CVN3 recombinantemente expressos e purificados têm sido biofisicamente bem estudados^20,21,27, são de baixa produção e, portanto^, utilizados para caracterizar ensaios de ligação a glicanos imobilizados em chips de sensor SPR. O ensaio imunoenzimático convencional (ELISA) fornece menor reprodutibilidade em relação à técnica de imobilização de ligantes de glicano e transforma a ligação em tempo real de várias variantes do local de ligação, o que é mostrado para SPR, em ensaios de desfecho.

A variante de afinidade de ligação CVN2L0-V2 (uma dobra intacta de CV-N homodimérico com uma substituição de ponte dissulfeto¹⁰) é expressa com uma etiqueta His-em Escherichia coli (E. coli), purificada sobre a coluna Ni-NTA aplicando cromatografia de afinidade e testada quanto à ligação a HA (H3N2), peptídeo HA monomanisílico e peptídeo HA dimanosilado usando SPR. Peptídeos quimicamente manosilados, ou proteínas HA e S, todos são ligantes e amina acoplados à superfície do chip hidrofílico através de ésteres reativos ou engenharia de proteínas de biotina-estreptavidina. O mesmo procedimento de corridas sequenciais é aplicado a esses ligantes, injetando várias diluições de CV-N e variantes de CV-N (e CVN2) para obter informações cinéticas para as análises de interação molecular, conforme descrito abaixo³⁰. O chip sensor SPR imobilizado por RBD é usado para estudos de ligação de peptídeos CV-N a S, e as afinidades são comparadas à ligação do SARS-CoV-2 com a ACE2 humana.

Protocolo

Para o presente estudo, uma proteína de fusão modificadora semelhante à ubiquitina (SUMO) CVN foi usada em ensaios de imunoabsorção enzimática em vez de CV-N e é adequada para ensaios baseados em células. A proteína recombinante de comprimento total do vírus da gripe A HA H3 é obtida comercialmente (ver Tabela de Materiais) ou expressa em linhagens celulares HEK293 de mamíferos e células de insetos infectadas por baculovírus de acordo com protocolos padrão¹². A proteína spike Wuhan-1 é expressa em células HEK293 de mamíferos. A síntese de peptídeo monomanosilado (MM) e peptídeo dimanosilado (DM) permite a detecção de ligantes homogêneos para CVN2 e molécula pequena monomanosilada¹⁰.

1. Criando construções CV-N

1. Para cada uma das variantes CVN2 e proteína CVN2L0 (PDB ID 3S3Y), obtenha a construção do gene com uma sequência líder de pelB N-terminal e His-tag no vetor pET27b(+) de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais, Arquivo Suplementar 1).
2. Obter CVN2L0 e suas variantes (V2, V3, V4 e V5; Figura 2A,C) no fundo de um gene modelo CVN2L0 que consiste em duas sequências de DNA distintas para cada repetição CV-N.
3. Dissolver o DNA plasmidial liofilizado em água destilada desionizada estéril (ddH₂O) até uma concentração final de 100 ng/μL.

2. Preparação de placas de ágar LB com células transformadas de DNA plasmídico

1. Preparar o meio de cultura LB-Lennox dissolvendo 10 g/L de peptona, 5 g/L de extracto de levedura e 5 g/L de NaCl em ddH₂O (ver Tabela de Materiais) e ajustar o pH para 7,4. Efectuar a transformação em E. coli BL21 (DE3) competente para cada variante (V2-V5) por método químico, de acordo com um relatório¹⁰ publicado anteriormente.
2. Divida a solução (900 μL e 100 μL), transfira 100 μL em placas de ágar LB (50 μg/mL de canamicina) e use suavemente um espalhador de células estéreis. Incubar as placas de ágar durante a noite a 37 °C.

3. Clonagem

1. Subclonar o gene para CV-N nos sítios NdeI e BamHI do pET11a (ver Tabela de Materiais) para transformação (electroporação) em células electrocompetentes seguindo a referência²⁷.

4. Mutagênese dirigida ao local

1. Gerar CVN2L0²⁹ e CVN-E41A mutante no fundo de um gene modelo CVN2L0 contendo duas sequências de DNA distintas para cada repetição CV-N²⁷.
2. Fazer mutações utilizando um kit de mutagénese sítio-dirigido (ver Tabela de Materiais) e primers mutagénicos específicos 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' e 5'-cctgaactctctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' para executar a PCR³¹.
   1. Inicie uma série de reações de amostra usando múltiplas concentrações de DNA de fita dupla (dsDNA) variando de 5-50 ng (por exemplo, 5, 10, 20 e 50 ng de molde de dsDNA). Mantenha a concentração do primer constante.
      NOTA: A mistura de PCR e o protocolo de ciclo térmico são geralmente utilizados conforme descrito no manual de instruções para o kit de mutagénese dirigida ao local³².
3. Adicione a enzima de restrição Dpn I (1 μL, 10 U/μL, ver Tabela de Materiais) abaixo da sobreposição de óleo mineral. Misture bem e suavemente as reações, gire para baixo em uma microcentrífuga de mesa por 1 min e incube imediatamente a 37 °C por 1 h para digerir o dsDNA superenrolado parental.

5. Transformação de células bacterianas

1. Descongele as células supercompetentes XL1-Blue (ver Tabela de Materiais) suavemente sobre o gelo. Para transformar cada controle e reação da amostra, alíquota das células supercompetentes (50 μL) a um tubo de fundo redondo de polipropileno pré-resfriado (14 mL).
   1. Transfira 1 μL do DNA de fita simples tratado com Dpn I (ssDNA) de cada reação de controle e amostra (ssDNA mutado) para alíquotas separadas das células supercompetentes, que sintetizam a fita complementar. Gire as reações de transformação cuidadosamente para misturar e incubar as reações no gelo por 30 min.
      NOTA: Antes de transferir o DNA tratado com Dpn I para a reação de transformação, recomenda-se remover cuidadosamente qualquer óleo mineral restante da ponta da pipeta. Como um controle opcional, a eficiência de transformação das células supercompetentes XL1-Blue precisa ser verificada pela mistura de 0,1 ng/μL do plasmídeo de controle pUC18 (1 μL) com uma alíquota de 50 μL das células supercompetentes.
2. Aplicar pulso de calor às reações de transformação a 42 °C durante 45 s e, em seguida, colocar as reações no gelo durante 2 minutos.
   NOTA: O pulso de calor aplicado já foi otimizado para as condições mencionadas em tubos de fundo redondo de polipropileno (14 mL).
3. Adicionar 0,5 mL de caldo NZY+ (contendo por litro: 10 g de amina NZ (hidrolisado de caseína), 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl, 12,5 mL de 1 M MgCl 2, 12,5 mL de 1 M MgSO₄, 10 mL de glicose₂ M, pH 7,5 e pré-aquecido a 42 °C) e incubar as reações de transformação a 37 °C com agitação a 225-250 rpm por 1 h. Chapear o volume correto de cada reação de transformação (5 μL da transformação plasmídica de controle; 250 μL da transformação da amostra) em placas de ágar LB-ampicilina.
   NOTA: Para os controlos de transformação e mutagénese, espalhar células em placas de ágar LB-ampicilina com 5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-D-galactopiranosídeo (X-gal, 80 μg/ml) e isopropil-1-tio-β-D-galactopiranosídeo (IPTG, 20 mM) (ver Tabela de Materiais). Inocular 50 mL das culturas celulares com uma única colônia de E transformado. células coli para purificar o DNA plasmídico mutado para análises. A mutagênese é confirmada pelo sequenciamento de DNA em uma instalação externa.

6. Expressão e purificação de proteínas

1. Para uma cultura em larga escala, inocular uma pequena quantidade de LB (contendo ampicilina) com uma única colônia da placa transformada.
2. Utilizando a cultura noturna, inocular a expressão cultura com aditivos, como 10 mM de MgCl₂, 10 mM de MgSO₄ e 20 mM de glicose, diluindo a cultura de sementes para 1/100.
   1. Cultivar células com agitação vigorosa a 37 °C. Cultivar células para um Abs 600 nm entre 0,4-0,6 (fase intermediária) antes de resfriar as células a 20 °C. Induza com 1 mM IPTG e cresça durante a noite.
   2. Em seguida, colher as células por centrifugação a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante com uma pipeta.
3. Ressuspender o pellet celular em tampão salino tamponada com fosfato (PBS) e recentrifugar a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C. Em seguida, descarte o sobrenadante com uma pipeta. Ressuspender o pellet restante em 10 mL de tampão de lise e incubar a suspensão por 1 h a 37 °C.
   NOTA: Composição do tampão de lise: (50 mM de NaH 2 PO₄, 300 mM de NaCl, 2% de Triton-X100, 500 ng/mL de lisozima, 1 mM de fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF), 1 mM de ditiotreitol, 1 mM de MgCl₂, pH 8, ver Tabela de Materiais).
   1. Sujeitar a mistura a dois ciclos de congelamento-descongelamento (-80 °C). Separe as fracções solúveis e insolúveis por centrifugação a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C e analise-as utilizando electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), em particular, dodecil sulfato de sódio (SDS)-PAGE³³ (Figura 2B,C).
      NOTA: As células podem ser lisadas de várias maneiras, como congelamento-descongelamento, sonicação, homogeneização, lise enzimática ou uma combinação desses métodos. A purificação a partir de corpos de inclusão é recomendada para a coleta de altos rendimentos proteicos²⁶.
4. Purificar proteínas utilizando cromatografia em coluna de Ni-NTA (ver Tabela de Materiais). Carregar a fração solúvel sobre uma coluna de grânulos de Ni-NTA regenerados (1 mL/min). Lave o sistema com tampão TBS (50 mM de Tris, 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,5) antes de iniciar um gradiente (0-100% 500 mM de imidazol em TBS acima de 60 min) e coletar frações (1 mL/min). Dializar as proteínas purificadas para caracterização bioquímica contra PBS 100 mM (Figura 2C,D).
5. Alternativamente, use o gel de afinidade His-Select Ni 2+ (ver Tabela de Materiais) em tubos de 14 mL para ligar e ressuspender seu CV-N expresso recombinantemente em soluções tampão com imidazol 20 mM e imidazol²⁵⁰ mM, respectivamente. Incubar em lote por pelo menos 30 min.
   NOTA: Aplique estas proteínas semi-purificadas a uma coluna pré-embalada de uso único para troca tampão e limpeza de amostras biológicas, por exemplo, carboidratos e proteínas, que podem carregar 1-1,5 mL de eluído a partir de cromatografia de afinidade de metal imobilizado.
6. Transferir as soluções proteicas para tubos de centrifugação com um filtro de corte de 10 kDa (ver Tabela de Materiais) e concentrá-las por centrifugação durante 10 minutos a 4.500 x g e 4 °C. Para medições de SPR, troque as soluções a analisar por 10 mM de HEPES, cloreto de sódio de 150 mM, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) de 3 mM e Tween20 a 0,05%, pH 7,4 (HBS-EP(+), ver Tabela de Materiais).
   1. Adicionar este tampão de funcionamento SPR a um factor de diluição de 1:10 e centrifugar quatro vezes até ao volume inicial durante 10 min a 4.500 x g e 4 °C.
7. Determinar a concentração de proteína a 280 nm usando um espectrofotômetro NanoDrop UV-Vis (ver Tabela de Materiais) com base no coeficiente de extinção calculado (20.440 M-1 ^cm-1) para a proteína principal CVN2L0 mostrando um tamanho de 23.474 Da³⁴. Use PBS (100 mM, pH 7,0) ou tampão SPR como um espaço em branco e meça a concentração de proteína em três etapas de diluição (1:1, 1:10 e 1:100).

Figura 2: Sequências e expressão de CV-N. (A) CVN2 sem um ligador entre cada repetição de CV-N (101 aminoácidos cada) e quatro pontes de dissulfeto é expresso no vetor pET11a em E. coli. (B) Expressões de duas colônias independentes para CV-N (monômero) e CVN2 (dímero). (C) As variantes de ligação dissulfeto são purificadas e analisadas no SDS-PAGE. Um marcador de baixo peso molecular (6 μL) é usado como referência. WT = CVN2L0 com quatro pontes de dissulfeto conforme marcado em (A). V2 é uma variante com uma substituição de ligação dissulfeto por resíduos polares nas posições 58 e 73. V3-V5 são variantes com duas ligações S-S restantes e polares (C58E-C73R) ou apolares (C58W-C73M) substituindo aminoácidos ou uma combinação dessas substituições de pares de resíduos. (D) Os cromatogramas de HPLC de CVN2L0 purificado são elutados a uma taxa de fluxo de 1 mL/min com um gradiente linear de 5%-65% tampão B no tampão A acima de 30 min. O tampão A é: 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético em ddH₂O, tampão B é: 0,08% (v/v) de ácido trifluoroacético em acetonitrila. A proteína é analisada em uma coluna de sílica gel de alto desempenho 300-5-C4 (150 x 4,6 mm) a 214 nm e 280 nm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Espectroscopia SPR

1. Use o sistema SPR de canal duplo (consulte Tabela de materiais) com o tampão de funcionamento HBS-EP(+) e a glicina HCl de 10 mM pH 1,5-1,6 como tampão de regeneração. Ligue o instrumento, o desgaseificador, o amostrador automático e a bomba e lave todo o sistema com ddH₂0 por 1 h. Coloque o buffer em execução pronto para uso em um frasco separado.
2. Solte o óleo de emersão no detector e monte um chip sensor de vidro (consulte Tabela de Materiais) revestido com uma fina película de ouro e no lado superior funcionalizado com hidrogel de carboximetildextrana diretamente no detector abaixo da célula de fluxo de três portas. Corrija a configuração puxando o manuseamento para baixo.
   NOTA: C19RBDHC30M 200 nm estreptavidina derivada carboximetildextran hidrogel com uma densidade média de síndrome respiratória aguda grave biotinilada coronavírus-2 RBD proteína, é um sensorchip pronto para uso com o ligante pré-imobilizado.

8. Ensaio de ligação SPR para ligação CV-N a HA, proteína S e RBD

1. Imobilize os ligantes proteicos para chips sensores seguindo as etapas abaixo.
   1. Abra uma tabela de execução clicando em Formulário na barra de menus e em Executar Editor de Tabela no software SPRAutoLink integrado (consulte Tabela de Materiais). Escolha e clique em BASIC_Immobilization na lista de tabelas de execução disponíveis e siga as etapas do procedimento experimental na tela do computador. O respectivo Editor de Exemplo usado é mostrado no canto superior direito.
   2. Clique em Sample Set Editor na seção Formulário para preencher a lista de reagentes para dois racks colocados no amostrador automático para análises adicionais. Clique em Autosampler Direct Control como uma "Ferramenta" na barra de menus para trazer os racks para frente ou de volta para casa. Escolha 4 °C como temperatura de funcionamento.
      NOTA: O software SPR permite o "Controle Direto do Instrumento SPR" e o "Controle Direto da Bomba" através da seleção das ferramentas correspondentes, bem como do manuseio do amostrador automático e clicando em Formulário; também Executar Editor de Tabela, Data-Plot ou Pós-Processamento pode ser escolhido para executar a análise de dados. Os arquivos são salvos diretamente no diretório padrão e exportados como scrubber.files da janela Pós-processamento.
2. Inicie a bomba para infundir ddH₂0 clicando em Ferramentas e Controle Direto da Bomba e registre os dados clicando em Controle Direto do Instrumento SPR e, cada vez, Inicie nas janelas recém-exibidas. Coloque os reagentes de acoplamento (passo 8.3) em frascos para injetáveis de 300 μL, coloque-os nos racks do amostrador automático e inicie a tabela de execução clicando em Executar.
   NOTA: As superfícies dos cavacos são condicionadas com tampão de glicina de 10 mM pH 9,0 ou podem ter sido lavadas com cloreto de sódio 1 M, tampão de borato de sódio 0,1 M pH 9,0 para condicionar a superfície do chip derivado carboxila para a mistura de ativação EDC/NHS³⁰.
3. Para esta interação proteína-proteína simples, use o chip CMD500D (ver Tabela de Materiais) para gerar uma unidade de índice de micro-refração (μRIU) = 2500 - 3000 célula de fluxo com HA imobilizado e μRIU = 400 célula de fluxo com proteína spike. A uma taxa de fluxo de infusão de 15 μL/min, injetar uma mistura aquosa e igual de 0,4 M de cloridrato de carbodiimida N-etil-N'-(dimetilaminopropil) (EDC*HCl) e 0,1 M de N-hidroxisuccinimida (NHS) aplicando as seguintes etapas sequenciais.
   1. Reencher a bomba de recarga a 25.000 μL/min, realizar o ajuste da linha de base por 30 s, injetar 90 μL de solução de ativação da amostra (EDC/NHS) durante 6 minutos de tempo de contato e, em seguida, segure por mais 5 minutos.
   2. Repita este ciclo após a linha de base correr por 1 min a 10 μL/min apenas na célula de fluxo esquerda (azul) para injetar e imobilizar peptídeos^{quimicamente sintetizados 10}, HA e proteína spike a 20 μg/mL, e permitir o ajuste basal subsequente com ddH₂O por 1,5 min antes de extinguir a superfície do chip ativado com 1 M de etanolamina HCl pH 8,5.
4. Mudar os tubos do amostrador líquido para o desgaseificador de ddH₂0 para o frasco com HBS-EP(+) (figura suplementar 1).
5. Analise os sensorgramas SPR.
   1. Para realizar estudos cinéticos, use várias concentrações de analitos (^10-5-10-8 M), com uma etapa de regeneração após cada injeção e medições em branco após diferentes analitos. Altere a taxa de fluxo para 10 μL/min e inicie as injeções por 4 minutos de tempo de contato, depois 5 min de geração basal e duas etapas de regeneração de 2 min cada com um intervalo de 30 s.
   2. Injetar a solução tampão para medições em branco cujos sensorgramas são subtraídos das amostragens para normalizar diferentes concentrações de proteínas.
6. Clique em Formulário, role para baixo e altere para "Pós-processamento" clicando neste modo de operação. Clique em Adicionar para selecionar curvas de ligação geradas ao longo do tempo no Formulário de Gráfico de Dados para cada célula de fluxo e exporte a sobreposição como um arquivo de depuração (.ovr). Clique em Arquivo para abrir as opções de salvamento de arquivos. Obter curvas de resposta alinhando as curvas esquerda e direita e subtraindo os sinais do segundo canal de referência dos do canal ligante.
   NOTA: Os dados são operados em "Pós-Processamento" definindo sensorgramas computacionalmente. É colocado em uma sobreposição de sensorgramas de células de fluxo esquerda e direita, ou representado como sensorgramas da diferença de ambos os canais.
7. Limpe todo o fluídico com tampão de glicina 50-100 mM pH 9,5, água e etanol a 20% antes e depois das medições de ligação para remover vestígios de sal ou qualquer contaminação proteica, ou mais rigoroso, com SDS a 0,5% e glicina.
   NOTA: Para evitar danos ao instrumento, recomenda-se verificar a estabilidade mecânica do chip de vidro antes de reinserir o cartucho do chip no instrumento se os chips tiverem sido armazenados sob buffer ou a 100% de umidade.

Resultados

Uma molécula CVN2L0 trocada por domínio dimérico é testada para ligação à região superior do AH em três experimentos SPR separados e a afinidade de ligação é apresentada em valores de K_D. Assume-se que o domínio B compreende sítios de ligação H, que são impactados pela substituição de uma ligação dissulfeto em resíduos iônicos, e o domínio A forma L^10,18. Injeções únicas de CVN2L0 e variantes V2 (três pontes de dissulfeto) e...

Discussão

A afinidade de ligação do CV-N está correlacionada com o número de sites de ligação funcionais [2H nos domínios B e 2L no(s) domínio(s) A, quando projetados como dímero trocado por domínio]. Uma variante com uma afinidade de ligação alterada (CVN2L0-V2, uma prega estável homodimérica de CV-N compreendendo um knock-out de ponte dissulfeto) é expressa em E. coli, purificada e testada positivamente para ligação à proteína HA (H3N2) usando SPR¹⁰, e mostra uma mudança confo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Äkta primeplus	Cytiva
Amicon tubes	Merck	C7715
Ampillicin	Sigma-Aldrich	A5354
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge	Beckman Coulter	B06320
Cell spreader	Sigma-Aldrich	HS86655	silver stainless steel, bar L 33 mm
Custom DNA Oligos	Sigma-Aldrich	OLIGO
Custom Gensynthesis	GenScript	#1390661	cloning vector: pET27b(+)
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL	Thermo Scientific	50-105-5354
Dionex UlitMate 3000	Thermo Scientific	IQLAAAGABHFAPBMBFB
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL)	Fisher Scientific	ER1701
DTT	Merck	DTT-RO
EDC	Merck	39391
EDTA	Merck	E9884
Eppendorf Safe-Lock Tubes	Eppendorf	30120086
Eppendorf Safe-Lock Tubes	Eppendorf	30120094
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge	Sigma-Aldrich	Z606235
Ethanol	Merck	51976
Ethanolamine HCl	Merck	E6133
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack	Corning	352057
Glucose	Merck	G8270
Glycine HCl	Merck	55097
HA H3 protein	Abcam	ab69751
HEPES	Merck	H3375
His-select Ni2+	Merck	H0537
Imidazole	Merck	I2399
IPTG	Merck	I6758
Kanamycin A	Sigma-Aldrich	K1377
Kromasil 300-5-C4	Nouryon
LB agar	Merck	52062
LB agar	Merck	19344
LB Lennox	Merck	L3022
Lysozyme	Merck	10837059001
Magnesium chloride	Merck	M8266
Magnesium sulfate	Merck	M7506
NaH2P04	Merck	S0751
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000CLAPTOP
NaOH	Merck	S5881
NHS	Merck	130672
NZ amine (casein hydrolysate)	Merck	C0626
PBS	Merck	806552
PD MidiTrap G-10	Sigma-Aldrich	GE28-9180-11
Peptone	Merck	70171
pET11a	Merck Millipore (Novagen)	69436
PMSF	Merck	PMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000)	Qiagen	27106X4
Reichert Software Package Autolink1-1-9	Reichert
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System	Reichert
Scrubber2-2012-09-04 for data analysis	Reichert
SDS	Merck	11667289001
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid	Stratagene	#200518
Sodim chloride	Merck	S9888
Sodium acetate.Trihydrate	Merck	236500
SPR sensor chip C19RBDHC30M	XanTec bioanalytics	SCR C19RBDHC30M
SPR sensor chip CMD500D	XanTec bioanalytics	SCR CMD500D
Sterilin Standard 90mm Petri Dishes	Thermo Scientific	101R20
TBS	Merck	T5912	10x, solution
Triton-X100	Merck	T8787
Tryptone	Merck	93657
Tween20	Merck	P1379
Vortex-Genie 2 Mixer	Merck	Z258423
X-gal	Merck	XGAL-RO
XL1-Blue Supercompetent Cells	Stratagene	#200236
Yeast extract	Merck	Y1625