Anaplastik Tiroid Kanserinin Spontan Murin Modeli

Özet

Burada, spontan genetiği değiştirilmiş fare modelleri ile murin ATC tümörleri elde etmek için standart bir boru hattı sunuyoruz. Ayrıca, primer ve metastaz yapmış lezyonlar hakkında tümör dinamikleri ve patolojik bilgiler sunulmuştur. Bu model, araştırmacıların tümörigenezi anlamalarına ve ilaç keşiflerini kolaylaştırmalarına yardımcı olacaktır.

Özet

Anaplastik tiroid kanseri (ATK) nadir görülen ancak ölümcül bir malignitedir ve kötü prognoza sahiptir. ATC'nin karsinogenezi ve gelişimi ile terapötik yöntemler hakkında daha derinlemesine araştırmalara acil ihtiyaç vardır, çünkü standart tedaviler ATC hastalarında esasen tükenmektedir. Bununla birlikte, düşük prevalansı kapsamlı klinik çalışmaları ve doku örneklerinin toplanmasını engellemiştir, bu nedenle etkili tedavilerin oluşturulmasında çok az ilerleme kaydedilmiştir. C57BL/6 arka planında koşullu olarak indüklenebilir bir ATC murin modeli (mATC) oluşturmak için genetik mühendisliğini kullandık. ATC murin modeli TPO-cre/ERT2 ile genotiplendirildi; Braf^CA/wt; Trp53 ex2-10^/ex2-10 ve tamoksifen ile intraperitoneal enjeksiyon ile indüklenir. Murin modeli ile tümör dinamikleri (tümör boyutu 4 aylık indüksiyondan sonra 12.4 mm2 ile 32.5^mm2 arasında değişmiştir), sağkalım (medyan sağkalım süresi 130 gün idi) ve metastaz (akciğer metastazları farelerin %91.6'sında meydana geldi) eğrilerini ve patolojik özellikleri (Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 ve Kaspaz-3 immünohistokimyasal boyama ile karakterize) araştırdık. Sonuçlar, spontan mATC'nin insan ATC tümörlerine oldukça benzer tümör dinamiklerine ve immünolojik mikroçevreye sahip olduğunu göstermiştir. Sonuç olarak, patofizyolojik özellikler ve birleşik genotiplerdeki yüksek benzerlik ile mATC modeli, klinik ATC dokusu ve örnek heterojenitesinin eksikliğini bir dereceye kadar çözmüştür. Bu nedenle, ATK'nın mekanizmasını ve translasyonel çalışmalarını kolaylaştıracak ve ATC için küçük moleküler ilaçların ve immünoterapi ajanlarının tedavi potansiyelini araştırmak için bir yaklaşım sağlayacaktır.

Giriş

Tiroid kanseri, tiroid epiteli kökenini en sık gören endokrin malignitelerden biridir¹. Son yıllarda tiroid kanseri insidansı tüm dünyada hızla artmıştır². Tiroid kanseri, tümör hücresi farklılaşma derecesine göre farklı tiplere ayrılabilir. Klinik davranış ve histoloji temelinde, tiroid karsinomları papiller tiroid karsinomu (PTC) ve foliküler tiroid karsinomu (FTC), kötü diferansiye karsinom (PDTC) ve tiroidin diferansiye edilmemiş veya anaplastik karsinomu (ATC)³ dahil olmak üzere iyi diferansiye karsinomlara ayrılır. Hafif davranışlı ve daha iyi prognozlu⁴ yaygın bir tip olan PTC'nin aksine, ATC tüm tiroid tümörlerinin %2 ila %3'ünü oluşturan, nadir ve oldukça agresif bir malignitedir⁵. ATK nadir olmasına rağmen, tiroid kanserine bağlı ölümlerin yaklaşık %50'sinden sorumludur ve kasvetli sağkalım (6-8 ay)^6,7. ATC olgularının %50'sinden fazlası akciğer metastazı 8 olarak teşhis^edilir. ATC'nin agresif doğasına ek olarak, klinikte sınırlı etkili tedavi geliştirilmiştir. Bu nedenle ATC hastalarının kasvetli prognozu ^9,10,11'dir. Bu, ATK'nın gelişiminin ve tedavisinin altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında acilen daha derinlemesine çalışmalara ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir.

ATC'nin tümörigenezi dinamik bir farklılaşmamış süreçtir. Klinik çalışmaların her aşamasında insan tümör örneklerinin toplanmasındaki zorluk, iyi diferansiye karsinomlardan farklılaşmamış karsinomlara kadar gelişim mekanizmasının anlaşılmasını engellemiştir. Buna karşılık, murin ATC modellerinin (mATC) kullanımı, tüm tümörigenez seyrinde mATC örneklerinin toplanmasını desteklemektedir. Bu nedenle, dinamik farklılaşmamış süreci analiz ederek tümör oluşum mekanizmalarını daha iyi anlayabiliriz. Ek olarak, klinik ATC örneklerinin heterojenliği de moleküler mekanizmanın anlaşılmasındaki zorluğa katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, fareler aynı genetik geçmişleri paylaştılar ve benzer yaşam ortamlarında tutuldular ve her tümörün tutarlılığını sağladılar. Bu, ATC gelişiminin genelleştirilmiş rolünü keşfetmeyi kolaylaştırır^12,13,14. Ek olarak, mATC, anatomik lokalizasyonun ve dokuya özgü mikro çevrenin etkisini geri kazanabilen in situ bir tümör modelidir. Bu nedenle, yaygın olarak kullanılan immün yetmezlikli farelerle karşılaştırıldığında, mATC, sağlam bir bağışıklık sistemi ve bağışıklık mikroçevresi olan spontan bir murin modelidir.

Bu nedenle, dediferansiye tiroid karsinomunun patolojik özelliklerini yeniden üretebilen bir murin modeli olan C57BL/6 suşu ile şartlı olarak indüklenen mATC oluşturduk. Bu modele dayanarak, mATC'nin moleküler temeli, yapım fikirleri, patolojik özellikleri ve uygulamaları hakkında kısa bir genel bakış sunduk. Ayrıca tümör büyümesini, sağkalım süresini, metastazını ve mATC'nin patolojik özelliklerini gözlemledik ve raporladık. Bunun, diğer araştırmacıların bu modeli daha kolay kullanmalarına yardımcı olmak için bilgilendirici bir genel bakış olacağına inanıyoruz.

İlk olarak McFadden¹⁵ tarafından bildirildiği gibi koşullu indüklenebilir bir mATC modeli oluşturduk; Başlangıçta, fareler inşa ettik: TPO-cre / ERT2, Braf flox / wt ve Trp53^{flox / wt}. Spesifik olarak, TPO-cre / ERT2 fareleri, bir cre-ERT2 füzyon geninin (bir insan östrojen reseptörü ligand bağlanma alanına kaynaşmış bir cre rekombinaz) ekspresyonunu yönlendiren insan tiroid peroksidaz (TPO) promotörünü (tiroide özgü bir promotör) içeriyordu. Cre-ERT2 genellikle sitoplazma ile sınırlıdır ve çekirdeğe sadece tamoksifene maruz kaldığında girer, bu da cre'yi rekombinant enzim aktivitesi göstermeye teşvik eder. Fareler, loxP kanatlı sekanslar taşıyan farelerle çaprazlandığında, tamoksifen indüksiyonundan sonra, kre aracılı rekombinasyon, spesifik genlerde nakavt veya nakavt etme amacına ulaşmak için tiroid hücrelerindeki flokslu dizileri siler.

Ek olarak, Braf ^{flox / wt} fareleri, cre-loxP sistemine dayanan insan Braf'ın bir knock-in aleli. Braf^{flox / wt} murin transkripti, endojen ekzonlar 1-14 ve loxP kanatlı insan ekzonları 15-18 tarafından kodlanır. Flokslu bölgelerin kreasyona aracılı eksizyonundan sonra, mutant ekzon 15 (insan kanserlerinde yapısal olarak aktif Braf V600E ile bağlantılı bir^V600E amino asit ikamesi ile modifiye edilmiş) ve endojen ekzonlar 16-18 transkriptleri oluşturmak için kullanılır. Ayrıca, Trp53 ^{flox / wt} fareleri, insan Trp53'ün nakavt alelleridir ve Trp53'ün ekzonları 2-10'u çevreleyen loxP bölgelerine sahiptir. Bir cre rekombinaz ile farelerle çaprazlandığında, cre-mediated rekombinasyon, Trp53'ü nakavt etmek için flokslu diziyi siler. Daha sonra, TB elde etmek için TPO-cre / ERT2, Braf flox / w ve Trp53^{flox / wt} fareleri çaprazlandı (TPO-cre^/ ERT2; Braf^floks/wt) fareler ve TBP (TPO-cre/ERT2; Braf^{floks/ağırlık}; Trp53^{floks/ağırlık}) PTC ve ATC üretmek için kullanılabilecek fareler. Yaklaşık 8 hafta sonra, fareler, iki uygulama için mısır yağında çözünmüş 150 mg / kg tamoksifenin intraperitoneal (i.p.) uygulaması ile indüklendi. Tümör büyümesi yüksek frekanslı ultrasonografi ile izlenebilir (ultrasonografinin ilk zaman noktası Gün 0 olarak kaydedildi). İlk ultrasonografi tamoksifen girişinden 40 gün sonra yapıldı.

Protokol

Burada açıklanan hayvan prosedürleri, Batı Çin Hastanesi, Sichuan Üniversitesi, Chengdu, Sichuan, Çin Hayvan Etik Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirilmiştir.

1. TBP farelerin indüksiyonu

1. Farelerin genotipini tanımlayın
   1. Yaklaşık 3 haftada, dişi fareleri erkek farelerden ayırın. Aynı zamanda, bir kulak etiketini sabitlemek için kulak etiketi kelepçesini kullanın. Kulak etiketlerini kulağın alt yarısına ve orta üçte birine yerleştirin, en yüksek kılcal damar konsantrasyonuna sahip alandan kaçındığınızdan emin olun.
   2. Fareleri nazikçe ama güvenli bir şekilde kısıtlayın. Fare kuyruğunun tabanına sıkıca tutun. Fareleri kavramalarını sağlayacak bir yüzeye yerleştirin.
   3. Serbest eli nazikçe ama sıkıca omuzların üzerine yerleştirin, ardından boynun tırnağını başparmak ve işaret parmağı arasında hızlıca kavrayın. Kuyruğu serçe parmağınızla tutun.
   4. Kuyruğu alkolle sürün. Cilt örneğini <5 mm kesmek için steril makas kullanın ve etiketli temiz bir numune kabına koyun. Farelerin kürkünü çıkarmak gerekli değildir. Hemostaz elde etmek için kuyruğu steril süngerlerle sıkıştırın.
   5. Daha sonra, murin kuyruğunu lize edin ve genotipi tanımlamak için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirin.
      NOT: Bir murin kuyruğunu kestikten sonra, murin kuyrukları arasındaki genlerin karşılıklı kontaminasyonunu önlemek için makasın yüzeyi alkollü pamukla silinmelidir. Onları kafeslerine yerleştirdikten sonra, fareler yara bölgesinde herhangi bir kanama belirtisi aramak için 5 dakika boyunca izlenmelidir. Bu çalışmada kullanılan primerlerin listesi ve PCR ayarları için Tablo 1'e bakın.
2. Tamoksifen kaynaklı TBP fareleri
   1. 0.3 g tamoksifen tartın ve ultrasonla 15 mL mısır yağı içinde çözün (güç =% 20, süre = 20 dakika, sıcaklık = 4 ° C), 20 mg / mL'lik bir konsantrasyonda. 4 °C'de saklayın.
      NOT: Tamoksifen ışığa duyarlıdır ve kahverengi bir kaba yerleştirilmesi gerekir.
   2. Yaklaşık 8 haftada, fareleri elektronik terazilerle tartın ve onlara 1 hafta arayla iki kez uygulanan 150 mg / kg'lık bir dozda bir i.p. tamoksifen enjeksiyonu yapın.

2. Fare tiroid tümörlerinin ve metastatik tümörlerin diseksiyonu ve görüntülenmesi

1. Hazırlık
   1. Diseksiyon aletlerini hazırlayın: steril makas ve forseps, steril bıçak,% 75 alkol sprey şişesi, 20 cm düz kenar, vernier kaliperleri, kağıt havlular ve alkol pamuğu.
   2. Fare doku sabitleme çözeltisi:% 4 paraformaldehit doku sabitleme çözeltisi hazırlayın.
   3. Geçici doku depolaması için yaklaşık 10 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurulmuş 10 cm'lik bir kabı temizleyin ve doku yüzeyindeki kanı yıkayın.
2. Tiroid ekstraksiyonu
   1. Fareleri karbondioksit ile 5 dakika boyunca 2.0 L / dak akış hızında ötenazi yapın. Fareleri kafesten çıkarın ve servikal çıkık yapın.
   2. Fareyi diseksiyon tahtasına ventral tarafı yukarı bakacak ve başı deneyciden uzağa yerleştirin ve uzuvları steril şırınga iğneleriyle diseksiyon tahtasına sabitleyin. Tiroid dokusunun daha rahat bir şekilde çıkarılması için, kafayı sabitlemek için başka bir steril şırınga iğnesi kullanın.
   3. Boynu, bir klorheksidin veya povidon-iyot ovma ve ardından %75 alkol içeren üç alternatif turla dezenfekte edin. Daha sonra, klavikulanın merkezinin üzerinde steril makas ve forseps ile küçük bir kesi yapın.
   4. Kesi orta hattını ağza kadar devam ettirin. Submandibuler bezi bulun ve tiroid kıkırdak ve trakeanın yanına yerleştirilen tiroidin anatomik yerini ortaya çıkarmak için çıkarın.
   5. Tiroidi bulun, tiroidi boyun bölgesinin geri kalanından steril makasla dikkatlice diseke edin, ardından çıkarılan tiroidi 10 mL steril PBS ile doldurulmuş 10 cm'lik bir kaba koyun.
      NOT: Tiroid bezinin çıkarılması sırasında nazik ve yavaş olun ve boyun kan damarlarını kesmekten kaçının. Boyun damarları kesilirse, boyun hemen kanla doldurulur ve tiroidin anatomik yerini ortaya çıkarmak için kan derhal alkol süngerleriyle çıkarılmalıdır. Tiroid dokusunu çıkarmadan önce, çıkarıldıktan sonra tiroidin sol ve sağ lobları arasında ayrım yapamamak için tiroidin sol ve sağ loblarının özelliklerini (boyut, şekil vb.) dikkatlice gözlemleyin.
   6. Steril PBS'de, kanı tiroid dokusunun yüzeyinden steril makasla çıkarın ve trakeayı dikkatlice kesin. Ardından, tiroid dokusunu steril bir bez üzerine koyun ve tiroid bezinin sol ve sağ loblarının boyutunu vernier kumpaslarla ölçün.
   7. Tiroid bezinin sol ve sağ loblarını steril bir bıçakla iki parçaya bölün. Bir kısmı fiksasyon için 2 mL% 4 paraformaldehit çözeltisine koyun ve diğer kısmı korumak için sıvı azot içine koyun.
3. Akciğer ve karaciğer ekstraksiyonu
   1. Karnı üç alternatif tur klorheksidin veya povidon-iyot ovma ve% 75 alkol ile dezenfekte edin. Ardından, farenin penisinin hemen üstüne sıkıştırın ve küçük bir kesi yapın, karın orta çizgisi boyunca subklaviyen kemiğe kesin ve karın boşluğunu açığa çıkarın.
   2. Karaciğeri karnın üst kısmında bulun ve dikkatlice çıkarın. Karaciğeri steril PBS'ye yerleştirin.
   3. Göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için diyaframı kaburgalar boyunca dikkatlice kesin. Ardından, sternumu tutun ve alanı daha da genişletmek için yukarı çekin. Akciğeri bulun ve çıkarın. Çıkarılan akciğeri steril PBS'ye koyun.
   4. Akciğer ve karaciğerde metastaz olup olmadığını büyük ölçüde gözlemleyin. Metastaz sayısını sayın ve dijital bir kayıt alın. Bundan sonra, akciğer ve karaciğer dokularını iki parçaya bölmek için steril bir bıçak kullanın. Bir kısmı fiksasyon için 3 mL% 4 paraformaldehit çözeltisine ve diğer bir kısmı da muhafaza için sıvı azot içine koyun.
   5. Doku dehidrasyonu
      1. Dokuları dehidrasyon kutusuna koyun. Dehidrasyon kutusunu aşağıdaki gibi gradyan alkol dehidrasyonunda sepete koyun: 1 saat boyunca% 70 alkol; 1 saat boyunca% 80 alkol; 30 dakika boyunca% 95 alkol; 30 dakika boyunca% 95 alkol; 30 dakika boyunca susuz etanol I; 30 dakika boyunca susuz etanol II; 20 dakika boyunca ksilen I; 20 dakika boyunca ksilen II; 30 dakika boyunca parafin balmumu I; 1 saat boyunca parafin balmumu II; 30 dakika boyunca parafin balmumu III.
   6. Balmumu emdirilmiş dokuları gömme makinesine gömün.
      1. Erimiş balmumunu önce gömme çerçevesine koyun. Balmumu katılaşmadan önce, dokuyu dehidrasyon kutusundan çıkarın ve gömme çerçevesine koyun, ardından etiketi takın.
      2. Balmumunun dondurma masasında -20 ° C'de soğumasını bekleyin. Balmumu katılaştıktan sonra, balmumu bloğunu gömme çerçevesinden çıkarın ve kırpın.
   7. Kesilmiş balmumu bloğunu, 5 μm kalınlığında ve 2 cm x 2 cm boyutlarında ayarlanmış bir parafin dilimleyici üzerine yerleştirin. Kesitlemeden sonra, dokuyu düzleştirmek için bölümlerin 45 ° C'de ılık suyla bir yayıcı üzerinde yüzmesine izin verin. Dokuyu bir slaytla alın ve dilimleri 65 ° C'de bir fırında 2 saat pişirin.
   8. Su kuruduktan ve balmumu eridikten sonra, slaytı dokuyla birlikte çıkarın ve hematoksilin ve eozin (HE) ve immünohistokimyasal (IHC) boyama¹⁶ için kullanın. Bölümlerin boyama için slaytlara yapıştırıldığından emin olun.

3. Primer tümör ve akciğerin HE boyanması

1. Mum Giderme
   1. Slaytları bölümlerle birlikte 10 dakika boyunca ksilen içine koyun.
   2. Her biri yaklaşık 3 dakika boyunca susuz alkole (% 100) (iki şişe) geçin.
   3. Her biri yaklaşık 3 dakika boyunca% 95 alkole (iki şişe) geçin.
   4. Yaklaşık 3 dakika boyunca% 80 alkole geçin.
   5. Yaklaşık 3 dakika boyunca% 50 alkole geçin.
   6. Musluk suyuna gidin ve alkolü yaklaşık 1 dakika yıkayın.
2. Boy -ama
   1. Slaytları 8 dakika boyunca hematoksilin içine taşıyın.
   2. Hematoksilin'i yıkamak için slaytları 1 dakika suya taşıyın; doku maviden kırmızıya değişir.
   3. Slaytları yaklaşık 30 s boyunca% 1 hidroklorik asit alkolüne taşıyın.
   4. Slaytları suya taşıyın, 5 dakika yıkayın.
   5. Slaytları 90 saniye boyunca eozin'e taşıyın, ardından 5 dakika boyunca suyla yıkayın.
   6. Slaytları her biri 1 dakika boyunca %50 alkol, %80 alkol, %95 alkol (iki şişe) ve susuz alkol (%100) (iki şişe) olarak hareket ettirin.
   7. Slaytları 5 dakika boyunca ksilen içine taşıyın.
   8. Slaytlar kuruduktan sonra, nötr reçine ile kapatın.

Sonuçlar

Tümör büyümesini, fare sağkalım süresini ve patolojik özellikleri araştırmak için mATC'yi indükledik. İndüksiyondan sonra, fareler derhal kurban edildi ve aşağıdaki durumlardan biri bulunduğunda örnekler (tiroid, akciğer ve karaciğer) toplandı: 1) tümör kompresyonunun neden olduğu solunum sıkıntısı; 2) iştah azalması ve anormal seslendirme; 3) alışılmadık uyuşukluk; ve 4) %20'nin üzerinde vücut ağırlığı kaybı. Örnekleme işlemi sırasında, tüm farelerin (12/12) indüksiyonda...

Tartışmalar

Tiroid tümörü diseksiyonu için protokol dahilinde kritik adımlar
Diseksiyon sırasında, tiroid bezinin anatomik yerinin doğru anlaşılması gerekir. Tiroid bezi, submandibuler bezin dorsal tarafında, tiroid kıkırdağı ve trakeaya yakın bir yerde bulunan kelebek şeklinde bir bezdir. İşlem sırasında, boynun her iki tarafındaki kan arterlerinin kesilmesinden dikkatlice kaçınıldı.

mATC ırkının değiştirilmesi ve sorun giderilmesi
A...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0)	MXB	Cat# MVS-0101
50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5)	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9071
Brafflox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Caspase-3	Beyotime	Cat# AC033
CD8	Cell Signaling Technology	Cat# 98941; RRID:AB_2756376
CD206	Cell Signaling Technology	Cat# 24595; RRID:AB_2892682
Chamber for anesthesia induction	RWDlifescience
Enhanced DAB chromogenic kit	MXB	Cat# DAB-2031
Eosin staining solution	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9613
F4/80	Abcam	Cat# 100790; RRID:AB_10675322
Foxp3	Cell Signaling Technology	Cat# 12653; RRID:AB_2797979
Fully enclosed tissue dehydrator	Leica Biosystems	ASP300S
Hematoxylin staining solution	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9610
HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine	Leica Biosystems
Ki67	Beyotime	Cat# AF1738
Rotating Slicer	RWDlifescience	Minux S700
SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems)	ZSGB-GIO	Cat# SP-9001
TPO-cre/ERT2 mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Trp53flox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Ultrasonic cell crusher	Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd	JY92-IIN
Ultrasound gel	Keppler	KL-250
Ultrasound system	VisualSonics	Vevo 3100