Spontanes Mausmodell des anaplastischen Schilddrüsenkarzinoms

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine Standard-Pipeline vor, um murine ATC-Tumore durch spontane gentechnisch veränderte Mausmodelle zu erhalten. Des Weiteren präsentieren wir die Tumordynamik und pathologische Informationen über die primären und metastasierten Läsionen. Dieses Modell wird den Forschern helfen, die Tumorentstehung zu verstehen und die Entdeckung von Medikamenten zu erleichtern.

Zusammenfassung

Das anaplastische Schilddrüsenkarzinom (ATC) ist eine seltene, aber tödliche bösartige Erkrankung mit einer düsteren Prognose. Es besteht ein dringender Bedarf an tiefergehender Forschung zur Karzinogenese und Entwicklung von ATC sowie zu therapeutischen Methoden, da die Standardbehandlungen bei ATC-Patienten im Wesentlichen erschöpft sind. Die geringe Prävalenz hat jedoch gründliche klinische Studien und die Entnahme von Gewebeproben behindert, so dass bei der Entwicklung wirksamer Behandlungen nur geringe Fortschritte erzielt wurden. Mit Hilfe der Gentechnik haben wir ein bedingt induzierbares ATC-Mausmodell (mATC) in einem C57BL/6-Hintergrund erstellt. Das ATC-Mausmodell wurde mittels TPO-cre/ERT2 genotypisiert; Braf^CA/wt; Trp53 ex2-10^/ex2-10 und durch intraperitoneale Injektion mit Tamoxifen induziert. Mit dem Mausmodell untersuchten wir die Tumordynamik (die Tumorgröße reichte von 12,4 mm2 bis 32,5^mm2 nach 4 Monaten Induktion), das Überleben (die mediane Überlebenszeit betrug 130 Tage) und die Metastasierung (Lungenmetastasen traten bei 91,6% der Mäuse auf) und pathologische Merkmale (charakterisiert durch immunhistochemische Färbung von Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 und Caspase-3). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das spontane mATC eine sehr ähnliche Tumordynamik und immunologische Mikroumgebung wie humane ATC-Tumore aufweist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das mATC-Modell mit hoher Ähnlichkeit in pathophysiologischen Merkmalen und einheitlichen Genotypen den Mangel an klinischem ATC-Gewebe und Probenheterogenität bis zu einem gewissen Grad auflöste. Daher würde es den Mechanismus und die translationalen Studien von ATC erleichtern und einen Ansatz zur Untersuchung des Behandlungspotenzials von niedermolekularen Medikamenten und Immuntherapeutika für ATC bieten.

Einleitung

Schilddrüsenkrebs ist eine der häufigsten endokrinen Malignome¹ und hat seinen Ursprung im Schilddrüsenepithel. In den letzten Jahren hat die Inzidenz von Schilddrüsenkrebs weltweit rapide zugenommen². Schilddrüsenkrebs kann je nach Grad der Differenzierung der Tumorzellen in verschiedene Typen unterteilt werden. Auf der Grundlage des klinischen Verhaltens und der Histologie werden Schilddrüsenkarzinome in gut differenzierte Karzinome unterteilt, darunter das papilläre Schilddrüsenkarzinom (PTC) und das follikuläre Schilddrüsenkarzinom (FTC), das schlecht differenzierte Karzinom (PDTC) und das undifferenzierte oder anaplastische Karzinom der Schilddrüse (ATC)³. Im Gegensatz zur PTC, die eine häufige Form mit mildem Verhalten und besserer Prognose ist 4,^ist die ATC eine seltene und hochaggressive bösartige Erkrankung, die 2 % bis 3 % aller Schilddrüsentumoren ausmacht⁵. Obwohl ATC selten ist, ist es für etwa 50 % der Todesfälle im Zusammenhang mit Schilddrüsenkrebs verantwortlich, mit einer düsteren Überlebensrate (6-8 Monate)^6,7. Über 50 % der ATC-Fälle werden als Lungenmetastasen diagnostiziert⁸. Zusätzlich zu der aggressiven Natur der ATC wurde in der Klinik eine begrenzt wirksame Behandlung entwickelt. Daher haben ATC-Patienten eine düstere Prognose 9,10,11. Dies deutet darauf hin, dass weitere eingehende Studien zu den molekularen Mechanismen, die der Entwicklung von ATC und der Behandlung zugrunde liegen, dringend erforderlich sind.

Die Tumorgenese der ATC ist ein dynamischer dedifferenzierter Prozess. Die Schwierigkeit, menschliche Tumorproben in jedem Stadium klinischer Studien zu entnehmen, hat das Verständnis des Entstehungsmechanismus von gut differenzierten zu undifferenzierten Karzinomen erschwert. Im Gegensatz dazu begünstigt die Verwendung von murinen ATC-Modellen (mATC) die Entnahme von mATC-Proben im gesamten Tumorentstehungsverlauf. Daher können wir die Mechanismen der Tumorentstehung besser verstehen, indem wir den dynamischen dedifferenzierten Prozess analysieren. Darüber hinaus hat auch die Heterogenität der klinischen ATC-Proben dazu beigetragen, dass es schwierig ist, den molekularen Mechanismus zu verstehen. Nichtsdestotrotz hatten die Mäuse den gleichen genetischen Hintergrund und wurden in ähnlichen Lebensumgebungen gehalten, um die Konsistenz jedes Tumors zu gewährleisten. Dies erleichtert die Untersuchung der verallgemeinerten Rolle der ATC-Entwicklung^12,13,14. Darüber hinaus ist mATC ein In-situ-Tumormodell, das den Einfluss der anatomischen Lokalisation und der gewebespezifischen Mikroumgebung wiederherstellen kann. Im Vergleich zu häufig verwendeten immundefizienten Mäusen ist mATC ein spontanes Mausmodell mit einem intakten Immunsystem und einer immunen Mikroumgebung.

Daher haben wir mit dem Stamm C57BL/6 eine bedingt induzierte mATC konstruiert, die in der Lage ist, die pathologischen Merkmale eines dedifferenzierten Schilddrüsenkarzinoms zu reproduzieren. Basierend auf diesem Modell gaben wir einen kurzen Überblick über die molekularen Grundlagen, Konstruktionsideen, pathologischen Eigenschaften und Anwendungen von mATC. Darüber hinaus beobachteten und berichteten wir über Tumorwachstum, Überlebenszeit, Metastasierung und pathologische Merkmale von mATC. Wir glauben, dass dies ein informatischer Überblick sein wird, um anderen Forschern zu helfen, dieses Modell einfacher zu verwenden.

Wir konstruierten ein bedingt induzierbares mATC-Modell, wie zuerst von McFadden¹⁵ beschrieben; Zunächst konstruierten wir Mäuse: TPO-cre/ERT2, Braf flox/wt und Trp53^flox/wt. Konkret enthielten TPO-cre/ERT2-Mäuse den humanen Schilddrüsenperoxidase (TPO)-Promotor (ein schilddrüsenspezifischer Promotor), der die Expression eines cre-ERT2-Fusionsgens (eine cre-Rekombinase, die mit einer humanen Östrogenrezeptor-Liganden-Bindungsdomäne fusioniert) antreibt. Cre-ERT2 ist in der Regel auf das Zytoplasma beschränkt und dringt nur dann in den Zellkern ein, wenn es Tamoxifen ausgesetzt wird, das cre dazu veranlasst, rekombinante Enzymaktivität auszuüben. Wenn die Mäuse mit Mäusen gekreuzt werden, die loxP-flankierte Sequenzen tragen, werden nach der Tamoxifen-Induktion durch cre-vermittelte Rekombination die gefloxten Sequenzen in den Schilddrüsenzellen gelöscht, um den Zweck zu erreichen, bestimmte Gene auszuschalten oder einzuschalten.

Darüber hinaus sind Braf ^{flox/wt-Mäuse} ein Knock-in-Allel des menschlichen Braf, das auf dem cre-loxP-System basiert. Das murine^{Braf-Flox/wt-Transkript} wird von endogenen Exons 1-14 und loxP-flankierten humanen Exons 15-18 kodiert. Nach der cre-vermittelten Exzision der gefloxten Regionen werden das mutierte Exon 15 (modifiziert mit einer V600E-Aminosäuresubstitution, die mit konstitutiv aktivem Braf^V600E in humanen Karzinomen verknüpft ist) und die endogenen Exons 16-18 zur Generierung der Transkripte verwendet. Darüber hinaus sind Trp53 ^flox/wt Mäuse Knockout-Allele von humanem Trp53 und haben loxP-Stellen, die die Exons 2-10 von Trp53 flankieren. Bei der Kreuzung mit Mäusen mit einer cre-Rekombinase wird durch die cre-vermittelte Rekombination die gefloxte Sequenz gelöscht, um Trp53 auszuschalten. Anschließend wurden TPO-cre/ERT2-, Braf flox/w- und Trp53^{flox/wt-Mäuse gekreuzt}, um TB zu erhalten (TPO-cre^/ERT2; Braf^flox/wt) Mäuse und TBP (TPO-cre/ERT2; Braf^flox/wt; Trp53^flox/wt) Mäuse, die zur Erzeugung von PTC und ATC verwendet werden könnten. Nach ca. 8 Wochen wurden die Mäuse durch eine intraperitoneale (i.p.) Verabreichung von 150 mg/kg Tamoxifen, gelöst in Maisöl, für zwei Verabreichungen induziert. Das Tumorwachstum konnte mittels Hochfrequenz-Ultraschall überwacht werden (der erste Zeitpunkt der Sonographie wurde als Tag 0 aufgezeichnet). Die erste Sonographie wurde 40 Tage nach der Einführung von Tamoxifen durchgeführt.

Protokoll

Die hier beschriebenen tierexperimentellen Eingriffe wurden mit Genehmigung der Tierethikkommission des West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan, China durchgeführt.

1. Induktion von TBP-Mäusen

1. Identifizierung des Genotyps von Mäusen
   1. Trennen Sie nach etwa 3 Wochen die weiblichen Mäuse von den männlichen Mäusen. Verwenden Sie gleichzeitig die Ohrmarkenklemme, um eine Ohrmarke zu befestigen. Platzieren Sie die Ohrmarken in der unteren Hälfte und im mittleren Drittel des Ohrs und achten Sie darauf, den Bereich mit der höchsten Kapillarkonzentration zu vermeiden.
   2. Halten Sie die Mäuse vorsichtig, aber sicher zurück. Fassen Sie fest an der Basis des Mausschwanzes. Legen Sie die Mäuse auf eine Oberfläche, auf der sie greifen können.
   3. Legen Sie die freie Hand sanft, aber bestimmt auf die Schultern und fassen Sie dann schnell das Genick zwischen Daumen und Zeigefinger. Halte den Schwanz mit dem kleinen Finger fest.
   4. Tupfen Sie den Schwanz mit Alkohol ab. Schneiden Sie die Hautprobe mit einer sterilen Schere <5 mm ab und geben Sie sie in einen sauberen Probenbehälter mit Etikett. Es ist nicht notwendig, das Fell der Mäuse zu entfernen. Komprimieren Sie den Schwanz mit sterilen Schwämmen, um eine Hämostase zu erreichen.
   5. Als nächstes wird der Mausschwanz lysiert und eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt, um den Genotyp zu identifizieren.
      HINWEIS: Nach dem Schneiden eines Mausschwanzes muss die Oberfläche der Schere mit Alkoholbaumwolle abgewischt werden, um eine gegenseitige Kontamination der Gene zwischen den Mäuseschwänzen zu vermeiden. Nachdem sie in ihren Käfig gesetzt wurden, müssen die Mäuse 5 Minuten lang beobachtet werden, um nach Anzeichen von Blutungen an der Wundstelle zu suchen. In Tabelle 1 finden Sie eine Liste der Primer und die in dieser Studie verwendeten PCR-Einstellungen.
2. Tamoxifen-induzierte TBP-Mäuse
   1. Wiegen Sie 0,3 g Tamoxifen ab und lösen Sie es in 15 ml Maisöl durch Ultraschall (Leistung = 20%, Dauer = 20 min, Temperatur = 4 °C) in einer Konzentration von 20 mg/ml. Bei 4 °C lagern.
      Anmerkungen: Tamoxifen ist lichtempfindlich und muss in einen braunen Behälter gegeben werden.
   2. Nach etwa 8 Wochen werden die Mäuse mit einer elektronischen Waage gewogen und ihnen eine intravenöse Injektion von Tamoxifen in einer Dosis von 150 mg/kg verabreicht, die zweimal im Abstand von 1 Woche verabreicht wird.

2. Präparation und Bildgebung von Schilddrüsentumoren und metastasierenden Tumoren der Maus

1. Präparat
   1. Bereiten Sie die Sezierwerkzeuge vor: sterile Schere und Pinzette, sterile Klinge, Sprühflasche mit 75 % Alkohol, 20 cm Lineal, Messschieber, Papiertücher und alkoholische Baumwolle.
   2. Fixierlösung für Mausgewebe: Bereiten Sie eine 4%ige Paraformaldehyd-Gewebefixierlösung vor.
   3. Reinigen Sie eine 10-cm-Schale, die mit etwa 10 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt ist, um das Gewebe vorübergehend aufzubewahren, und waschen Sie das Blut auf der Oberfläche des Gewebes.
2. Schilddrüsenextraktion
   1. Euthanasieren Sie die Mäuse mit Kohlendioxid bei einer Durchflussrate von 2,0 l/min für 5 min. Nehmen Sie die Mäuse aus dem Käfig und führen Sie eine Zervixluxation durch.
   2. Legen Sie die Maus mit der Bauchseite nach oben und dem Kopf vom Experimentator weg auf das Sezierbrett und fixieren Sie die Gliedmaßen mit sterilen Spritzennadeln auf dem Sezierbrett. Für eine bequemere Entfernung von Schilddrüsengewebe verwenden Sie eine andere sterile Spritzennadel, um den Kopf zu fixieren.
   3. Desinfizieren Sie den Hals mit drei abwechselnden Runden eines Chlorhexidin- oder Povidon-Jod-Peelings, gefolgt von 75%igem Alkohol. Machen Sie dann mit einer sterilen Schere und Pinzette einen kleinen Schnitt über der Mitte des Schlüsselbeins.
   4. Setzen Sie den Schnitt in der Mittellinie bis zum Mund fort. Suchen Sie die Unterkieferdrüse und entfernen Sie sie, um die anatomische Lage der Schilddrüse freizulegen, die sich in der Nähe des Schildknorpels und der Luftröhre befindet.
   5. Suchen Sie die Schilddrüse, präparieren Sie die Schilddrüse vorsichtig mit einer sterilen Schere vom Rest der Halsregion und legen Sie dann die entfernte Schilddrüse in eine 10-cm-Schale, die mit 10 ml sterilem PBS gefüllt ist.
      Anmerkungen: Seien Sie bei der Entfernung der Schilddrüse vorsichtig und langsam und vermeiden Sie es, die Blutgefäße des Halses zu durchtrennen. Wenn die Halsgefäße durchtrennt werden, wird der Hals sofort mit Blut gefüllt, und das Blut muss sofort mit Alkoholschwämmen entfernt werden, um die anatomische Lage der Schilddrüse freizulegen. Bevor Sie das Schilddrüsengewebe entfernen, beobachten Sie sorgfältig die Eigenschaften des linken und rechten Schilddrüsenlappens (Größe, Form usw.), um zu vermeiden, dass Sie nach der Entfernung nicht mehr zwischen dem linken und dem rechten Schilddrüsenlappen unterscheiden können.
   6. Bei sterilem PBS wird das Blut mit einer sterilen Schere von der Oberfläche des Schilddrüsengewebes entfernt und die Luftröhre vorsichtig abgeschnitten. Legen Sie dann das Schilddrüsengewebe auf ein steriles Tuch und messen Sie die Größe des linken und rechten Schilddrüsenlappens mit Messschiebern.
   7. Teilen Sie den linken und rechten Schilddrüsenlappen mit einer sterilen Klinge in zwei Teile. Geben Sie einen Teil zur Fixierung in 2 ml 4%ige Paraformaldehydlösung und legen Sie den anderen Teil zur Konservierung in flüssigen Stickstoff.
3. Extraktion von Lunge und Leber
   1. Desinfizieren Sie den Bauch mit drei abwechselnden Runden eines Chlorhexidin- oder Povidon-Jod-Peelings und 75%igem Alkohol. Kneifen Sie dann direkt über den Penis der Maus und machen Sie einen kleinen Schnitt, schneiden Sie entlang der Mittellinie des Bauches bis zum Schlüsselbeinknochen und legen Sie die Bauchhöhle frei.
   2. Suchen Sie die Leber im oberen Teil des Bauches und entfernen Sie sie vorsichtig. Legen Sie die Leber in steriles PBS.
   3. Schneiden Sie das Zwerchfell vorsichtig entlang der Rippen, um die Brusthöhle freizulegen. Fassen Sie als Nächstes das Brustbein und ziehen Sie es nach oben, um den Raum noch weiter zu erweitern. Finde die Lunge und entferne sie. Legen Sie die entfernte Lunge in steriles PBS.
   4. Beobachten Sie grob, ob Metastasen in Lunge und Leber vorhanden sind. Zählen Sie die Anzahl der Metastasen und machen Sie eine digitale Aufzeichnung. Verwenden Sie danach eine sterile Klinge, um das Lungen- und Lebergewebe in zwei Teile zu teilen. Geben Sie einen Teil zur Fixierung in 3 ml 4%ige Paraformaldehydlösung und einen anderen Teil zur Konservierung in flüssigen Stickstoff.
   5. Austrocknung des Gewebes
      1. Legen Sie die Taschentücher in die Dehydrierungsbox. Stellen Sie die Dehydrierungsbox bei der Gradientenalkoholdehydrierung wie folgt in den Korb: 70% Alkohol für 1 h; 80% Alkohol für 1 Stunde; 95% Alkohol für 30 Minuten; 95% Alkohol für 30 Minuten; wasserfreies Ethanol I für 30 min; wasserfreies Ethanol II für 30 min; Xylol I für 20 min; Xylol II für 20 min; Paraffinwachs I für 30 min; Paraffinwachs II für 1 h; Paraffinwachs III für 30 min.
   6. Betten Sie die wachsimprägnierten Tücher in die Einbettmaschine ein.
      1. Geben Sie zuerst das geschmolzene Wachs in den Einbettrahmen. Bevor sich das Wachs verfestigt, nehmen Sie das Tuch aus der Dörrbox und legen Sie es in den Einbettrahmen, dann bringen Sie das Etikett an.
      2. Das Wachs auf dem Gefriertisch bei -20 °C abkühlen lassen. Nachdem sich das Wachs verfestigt hat, entfernen Sie den Wachsblock vom Einbettrahmen und schneiden Sie ihn ab.
   7. Legen Sie den beschnittenen Wachsblock auf einen Paraffinhobel, der auf eine Dicke von 5 μm und eine Größe von 2 cm x 2 cm eingestellt ist. Lassen Sie die Schnitte nach dem Abteilen auf einem Spreizer mit 45 °C warmem Wasser schwimmen, um das Gewebe zu glätten. Das Tuch mit einer Folie aufnehmen und die Scheiben im Ofen bei 65 °C 2 h backen.
   8. Nachdem das Wasser getrocknet und das Wachs geschmolzen ist, entfernen Sie den Objektträger mit dem Gewebe und verwenden Sie ihn für die Hämatoxylin- und Eosin- (HE) und immunhistochemische (IHC)^{Färbung 16}. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte zum Färben auf die Objektträger geklebt werden.

3. HE-Färbung des Primärtumors und der Lunge

1. Entwachsen
   1. Legen Sie die Objektträger mit den Abschnitten für 10 Minuten in Xylol.
   2. In wasserfreien Alkohol (100%) (zwei Flaschen) für jeweils ca. 3 Minuten geben.
   3. In 95%igen Alkohol (zwei Flaschen) für jeweils ca. 3 Minuten wechseln.
   4. Für ca. 3 Minuten in 80%igen Alkohol einsteigen.
   5. Für ca. 3 Min. in 50%igen Alkohol einsteigen.
   6. In das Leitungswasser geben und den Alkohol ca. 1 Minute lang wegspülen.
2. Färbung
   1. Schieben Sie die Objektträger für 8 Minuten in das Hämatoxylin.
   2. Bewegen Sie die Objektträger für 1 Minute ins Wasser, um das Hämatoxylin wegzuspülen. Das Gewebe verfärbt sich von blau nach rot.
   3. Schieben Sie die Objektträger für ca. 30 s in 1%igen Salzsäurealkohol.
   4. Schieben Sie die Objektträger ins Wasser und waschen Sie sie 5 Minuten lang.
   5. Legen Sie die Objektträger 90 s lang in Eosin und waschen Sie sie dann 5 Minuten lang mit Wasser.
   6. Schieben Sie die Objektträger für jeweils 1 Minute in 50 % Alkohol, 80 % Alkohol, 95 % Alkohol (zwei Flaschen) und wasserfreien Alkohol (100 %) (zwei Flaschen).
   7. Schieben Sie die Objektträger für 5 Minuten in Xylol.
   8. Nachdem die Objektträger getrocknet sind, versiegeln Sie sie mit neutralem Harz.

Ergebnisse

Wir induzierten mATC, um das Tumorwachstum, die Überlebenszeit der Maus und pathologische Eigenschaften zu untersuchen. Nach der Induktion wurden die Mäuse sofort getötet und Proben (Schilddrüse, Lunge und Leber) entnommen, sobald eine der folgenden Erkrankungen festgestellt wurde: 1) Atemnot durch Tumorkompression; 2) verminderter Appetit und abnorme Lautäußerungen; 3) ungewöhnliche Lethargie; und 4) Körpergewichtsverlust von über 20%. Während des Probenahmeprozesses stellten wir fest, dass alle Mäuse (12/12)...

Diskussion

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls für die Dissektion von Schilddrüsentumoren
Während der Dissektion muss die anatomische Lage der Schilddrüse richtig verstanden werden. Die Schilddrüse ist eine schmetterlingsförmige Drüse, die sich auf der dorsalen Seite der Unterkieferdrüse in der Nähe des Schildknorpels und der Luftröhre befindet. Während des Eingriffs wurde eine Durchtrennung der Blutarterien auf beiden Seiten des Halses sorgfältig vermieden.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0)	MXB	Cat# MVS-0101
50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5)	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9071
Brafflox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Caspase-3	Beyotime	Cat# AC033
CD8	Cell Signaling Technology	Cat# 98941; RRID:AB_2756376
CD206	Cell Signaling Technology	Cat# 24595; RRID:AB_2892682
Chamber for anesthesia induction	RWDlifescience
Enhanced DAB chromogenic kit	MXB	Cat# DAB-2031
Eosin staining solution	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9613
F4/80	Abcam	Cat# 100790; RRID:AB_10675322
Foxp3	Cell Signaling Technology	Cat# 12653; RRID:AB_2797979
Fully enclosed tissue dehydrator	Leica Biosystems	ASP300S
Hematoxylin staining solution	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9610
HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine	Leica Biosystems
Ki67	Beyotime	Cat# AF1738
Rotating Slicer	RWDlifescience	Minux S700
SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems)	ZSGB-GIO	Cat# SP-9001
TPO-cre/ERT2 mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Trp53flox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Ultrasonic cell crusher	Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd	JY92-IIN
Ultrasound gel	Keppler	KL-250
Ultrasound system	VisualSonics	Vevo 3100