Isolamento di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi

Riepilogo

Gli epatociti carichi di lipidi sono inerenti alla rigenerazione del fegato, ma di solito vengono persi con la centrifugazione a gradiente di densità. Qui, presentiamo un protocollo di isolamento cellulare ottimizzato che mantiene gli epatociti steatosici, producendo popolazioni rappresentative di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi.

Abstract

L'epatectomia parziale è stata ampiamente utilizzata per studiare la rigenerazione epatica nei topi, ma l'isolamento di alte rese di epatociti vitali per applicazioni a valle di singole cellule è impegnativo. Un marcato accumulo di lipidi all'interno degli epatociti rigeneranti si osserva durante i primi 2 giorni di normale rigenerazione epatica nei topi. Questa cosiddetta steatosi associata alla rigenerazione transitoria (TRAS) è temporanea ma si sovrappone parzialmente alla fase proliferativa principale. La purificazione a gradiente di densità è la spina dorsale della maggior parte dei protocolli esistenti per l'isolamento degli epatociti primari. Poiché la purificazione del gradiente si basa sulla densità e sulla dimensione delle cellule, separa le popolazioni di epatociti non steatotici da quelli steatotici. Pertanto, gli epatociti grassi spesso vengono persi, producendo frazioni epatocitarie non rappresentative.

Il protocollo presentato descrive un metodo semplice e affidabile per l'isolamento in vivo degli epatociti rigeneranti indipendentemente dal loro contenuto lipidico. Gli epatociti di topi maschi C57BL/6 vengono isolati 24-48 ore dopo l'epatectomia mediante un classico approccio di perfusione della collagenasi in due fasi. Una pompa peristaltica standard guida le soluzioni riscaldate attraverso la vena cava inferiore cateterizzata nel resto, utilizzando una tecnica di perfusione retrograda con deflusso attraverso la vena porta. Gli epatociti sono dissociati dalla collagenasi per il loro rilascio dalla capsula di Glisson. Dopo il lavaggio e un'attenta centrifugazione, gli epatociti possono essere utilizzati per eventuali analisi a valle. In conclusione, questo articolo descrive una tecnica semplice e riproducibile per l'isolamento di una popolazione rappresentativa di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi. Il metodo può anche aiutare lo studio della malattia del fegato grasso.

Introduzione

Il fegato può rigenerarsi anche dopo una grave perdita di tessuto. Questa capacità rigenerativa unica è esplicitamente illustrata dal modello sperimentale di epatectomia parziale (70%), descritto per la prima volta nei ratti da Higgins e Anderson nel 1931¹. In questo modello, il 70% del fegato viene rimosso chirurgicamente dagli animali tagliando i lobi del fegato più grandi. I lobi rimanenti crescono quindi attraverso l'ipertrofia compensatoria per ripristinare la massa epatica originale entro circa 1 settimana dopo l'intervento chirurgico, anche se senza ripristino dell'architettura epatica originale ^2,3

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati conformi alle prescrizioni federali svizzere sugli animali e approvati dall'Ufficio veterinario di Zurigo (n. 007/2017, 156/2019) che garantisce l'assistenza umana. I topi maschi C57BL/6 di età compresa tra 10 e 12 settimane sono stati tenuti in un ciclo giorno/notte di 12 ore con libero accesso a cibo e acqua. Ogni gruppo sperimentale era composto da sei a otto animali. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, le attrezzature e i reagenti utilizzati in questo protocollo.

1. Epatectomia parziale nei topi

1. Per l'epate....

Risultati

La TRAS raggiunge il picco a 16 ore dopo l'epatectomia e gradualmente scompare 32-48 ore dopo l'epatectomia standard, ma persiste oltre le 48 ore dopo l'epatectomia prolungata. Macroscopicamente, TRAS è facilmente visibile come una carnagione pallida del residuo epatico (Figura 1F) e può essere osservato in topi epatectomizzati tra 16 h e 48 h dopo l'intervento chirurgico.

La resa finale stimata è di 10-15 × 10 6 epatociti dopo epatectomia al 70% e .......

Discussione

Il protocollo pubblicato fornisce un metodo affidabile e diretto per isolare un'alta resa di epatociti murini normali e steatotici per analisi a valle a singola cellula o analisi di massa di cellule dopo la selezione FACS. Il netto vantaggio rispetto alla purificazione del gradiente di densità è che il contenuto lipidico cellulare non ha essenzialmente alcun impatto sulla resa effettiva degli epatociti. Pertanto, la frazione di epatociti steatosici sarà mantenuta e inclusa nelle analisi a valle. Questo non è solo cru.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Alexa Fluor 488 Zombie green	BioLegend	423111	Amine-reactive viability dye
Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9%	Provet AG	QN01AB06	CAUTION: needs ventilation
EDTA solution	Sigma-Aldrich	E8008-100ML	-
Ethanol	Sigma-Aldrich	V001229	Dilute with water to 70%
Fetal bovine serum (FCS)	Gibco	A5256701	-
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red	Sigma-Aldrich	H9269-6x600ML	For digestion/preservation
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red	Sigma-Aldrich	H6648-6x500ML	For perfusion buffer
HEPES solution, 1 M	Sigma-Aldrich	83264-100ML-F	-
Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate)	B. Braun	1050052	For stabilization of cannulation site
Hoechst 33258 Staining Dye Solution	Abcam	ab228550	-
Liberase Research Grade	Roche	5401119001	Lyophilized collagenases I/II
NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer	B. Braun	123	-
Paralube Vet Ointment	Dechra	17033-211-38	-
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	A1286301	-
Sudan IV – Lipid staining	Sigma-Aldrich	V001423	-
Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL	Indivior Europe Ltd.	345928	Narcotics. Store securely.
Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered	Sigma-Aldrich	T8154	For cell counting
Williams’ Medium E	Sigma-Aldrich	W4128-500ML	-
Materials
25 mL serological pipette, Greiner Cellstar	Merck	P7865	-
50 mL Falcon tubes	TPP	-	-
BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G	BD Falcon	391349	-
Cell scraper, rotating blade width 25 mm	TPP	99004	-
Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon	BD Falcon	352360	-
Fenestrated sterile surgical drape	-	-	Reusable cloth material
Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm)	Drifton	FILLINGNOZZLE#16	To go into the tubes
Flow cytometry tubes, 5 mL	BD Falcon	352008	-
Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm	Drifton	LM41	Connection tube to syringe
Petri dishes, 96 x 21 mm	TPP	93100	-
Prolene 5-0	Ethicon	8614H	To retract the sternum
Prolene 6-0	Ethicon	8695H	For skin suture
Prolene 8-0	Ethicon	EH7470E	Ligature gall bladder
Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm	Drifton	SC0374T	Perfusion tube
Equipment
BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer	BD	-	-
Isis rodent shaver	Aesculap	GT421	-
Isofluran station	Provet	-	-
Low-speed centrifuge – Scanspeed 416	Labogene	-	-
Neubauer-improved counting chamber	Marienfeld	-	-
Oxygen concentrator – EverFlo	Philips	1020007	0 – 5 L/min
Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix	TPP	94700	-
Shenchen perfusion pump – YZ1515x	Shenchen	YZ1515x	-
Surgical microscope – SZX9	Olympus	-	-
ThermoLux warming mat	Thermo Lux	-	-
Vortex Genie 2, 2700 UpM	NeoLab	7-0092	-
Water bath – Precision GP 02	Thermo scientific	-	Adjust to 42 °C