Sığır Oositinde Mitokondriyal DNA'yı Azaltmak için Biseksiyon Kullanımı

Özet

Burada, bir sığır oositindeki mitokondriyal DNA kopya sayılarını önemli ölçüde azaltmak için bir protokol sunuyoruz (P < 0.0001). Bu yöntem, oosit mitokondrisini önemli ölçüde azaltmak için santrifüjleme ve biseksiyon kullanır ve yeniden yapılandırılmış türler arası somatik hücre nükleer transfer embriyolarında gelişme şansının artmasına izin verebilir.

Özet

Türler arası somatik hücre nükleer transferi (iSCNT), nesli tükenmekte olan türleri kurtarmak için kullanılabilir, ancak yeniden yapılandırılmış embriyoda iki ayrı mitokondriyal DNA (mtDNA) popülasyonu bulunur: biri alıcı ooplazmasında ve diğeri donör somatik hücrede. Bu mitokondriyal heteroplazmi, embriyo ve fetüste gelişimsel sorunlara yol açabilir. El yapımı klonlama protokolleri, mtDNA kopya sayısını azaltmak için kullanılabilecek ve yeniden yapılandırılmış bir embriyodaki mitokondriyal heteroplazmi derecesini azaltan oosit biseksiyonunu içerir. Reddedilmiş, olgun sığır oositlerinin santrifüjlenmesi, yumurtanın bir kutbunda görünür bir mitokondri-yoğun fraksiyon üretti. Oositlerin zonae pellucidae'leri bir pronaz çözeltisine maruz bırakılarak çıkarıldı. Biseksiyon, görünür mitokondri fraksiyonunu çıkarmak için bir mikrobıçak kullanılarak gerçekleştirildi. qPCR, tüm oositlerden ve biseke edilmiş ooplastlardan ekstrakte edilen DNA örneklerinde bulunan mtDNA'yı ölçmek için kullanıldı ve biseksiyondan önce ve sonra mtDNA kopya sayılarının karşılaştırılmasını sağladı. Kopya sayıları, döngü eşik değerleri, standart bir eğrinin regresyon çizgisi formülü ve mtDNA PCR ürünlerinin ve genomik PCR ürünlerinin ilgili boyutlarını içeren bir oran kullanılarak hesaplandı. Bir sığır oositinin ortalama mtDNA kopya sayısı (± standart sapma) 137.904 ± 94.768 (n = 38) idi. Bir mitokondri tükenmiş ooplastın ortalama mtDNA kopya sayısı 8,442 ± 13,806'dır (n = 33). Mitokondri bakımından zengin bir ooplastta bulunan ortalama mtDNA kopyaları 79.390 ± 58.526 mtDNA kopyasıydı (n = 28). Bu hesaplanan ortalamalar arasındaki farklar, santrifüjleme ve müteakip biseksiyonun, orijinal oosit ile karşılaştırıldığında mitokondri tükenmiş ooplastta bulunan mtDNA kopya sayılarını önemli ölçüde azaltabileceğini göstermektedir (P < 0.0001, tek yönlü ANOVA tarafından belirlenir). mtDNA'daki azalma, yeniden yapılandırılmış bir embriyodaki mitokondriyal heteroplazmi derecesini azaltmalı ve muhtemelen standart embriyonik ve fetal gelişimi teşvik etmelidir. Somatik donör hücreden mitokondriyal ekstrakt ile takviye de başarılı embriyonik gelişim elde etmek için gerekli olabilir.

Giriş

Somatik hücre nükleer transferi (SCNT), bir hayvandan enüklee edilmiş bir oositin ve aynı türdeki bir hayvandan bir somatik hücrenin füzyonunu içerir. Çoğu durumda, oosit ve somatik hücre aynı türden kaynaklanır ve canlı doğum oranları %6'nın ^{altındadır1}. Bazı araştırmalar, iki farklı türden kaynaklanan somatik bir hücre ve oositin füzyonunu içeren türler arası SCNT'nin (iSCNT) kullanımını içerir. Bu çalışmalarda, canlı doğum oranları SCNT'den bile daha düşüktür - tipik olarak% 1'den ^azdır1. Bununla birlikte, iSCNT, nesli tükenmekte olan türleri kurtarma yöntemi olarak kullanılma kapasitesine sahiptir, çünkü bu hayvanlardan gelen somatik hücreler germ hücrelerinden daha erişilebilirdir¹. iSCNT'de kullanılan alıcı oositler genellikle inekler, domuzlar ve fareler gibi evcil veya yaygın laboratuvar türleridir. Şimdiye kadar yapılan bazı girişimler başarılı bir şekilde canlı genç üretmişlerdir, ancak üretilen yavrular intrajenerik hayvanlar olmuştur (alıcı oosit türleri ve donör hücre türleri aynı cinsin üyeleriydi)^2,3,4. Interjenerik modeller (farklı cinslerdeki hayvanlardan bir oosit ve somatik hücre kullanan) henüz canlı hayvanlar üretmemiştir ve yeniden yapılandırılmış embriyoların çoğu, in vitro gelişimin 8-16 hücre aşamasında tutuklanır ^5,6,7,8. Bu embriyonik gelişimsel arrestin olası bir açıklaması, embriyolarda mitokondriyal heteroplazminin ortaya çıkmasıdır - tek bir hücrede birden fazla mitokondri DNA (mtDNA) tipinin varlığı. Heteroplazmi, embriyoda veya canlı hayvanda gelişimsel verimsizlik veya başarısızlık gibi sorunlara yol açabilir¹. Patogenez, hayvanın yaşamının ilerleyen dönemlerinde de ortaya çıkabilir⁹. Bu sorun SCNT yavrularında da mevcut olmasına rağmen, iSCNT embriyolarındaki interspesifik bileşen sorunu daha da kötüleştirmektedir.

Embriyonik mtDNA iki farklı türden geldiğinde, çoğunluğu temsil eden alıcı oosit mitokondri, donör hücrenin çekirdeği^1,10 ile verimli veya etkili bir şekilde çalışmaz. iSCNT'de kullanılan iki tür arasındaki daha büyük taksonomik boşluklar muhtemelen bu sorunu yoğunlaştırır; Üretilen intrajenerik canlı yavruların (Bos taurus oositleri kullanan Bos gaurus ve Bos indicus yavruları) yanı sıra geleneksel SCNT yoluyla üretilen yavruların (örneğin, Ovis koç oositleri kullanan Yumurtalık Koç yavruları) kimera olduğu gösterilmiştir (bu hayvanlarda iki kişiden mtDNA^{mevcuttu 11,12,13}). Yine de, interjenerik SCNT embriyoları ^14,15'ten çok daha fazla geliştiler. Oosit mitokondrisi ile donör hücrenin çekirdeği arasındaki bilgi alışverişi, intrajenerik embriyoda interjenerik embriyodan daha başarılı olabilir¹⁶.

Olgun bir sığır oositindeki mtDNA miktarı, bir somatik hücrede bulunan miktardan yaklaşık 100 kat daha fazladır¹². Bu oranın azaltılması, somatik hücreli mitokondrinin yeniden yapılandırılmış embriyo içinde çoğalmasını teşvik edebilir ve daha büyük bir üretken mitokondri popülasyonunun bulunmasına izin verebilir¹⁶. Bu da gelişmekte olan embriyonun gereksinimlerini karşılamak için daha fazla enerji sağlayabilir¹⁵. Oosit veya embriyonun mtDNA kopya sayısını azaltmak için yapılan önceki girişimler arasında kimyasal uygulama, mikromanipülasyon ve yumurta veya embriyonun donör hücre türlerinden^{16,17,18,19,20} ek mitokondri ile takviye edilmesi yer almaktadır. Bununla birlikte, kimyasal uygulama (2',3'-dideoksisitidin gibi) embriyonik gelişim için ideal değildir ve oosit mtDNA kopya sayılarını yaklaşık yarı yarıya¹⁸ oranında azaltmıştır. Mikromanipülasyon ile önceki oosit mtDNA indirgemesi, oositin mtDNA^17'sinin sadece% 64'ünü çıkarmıştır. Donör hücre mitokondrisinin takviyesi uygulanabilir bir seçenek olsa da, kullanımı henüz iSCNT çalışmaları^21'de canlı bir interjenerik hayvan üretmemiştir.

Oosit mtDNA kopya sayısını azaltmak için biseksiyon kullanımı henüz yayınlanmış çalışmalarda kullanılmamıştır. Ooblastları somatik bir hücre ile kaynaştırmak amacıyla oositlerin ikiye bölünmesi, tipik olarak polar cismi ve metafaz plakasını metafaz II (MII) oositinden çıkarma yöntemi olarak kullanılan el yapımı klonlamanın (HMC) öncülü. HMC, keçiler, sığırlar, domuzlar, koyunlar ve atlar^{22,23,24,25,26} dahil olmak üzere çeşitli türlerde başarıyla yavru üretmiştir^, ancak tipik olarak biseksiyondan önce bir santrifüjleme adımı içermez. Yumurtanın yüksek hızlı santrifüjlenmesinin entegre edilmesi, oositin bir kutbunda mitokondrinin (ve dolayısıyla mtDNA'nın) izolasyonuna izin verir, bu da daha sonra bu mitokondri-yoğun fraksiyonları çıkarmak için bir mikrobıçak kullanılarak ikiye bölünebilir. İki mitokondri tükenmiş ooplast, HMC'de olduğu gibi, oosit türlerinden önemli ölçüde daha az mtDNA içeren yeniden yapılandırılmış bir embriyo oluşturmak için somatik bir hücre ile kaynaştırılabilir.

Bu protokolle cevaplamaya çalıştığımız soru, daha az heteroplazmik mtDNA içeren uygulanabilir bir yeniden yapılandırılmış embriyo üretmek için sığır oositindeki mtDNA'nın nasıl azaltılacağıdır. Bu protokolde oositler santrifüj edilmiş ve ikiye bölünmüştür. Ooplast ve bozulmamış oosit mtDNA kopya sayıları, bu tekniğin sığır oositinin mtDNA kopya sayısını azaltmadaki etkinliğini belirlemek için hesaplandı.

Protokol

Aşağıdaki protokol, Utah Eyalet Üniversitesi tarafından sağlanan hayvan bakımı ve etik kurallarına uymaktadır.

1. Medya hazırlığı

1. Yumurta elleçlemeden önce, Tablo 1'de açıklandığı gibi aşağıdaki çözeltileri hazırlayın: 400 μL Hyaluronidaz Çözeltisi, 500 μL T2 ortamı, 1.020 μL T20 ortamı ve 800 μL T10 ortamı.
2. T10 ortamını dört delikli bir plakanın iki kuyucuğuna, kuyu başına 400 μL'ye bölün. Bir kuyuyu "M" ile, ikincisini "MR" ile etiketleyin. Biseksiyon sonrasına kadar%_5'lik bir CO 2 inkübatörüne yerleştirin.
3. HEPES (HSOF) ile 500 μL Sitochalasin B (CB) / Sentetik Oviduktal Sıvı hazırlayın. Ayrı bir 1,5 mL santrifüj tüpüne 50 μL CB/HSOF çözeltisi alın.
4. 40 μL pronaz çözeltisi hazırlayın. 2.680 x g'de en az 30 s santrifüj. Süpernatantın 20 μL'sini 20 μL T2 ile yeni bir santrifüj tüpüne karıştırın; bu, seyreltilmiş, 5 mg / mL pronaz çözeltisi oluşturur.
5. 3 mL HSOF hazırlayın. Bir arama plakasında, ayrı ayrı dört adet 400 μL damla biriktirin; Bu plakayı bir stereomikroskop altına yerleştirin.
6. 500 μL CB / T20 çözeltisi hazırlayın.

2. Sığır oositlerinin in vitro olgunlaşması (IVM)

1. IVM: Kültür aspire edilen kümülüs-oosit kompleksleri (COC'ler) 38.5 °C'de, %10 FBS,_0.26 IU/mL FSH ve 100 U/mL penisilin/streptomisin içeren dört kuyucuklu bir olgunlaşma ortamı kabında 21 saat boyunca %5 CO 2 inkübatörde.
2. Yumurtaları inkar etmek için aşağıdaki adımları uygulayın.
   1. 200 μL'lik bir pipet kullanarak istenen sayıda COC'yi toplayın ve bunları 1,5 μL'lik bir santrifüj tüpünün altına yerleştirin.
   2. Oositlerle birlikte santrifüj tüpüne aynı hacimde 0.6 mg / mL hyaluronidaz ekleyin (yani, oositlerin ve IVM ortamının hacmi 100 μL ise, 100 μL hyaluronidaz ekleyin).
   3. Tüm kümülüs hücreleri çıkarılana kadar çözeltiyi kabarcıklar oluşturmadan yukarı ve aşağı pipetleyin.
3. Yumurtaların olgunlaşmasını kontrol edin.
   1. Pipet, arama plakasındaki dört HSOF damlasından birinden oosit/hyaluronidaz çözeltisine 200 μL HSOF eklemek için kullanın.
   2. Yumurtaları hyaluronidaz / HSOF damlasından aktarın ve kullanılmayan 400 μL HSOF damlasına yerleştirin. Hyaluronidaz ve kümülüs hücresi kalıntılarının giderilmesine yardımcı olmak için iki ek HSOF damlası ile yıkayın.
   3. Bir ağız pipeti (veya 10 μL pipet ve uç) ve yüksek mikroskobik büyütme kullanarak, polar vücut varlığına göre yumurtaları yuvarlayın ve seçin.
   4. Yumurtaları ayıkladıktan sonra, ikiye bölünecek istenen sayıda MII oositini toplayın ve bunları 400 μL HSOF damlasına yerleştirin.
      NOT: Yumurtalar 30 dakikadan daha uzun süre inkübatörün dışındaysa, oositler tekrar bir olgunlaşma ortamı kuyusuna yerleştirilebilir ve en az 30 dakika dinlenmek üzere CO₂ kontrollü bir inkübatöre yerleştirilebilir. Biseke edilecek yumurta sayısını, inkübasyon dışındaki süreyi en aza indirmek için yaklaşık 30 dakika içinde biseksiyonu bitirmek için mümkün olan bir miktarla sınırlandırın. Ooblastlar somatik bir hücre ile kaynaştırılacak, aktive edilecek ve embriyo olarak kültürlenecekse, oositler şu anda enüklee edilmelidir.

3. Yumurtaların santrifüjlenmesi

NOT: Oositler inkübatöre olgunlaşma ortamında yerleştirildiyse, onları en son toplandıkları HSOF damlasına taşıyın.

1. Bir ağız pipeti kullanarak, seçilen olgun oositleri HSOF damlasından toplayın ve bunları HSOF / CB çözeltisinin 50 μL'sini içeren 1,5 mL tüpe yerleştirin. Yumurtaları 12 dakika boyunca 15.000 x g'de santrifüj yapın.
   NOT: Santrifüj tüpünde kabarcıkların bulunması zararlı değildir.
2. Yumurtalar santrifüj edilirken, biseksiyon plakasını hazırlayın.
   1. Deseni 60 mm'lik bir petri kabının kapağında (damla başına 20 μL) Şekil 1'de gösterildiği gibi yapın ve damlaları mineral yağ ile tamamen örtün.
   2. İnce uçlu bir işaretleyici kullanarak, Şekil 2'de gösterildiği gibi çanağın altındaki çizgileri işaretleyin.
      1. Pronaz damlasının etrafına bir kutu ve CB / T20 damlaları ile T20 damlalarının alt sırası arasında bir çizgi çizin.
   3. Mikrodamlaların ozmolarite değişikliklerini önlemek için santrifüjleme tamamlanana kadar kabı opak bir kapakla örtün.
3. Santrifüjleme tamamlanır tamamlanmaz, çözelti içindeki yumurtaları toplamak için 200 μL'lik bir pipet kullanın ve bunları dört adet 400 μL HSOF damlası ile yeni bir arama plakasının boş bir kısmına taşıyın.
4. Yumurtaları toplayın ve dört HSOF damlasından yıkayın.

Resim 1: Bisection plakası. Gösterilen tüm damlalar 20 μL hacme sahiptir. Plaka 60 mm çapa sahiptir. Damlalar tamamen mineral yağ ile kaplanmıştır. Oositler ilk önce en üstteki ve en soldaki T2 damlasına yerleştirilecektir (burada bir yıldızla gösterilir). PRO/T2: 10 μL pronaz ve 10 μL T2, mikrodamlalar oluşturulmadan önce birleştirilir. CB / T20: 1 mL T20 başına 1 μL sitokalasin B, mikrodamlalar oluşturmadan önce birleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 2: İşaretli biseksiyon plakası. Mikroskop altında yapılan gözlemler ve oosit ve ooplast transferleri için konum referansları sağlamak amacıyla plakanın altına ince uçlu bir işaretleyici ile çizgiler çizilir. Oositler ilk önce en üstteki ve en soldaki T2 damlasına yerleştirilecektir (burada bir yıldızla gösterilir). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Biseksiyon için oositin hazırlanması

NOT: Aşağıdaki işlem, oositlerin biseksiyon için hazırlanmasını içerir.

1. Isıtma aşamasını 37 °C'ye getirin.
2. Santrifüjlü yumurtaları HSOF damlasından biseksiyon plakasının sol üst T2 damlasına taşımak için bir ağız pipeti kullanın, ardından yumurtaları üst sıradaki sonraki üç damladan (T2, T20, T20) yıkayın.
3. Yumurtaları pronaz damlalarından birine koyun, aralarında çok az temas olduğundan veya hiç temas olmadığından emin olun.
   NOT: Zona pellucida'nın çıkarılması değişen miktarlarda zaman alabilir, ancak tipik olarak bir ısıtma aşamasının kullanılmasıyla 30-120 s arasında gerçekleşir. Isıtma aşamasının olmaması bu süreyi uzatacaktır.
4. Zonae pellucidae'de belirgin bir deformasyon olana kadar oositleri gözlemleyin (bkz. Şekil 3).
5. Tek bir oosit zona pellucida deforme olduğunda, bu oositi komşu T2 damlasına taşıyın. Ek oositler deforme olurken, tüm oositler pronazdan çıkarılıp T2 damlasına yerleştirilene kadar tekrarlayın.
6. Pellucida bölgesinin sadece ince bir tabakası kalana kadar yumurtaları gözlemleyin.
7. Yumurtaları sıradaki sonraki üç damla boyunca yıkayın (T2, T20, T20), ardından CB / T20 damlaları içinde dikey çizgiler halinde biriktirin (bkz. Şekil 4).
   1. Dikey çizgilerde daha az oosit ile başlayın ve biseksiyon becerileri ilerledikçe damla başına oosit sayısını artırın.

Şekil 3: Pronaz kullanılarak zona pellucida'nın çıkarılması. (80x) Bir oosit zona pellucida, pronaz zona pellucida'yı oositin bitişik T2 damlasına taşınması için yeterince etkilediğinde deforme olmaya başlayacaktır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Biseksiyon damlalarında oosit oryantasyonu . (80x) Zonasız oositler, bieksiyondan önce her CB / T20 damlasında dikey bir yönde biriktirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Yumurtaların biseksiyonu

1. Oositler içeren ilk, en soldaki CB / T20 (biseksiyon) damlasına odaklanın ve yumurtaları döndürmek için bir ağız pipeti kullanın, böylece her oositin mitokondri yoğun kısmı mikroskopun koluna doğru veya uzağa bakar.
   NOT: Mitokondri yoğun kısım, santrifüjlemeyi takiben oositin en karanlık kısmı olarak görünen lipitler içermeyecektir.
2. Mikrobıçağın ucunu, mitokondri yoğun kısmın hemen üzerindeki boşluğa paralel olarak, en üstteki oositin soluna yerleştirin. Bıçağın ucunu aynı yerde tutarak, yumurtanın içinden tamamen kesmek için bıçağı dikkatlice indirin.
   1. Mitokondri yoğun ooplast ve mitokondri indirgenmiş ooplastın boyut olarak benzer olduğundan emin olun; biseksiyon, iki ooplast üretmek için her oositi ikiye bölmelidir.
      NOT: Tek bir oositten üretilen ooplastların karşılaştırmalı boyutları araştırma hedeflerine göre değişebilir; mitokondri indirgenmiş ooplastlar somatik bir hücre ile kaynaştırılacaksa, hacimleri mitokondri yoğun ooplastlardan daha büyük olmalıdır.
   2. Bıçağın oositi mitokondri yoğun kısmın üstünde ve lipit yoğun kısmın altında, santrifüjlü oositin en berrak segmentinde ikiye böldüğünden emin olun.
3. Bıçağı kaldırırken, aynı çizginin korunduğundan ve bıçağın ucunun aynı yerde kaldığından emin olun, ardından ucu plakadan yavaşça kaldırın.
4. İlk biseksiyon damlasındaki tüm oositler için biseksiyon adımlarını tekrarlayın. Ek damlalarda oositler varsa, kalan yumurtaları yönlendirin ve ikiye bölün.
5. Bir ağız pipeti kullanarak, ilk biseksiyon damlasından mitokondri indirgenmiş ooplastları toplayın. Bunları plakanın alt satırında bulunan sol taraftaki T20 damlasına yerleştirin. Kalan tüm biseksiyon damlaları için tekrarlayın.
   NOT: Mitokondri indirgenmiş ooplastlar, yumurtanın geri kalanından daha koyu renkli lipitler içerecektir.
6. Bir ağız pipeti kullanarak, ilk biseksiyon damlasından mitokondri yoğun ooplastları toplayın. Bunları plakanın alt satırında bulunan sağ taraftaki T20 damlasına yerleştirin. Kalan tüm biseksiyon damlaları için tekrarlayın.
   NOT: Mitokondri yoğun bölgeler, görünüşte açık gri olacak görünür bir organel konglomerasyonuna sahip olacaktır.
7. T10 dört kuyucuklu tabağı inkübatörden alın. Bir ağız pipeti kullanarak, tüm mitokondri indirgenmiş ooplastları "MR" etiketli kuyuya taşıyın ve mitokondri yoğun ooblastları "M" etiketli kuyuya taşıyın.
8. Dört delikli plakayı CO₂ kontrollü inkübatöre geri yerleştirin. Ooblastların mtDNA'nın nicelleştirilmesinden önce en az 30 dakika dinlenmesine izin verin.

6. mtDNA'nın nicelleştirilmesi

1. Tek tek örneklerden (tek oositler, tek mitokondri-yoğun ooplastlar, tek mitokondri-tükenmiş ooplastlar) DNA çıkarmak için küçük bir numuneden materyal çıkarmak için tasarlanmış bir DNA ekstraksiyon kiti kullanın.
2. DNA'nın her bir örnekten başarıyla çıkarıldığından emin olmak için seçtiğiniz bir DNA niceleme yöntemini kullanın. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) o anda tamamlanmayacaksa, ekstrakte edilen DNA'yı -80 ° C'lik bir dondurucuda etiketli bir tüpte dondurun.
3. qPCR gerçekleştirme
   1. Astar dizileri ile birlikte her qPCR tüpüne eklenecek her bir reaktifin hacmini belirlemek için Tablo 2'ye bakın. Bu primerler, sığır mtDNA'sının 12S bölgesini yükseltmek için tasarlanmıştır.
   2. İlk denatürasyon süresini 10 dakika için ayarlayın, ardından 35 döngü: 94 ° C'de 30 s denatürasyon, 60 ° C'de 15 s tavlama ve 72 ° C'de 15 s uzatma. Reaksiyon tamamlandığında, döngü eşiği (C_t) değerlerini kaydedin.
      NOT: Göreceli mtDNA kopya numarası değerlerini elde etmek için, katlanarak artan, bilinen mtDNA kopya numaralarına sahip örnekler kullanılarak standart bir eğri üretilmelidir. Döngü eşik değerlerinin daha sonra göreceli mtDNA kopya sayılarını belirlemek için aşağıdaki formüller kullanılarak manipüle edilmesi gerekir.
   3. Aşağıdaki denklemi kullanarak DNA'nın konsantrasyonunu elde edin:
      DNA konsantrasyonu = (10 ^{(Ct-intercept/slope))} x test edilmiş hacim
   4. Aşağıdaki denklemi kullanarak kopya numarasını edinin:
      Kopya numarası =
   5. Aşağıdaki denklemi kullanarak kopya numarasını edinin:
      Hücre başına kopyalama sayısı = 2 x

Şekil 5: Somatik hücre mtDNA standart eğrisi. Bu standart eğri, qPCR reaktifleri ve protokol adım 6.3'te açıklandığı gibi program kullanılarak sığır somatik hücrelerinin logaritmik konsantrasyonlarının mtDNA nicelleştirilmesiyle oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Kantitatif PCR (qPCR) sonuçları, her bir ooplastta bulunan mtDNA'nın göreceli miktarlarını belirlemek için kullanılır. Tarif edilen reaksiyon, sığır mtDNA'sının 12S bölgesini büyütmek için tasarlanmıştır.

Biseksiyon başarılı olursa, tüm oositlerden ve mitokondri yoğun ooblastlardan alınan örnekler benzer C_t değerlerine sahip olacaktır. Mitokondri indirgenmiş ooplastlardan alınan örnekler, diğer iki gruptan alınan örneklere kıyasla daha yüksek C<...

Tartışmalar

Daha önce oositlerde mtDNA kopya sayılarını azaltmak için kullanılan yöntemlerin dezavantajları vardır. Mitokondrilerin oositlerden mikromanipülasyon temelli uzaklaştırılması, mtDNA kopya sayılarını ortalama %64 oranında ^azaltır27. Daha önce enükleasyon için kullanılan benzersiz bir yöntem, küçük çaplı Pasteur pipetlerin kullanılmasını ve bir mikrodamla ortam ile çevresindeki mineral yağ arasındaki sınırda zona pellucida içermeyen bir oositin bölünmesini iç...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	5408129
60 mm dish	Sigma-Aldrich	D8054
Centrifuge	Eppendorf	5424
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442
M199 Media	Sigma-Aldrich	M4530
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M8410
Mini Centrifuge	SCILOGEX	D1008
mtDNA Primer: Forward (12S)			GGGCTACATTCTCTACACCAAG
mtDNA Primer: Reverse (12S)			GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000
Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle	PFM Medical	207300633	Microblade for bisection
Protease/pronase	Sigma-Aldrich	P5147
QIAamp DNA Micro Kit	Qiagen	56304
QuantStudio™ 3 - 96-Well 0.2-mL	ThermoFisher	A28567
Search plate	Fisher Scientific	FB0875711A
SYBR Green qPCR Master Mix	ThermoFisher	K0221	qPCR master mix
Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF)
ThermoPlate	Tokai Hit	TPi-SMZSSX	Heating stage