使用二分法减少牛卵母细胞中的线粒体DNA

摘要

在这里，我们提出了一种方案，以显着减少牛卵母细胞中的线粒体DNA拷贝数（P <0.0001）。该方法利用离心和二分切来大大减少卵母细胞线粒体，并且可以增加在重建的种间体细胞核移植胚胎中发育的机会。

摘要

种间体细胞核转移（iSCNT）可用于拯救濒危物种，但重建的胚胎中存在两个不同的线粒体DNA（mtDNA）群体：一个在受体卵质内，一个在供体体细胞内。这种线粒体异质体可导致胚胎和胎儿的发育问题。手工克隆方案包括卵母细胞二裂，其可用于减少mtDNA拷贝数，降低重建胚胎中线粒体异质体的程度。离心剥脱的成熟牛卵母细胞在卵母细胞的一极产生可见的线粒体致密部分。卵母细胞的透明带通过暴露于原胶酶溶液中去除。使用微刀片进行一对剖除以除去可见的线粒体部分。qPCR用于量化从整个卵母细胞和双裂卵母细胞中提取的DNA样品中存在的mtDNA，从而提供了切片前后mtDNA拷贝数的比较。使用周期阈值、标准曲线的回归线公式以及包括 mtDNA PCR 产物和基因组 PCR 产物各自大小的比率来计算拷贝数。一头牛卵母细胞的平均mtDNA拷贝数（±标准差）为137，904±94，768（n = 38）。一个线粒体耗尽的ooplast的平均mtDNA拷贝数为8，442±13，806（n = 33）。存在于富含线粒体的卵巢中的平均mtDNA拷贝数为79，390±58，526个mtDNA拷贝（n = 28）。这些计算平均值之间的差异表明，与原始卵母细胞相比，离心和随后的平分可以显着降低线粒体耗尽的ooplast中存在的mtDNA拷贝数（P <0.0001，由单向方差分析确定）。mtDNA的减少应降低重建胚胎中线粒体异质体的程度，可能促进标准胚胎和胎儿发育。补充来自体细胞供体的线粒体提取物对于实现成功的胚胎发育也可能是必不可少的。

引言

体细胞核转移（SCNT）包括来自一只动物的去核卵母细胞和来自同一物种动物的体细胞的融合。在大多数情况下，卵母细胞和体细胞起源于同一物种，活产率低于6%¹。一些研究涉及使用种间SCNT（iSCNT），其中包括来自两个不同物种的体细胞和卵母细胞的融合。在这些研究中，活产率甚至低于SCNT，通常低于1%¹。然而，iSCNT有能力用作拯救濒危物种的方法，因为这些动物的体细胞比它们的生殖细胞更容易获得¹。iSCNT中使用的受体卵母细胞通常是家用或常见的实验室物种，如牛，猪和小鼠。到目前为止，一些尝试已经成功地生产出活的幼崽，尽管产生的后代是属内动物（受体卵母细胞物种和供体细胞物种是同一属的成员）^2，3，4。属间模型（利用来自不同属动物的卵母细胞和体细胞）尚未产生活体动物，大多数重建的胚胎在体外^发育的8-16细胞阶段停止5^，6，7，8。这种胚胎发....

研究方案

以下协议遵循犹他州立大学提供的动物护理和伦理指南。

1. 培养基准备

1. 在处理卵母细胞之前，准备以下溶液，如 表1所述：400μL透明质酸酶溶液，500μL T2培养基，1，020μL T20培养基和800μL T10培养基。
2. 将T10培养基分成四孔板的两个孔，每孔400μL。用“M”标记一个井，用“MR”标记第二个孔。放入5%CO₂ 培养箱中，直到切片后。
3. 用HEPES（HSOF）制备500μL细胞查拉菌素B（CB）/合成输卵管液。将50μLCB / HSOF溶液等分到单独的1.5 mL离心管中。
4. 准备40μL原酶溶液。以2，680 x g 离心至少30 秒。将20μL上清液与20μLT2混合到新的离心管中;形成稀释的5mg / mL蛋白酶溶液。
5. 准备 3 毫升高纯营养物质。在搜索板上，分别沉积四个400μL滴剂;将此板放在立体显微镜下。
6. 制备500μLCB / T20溶液。

2. 牛卵母细胞的 体外 成熟（IVM）

1. IVM：在含有10%FBS，0.26 IU / mL FSH和100 U / mL青霉素/链霉素的....

结果

定量 PCR （qPCR） 结果用于确定每个卵巢中存在的 mtDNA 的相对数量。所描述的反应旨在扩增牛mtDNA的12S区域。

如果二分切成功，来自整个卵母细胞和线粒体致密卵巢的样品将具有相似的C_t 值。与其他两组的样品相比，来自线粒体减少的ooplast的样品将具有更高的C_t 值。下图显示了显示成功对等的结果的C_t 图。这些结果表明，二分切确实有效地降低了线粒.......

讨论

以前用于减少卵母细胞中mtDNA拷贝数的方法有其各自的缺点。基于显微操作的卵母细胞线粒体去除使mtDNA拷贝数平均降低64%²⁷。以前用于去核的独特方法涉及使用小直径巴斯德移液器和在微滴介质和周围矿物油之间的边界处分裂无透明带卵母细胞。随着卵母细胞离心的利用，这种方法可以产生可行的线粒体减少的ooplasts²⁸。然而，离心和这种卵母细胞分裂方法的组.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	5408129
60 mm dish	Sigma-Aldrich	D8054
Centrifuge	Eppendorf	5424
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442
M199 Media	Sigma-Aldrich	M4530
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M8410
Mini Centrifuge	SCILOGEX	D1008
mtDNA Primer: Forward (12S)			GGGCTACATTCTCTACACCAAG
mtDNA Primer: Reverse (12S)			GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000
Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle	PFM Medical	207300633	Microblade for bisection
Protease/pronase	Sigma-Aldrich	P5147
QIAamp DNA Micro Kit	Qiagen	56304
QuantStudio™ 3 - 96-Well 0.2-mL	ThermoFisher	A28567
Search plate	Fisher Scientific	FB0875711A
SYBR Green qPCR Master Mix	ThermoFisher	K0221	qPCR master mix
Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF)
ThermoPlate	Tokai Hit	TPi-SMZSSX	Heating stage