Farelerde Parsiyel Hepatektomi Sonrası Rejenere Hepatositlerin İzolasyonu

Özet

Lipid yüklü hepatositler karaciğer rejenerasyonuna özgüdür, ancak genellikle yoğunluk gradyan santrifüjleme ile kaybolurlar. Burada, steatotik hepatositleri tutan ve farelerde parsiyel hepatektomi sonrası rejenere hepatositlerin temsili popülasyonlarını veren optimize edilmiş bir hücre izolasyon protokolü sunuyoruz.

Özet

Parsiyel hepatektomi, farelerde karaciğer rejenerasyonunu araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak aşağı akış tek hücreli uygulamalar için yüksek verimli hepatositlerin izolasyonu zordur. Farelerde normal karaciğer rejenerasyonunun ilk 2 günü boyunca rejenere hepatositler içinde belirgin bir lipit birikimi gözlenir. Geçici rejenerasyonla ilişkili steatoz (TRAS) olarak adlandırılan bu durum geçicidir ancak majör proliferatif faz ile kısmen örtüşür. Yoğunluk-gradyan saflaştırma, primer hepatositlerin izolasyonu için mevcut protokollerin çoğunun bel kemiğidir. Gradyan saflaştırma, hücrelerin yoğunluğuna ve boyutuna dayandığından, steatotik olmayanları steatotik hepatosit popülasyonlarından ayırır. Bu nedenle, yağlı hepatositler sıklıkla kaybolur ve temsili olmayan hepatosit fraksiyonları ortaya çıkar.

Sunulan protokol, lipid içeriğinden bağımsız olarak rejenere hepatositlerin in vivo izolasyonu için kolay ve güvenilir bir yöntem tanımlamaktadır. Erkek C57BL/6 farelerden alınan hepatositler, hepatektomiden 24-48 saat sonra klasik iki aşamalı kollajenaz perfüzyon yaklaşımı ile izole edilir. Standart bir peristaltik pompa, portal venden çıkışlı retrograd bir perfüzyon tekniği kullanarak, kateterize inferior vena kava yoluyla ısıtılmış çözeltileri kalıntıya yönlendirir. Hepatositler, Glisson kapsülünden salınmaları için kollajenaz ile ayrışır. Yıkama ve dikkatli santrifüjlemeden sonra, hepatositler herhangi bir aşağı akış analizi için kullanılabilir. Sonuç olarak, bu yazıda farelerde parsiyel hepatektomi sonrası temsili bir rejenere hepatosit popülasyonunun izolasyonu için basit ve tekrarlanabilir bir teknik anlatılmaktadır. Yöntem ayrıca yağlı karaciğer hastalığının çalışmasına da yardımcı olabilir.

Giriş

Karaciğer, büyük doku kaybından sonra bile kendini yenileyebilir. Bu eşsiz rejeneratif kapasite, ilk olarak 1931'de Higgins ve Anderson tarafından sıçanlarda tanımlanan kısmi (% 70) hepatektominin deneysel modeli ile açıkça gösterilmiştir¹. Bu modelde, karaciğerin% 70'i daha büyük karaciğer loblarını keserek hayvanlardan cerrahi olarak çıkarılır. Kalan loblar daha sonra orijinal karaciğer mimarisinin restorasyonu olmadan da olsa, ameliyattan yaklaşık 1 hafta sonra orijinal karaciğer kütlesini geri yüklemek için telafi edici hipertrofi yoluyla büyür ^2,3. Karaciğer kalıntısının iyileşmek ....

Protokol

Tüm hayvan deneyleri İsviçre Federal Hayvan Yönetmeliklerine uygundur ve Zürih Veterinerlik Ofisi (n° 007/2017, 156/2019) tarafından onaylanmıştır. 10-12 haftalık erkek C57BL / 6 fareleri, yiyecek ve suya serbest erişimi olan 12 saatlik bir gündüz / gece döngüsünde tutuldu. Her deney grubu altı ila sekiz hayvandan oluşuyordu. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, ekipmanlar ve reaktiflerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. Farelerde parsiyel hepatektomi

1. Standart hepatektomi için (%70), sol lateral lobu, medyan lobun sağ kısmını ve median lobun sol kısmını ligate ve rezeke edin....

Sonuçlar

RAS, hepatektomi sonrası 16 saatte zirve yapar ve standart hepatektomiden 32-48 saat sonra yavaş yavaş kaybolur, ancak genişletilmiş hepatektomiden sonra 48 saatin üzerinde devam eder. Makroskopik olarak, TRAS karaciğer kalıntısının soluk bir teni olarak kolayca görülebilir (Şekil 1F) ve ameliyattan sonra 16 saat ile 48 saat arasında hepatetomize farelerde görülebilir.

Tahmini nihai verim, farelerde %70 hepatektomi sonrası 10-15 × 10 6 hepatosit.......

Tartışmalar

Yayınlanan protokol, tek hücreli aşağı akış analizleri veya FACS sıralamayı takiben hücrelerin toplu analizi için yüksek miktarda normal ve steatotik murin hepatositlerini izole etmek için güvenilir ve basit bir yöntem sağlar. Yoğunluk gradyanı saflaştırmaya göre belirgin avantaj, hücresel lipit içeriğinin hepatositlerin etkili verimi üzerinde esasen hiçbir etkisi olmamasıdır. Böylece, steatotik hepatositlerin fraksiyonu korunacak ve aşağı akış analizlerine dahil edilecektir. Bu sadece s.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Alexa Fluor 488 Zombie green	BioLegend	423111	Amine-reactive viability dye
Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9%	Provet AG	QN01AB06	CAUTION: needs ventilation
EDTA solution	Sigma-Aldrich	E8008-100ML	-
Ethanol	Sigma-Aldrich	V001229	Dilute with water to 70%
Fetal bovine serum (FCS)	Gibco	A5256701	-
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red	Sigma-Aldrich	H9269-6x600ML	For digestion/preservation
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red	Sigma-Aldrich	H6648-6x500ML	For perfusion buffer
HEPES solution, 1 M	Sigma-Aldrich	83264-100ML-F	-
Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate)	B. Braun	1050052	For stabilization of cannulation site
Hoechst 33258 Staining Dye Solution	Abcam	ab228550	-
Liberase Research Grade	Roche	5401119001	Lyophilized collagenases I/II
NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer	B. Braun	123	-
Paralube Vet Ointment	Dechra	17033-211-38	-
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	A1286301	-
Sudan IV – Lipid staining	Sigma-Aldrich	V001423	-
Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL	Indivior Europe Ltd.	345928	Narcotics. Store securely.
Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered	Sigma-Aldrich	T8154	For cell counting
Williams’ Medium E	Sigma-Aldrich	W4128-500ML	-
Materials
25 mL serological pipette, Greiner Cellstar	Merck	P7865	-
50 mL Falcon tubes	TPP	-	-
BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G	BD Falcon	391349	-
Cell scraper, rotating blade width 25 mm	TPP	99004	-
Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon	BD Falcon	352360	-
Fenestrated sterile surgical drape	-	-	Reusable cloth material
Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm)	Drifton	FILLINGNOZZLE#16	To go into the tubes
Flow cytometry tubes, 5 mL	BD Falcon	352008	-
Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm	Drifton	LM41	Connection tube to syringe
Petri dishes, 96 x 21 mm	TPP	93100	-
Prolene 5-0	Ethicon	8614H	To retract the sternum
Prolene 6-0	Ethicon	8695H	For skin suture
Prolene 8-0	Ethicon	EH7470E	Ligature gall bladder
Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm	Drifton	SC0374T	Perfusion tube
Equipment
BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer	BD	-	-
Isis rodent shaver	Aesculap	GT421	-
Isofluran station	Provet	-	-
Low-speed centrifuge – Scanspeed 416	Labogene	-	-
Neubauer-improved counting chamber	Marienfeld	-	-
Oxygen concentrator – EverFlo	Philips	1020007	0 – 5 L/min
Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix	TPP	94700	-
Shenchen perfusion pump – YZ1515x	Shenchen	YZ1515x	-
Surgical microscope – SZX9	Olympus	-	-
ThermoLux warming mat	Thermo Lux	-	-
Vortex Genie 2, 2700 UpM	NeoLab	7-0092	-
Water bath – Precision GP 02	Thermo scientific	-	Adjust to 42 °C