Modelo Murino Espontâneo de Câncer Anaplásico de Tireoide

Resumo

Aqui, apresentamos um pipeline padrão para a obtenção de tumores ATC murinos por modelos espontâneos de camundongos geneticamente modificados. Além disso, apresentamos a dinâmica tumoral e informações patológicas sobre as lesões primárias e metastizadas. Esse modelo ajudará os pesquisadores a entender a tumorigênese e facilitará a descoberta de drogas.

Resumo

O câncer anaplásico de tireoide (ATC) é uma neoplasia maligna rara, mas letal, com prognóstico sombrio. Há uma necessidade urgente de pesquisas mais aprofundadas sobre a carcinogênese e o desenvolvimento de ATC, bem como métodos terapêuticos, uma vez que os tratamentos padrão são essencialmente esgotados em pacientes com ATC. No entanto, a baixa prevalência tem dificultado estudos clínicos aprofundados e a coleta de amostras de tecido, de modo que pouco progresso foi alcançado na criação de tratamentos eficazes. Usamos engenharia genética para criar um modelo murino ATC condicionalmente induzível (mATC) em um fundo C57BL/6. O modelo murino ATC foi genotipado por TPO-cre/ERT2; Braf^CA/wt; Trp53 ex2-10^/ex2-10 e induzido por injeção intraperitoneal com tamoxifeno. Com o modelo murino, investigamos a dinâmica tumoral (o tamanho do tumor variou de 12,4 mm 2 a 32,5 mm² após 4 meses da indução), a sobrevida (o período mediano de sobrevida foi de 130 dias) e as metástases (metástases pulmonares ocorreram em 91,6% dos camundongos) e as características patológicas (caracterizadas pela imuno-histoquímica Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 e Caspase-3). Os resultados indicaram que o mATC espontâneo possui dinâmica tumoral e microambiente imunológico altamente semelhantes aos tumores ATC humanos. Em conclusão, com alta similaridade nas características fisiopatológicas e genótipos unificados, o modelo mATC resolveu a escassez de ATC clínica e heterogeneidade da amostra até certo ponto. Portanto, facilitaria o mecanismo e os estudos translacionais da ATC e forneceria uma abordagem para investigar o potencial de tratamento de pequenas drogas moleculares e agentes de imunoterapia para ATC.

Introdução

O câncer de tireoide é uma das neoplasias endócrinas mais^comuns1, originando-se do epitélio tireoidiano. Nos últimos anos, a incidência do câncer de tireoide tem aumentado rapidamente em todo o^mundo2. O câncer de tireoide pode ser dividido em tipos distintos de acordo com o grau de diferenciação das células tumorais. Com base no comportamento clínico e histológico, os carcinomas de tireoide são divididos em carcinomas bem diferenciados, incluindo carcinoma papilífero de tireoide (CPT) e carcinoma folicular de tireoide (FTC), carcinoma pouco diferenciado (PDTC) e carcinoma indiferenciado ou anaplásico da tireoide (ATC)³. Ao contrário do CPT, que é um tipo comum, com comportamento leve e melhor prognóstico4^{, o} CTA é uma neoplasia maligna rara e altamente agressiva, responsável por 2% a 3% de todos os tumores tireoidianos5. Embora a ATC seja rara, é responsável por aproximadamente 50% das mortes relacionadas ao câncer de tireoide, com sobrevida sombria (6-8 meses)^6,7. Mais de 50% dos casos de CTA são diagnosticados como metástases^pulmonares8. Além da natureza agressiva da ATC, um tratamento eficaz limitado foi desenvolvido na clínica. Portanto, pacientes com CTA têm um prognóstico sombrio9,10,11. Isso sugere que mais estudos aprofundados são urgentemente necessários sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento de ATC e tratamento.

A tumorigênese da ATC é um processo dinâmico desdiferenciado. A dificuldade em coletar amostras de tumores humanos em cada estágio em estudos clínicos tem dificultado a compreensão do mecanismo de desenvolvimento de carcinomas bem diferenciados para indiferenciados. Em contraste, o uso de modelos de ATC murino (mATC) favorece a coleta de amostras de mATC em todo o curso da tumorigênese. Portanto, podemos entender melhor os mecanismos de formação tumoral analisando o processo dinâmico desdiferenciado. Além disso, a heterogeneidade das amostras clínicas de CTA também tem contribuído para a dificuldade de compreensão do mecanismo molecular. No entanto, os camundongos compartilhavam as mesmas origens genéticas e eram mantidos em ambientes de vida semelhantes, garantindo a consistência de cada tumor. Isso facilita a exploração do papel generalizado do desenvolvimento da ATC^12,13,14. Além disso, a mATC é um modelo tumoral in situ que pode restaurar a influência da localização anatômica e do microambiente tecido-específico. Como tal, em comparação com camundongos imunodeficientes comumente usados, o mATC é um modelo murino espontâneo com um sistema imunológico intacto e microambiente imunológico.

Portanto, construímos mATC condicionalmente induzido com a cepa C57BL/6, que é um modelo murino capaz de reproduzir as características patológicas do carcinoma desdiferenciado de tireoide. Com base nesse modelo, apresentamos uma breve visão geral da base molecular, ideias de construção, características patológicas e aplicações do mATC. Além disso, observamos e relatamos crescimento tumoral, tempo de sobrevida, metástase e características patológicas da mATC. Acreditamos que esta será uma visão geral da informática para auxiliar outros pesquisadores a utilizar este modelo com mais facilidade.

Construímos um modelo de mATC induzível condicional, como relatado pela primeira vez por McFadden15; inicialmente, foram construídos camundongos: TPO-cre/ERT2, Braf flox/wt e Trp53^flox/wt. Especificamente, camundongos TPO-cre/ERT2 incluíram o promotor da tireoperoxidase humana (TPO) (um promotor específico da tireoide), conduzindo a expressão de um gene de fusão cre-ERT2 (uma cre recombinase fusionada a um domínio de ligação do ligante do receptor de estrogênio humano). O Cre-ERT2 geralmente está confinado ao citoplasma e entra no núcleo apenas quando exposto ao tamoxifeno, que induz o cre a exercer atividade enzimática recombinante. Quando os camundongos são cruzados com camundongos portadores de sequências flanqueadas por loxP, após a indução com tamoxifeno, a recombinação cre-mediada exclui as sequências floxed nas células tireoidianas para atingir o propósito de nocautear ou nocautear genes específicos.

Além disso, camundongos Braf ^flox/wt são um alelo knock-in de Braf humano baseado no sistema cre-loxP. O transcrito murino de Braf^flox/wt é codificado por exons endógenos 1-14 e exons humanos flanqueados com loxP 15-18. Após a excisão cremediada das regiões floxadas, o éxon mutante 15 (modificado com uma substituição de aminoácidos V600E ligada ao Braf^V600E constitutivamente ativo em cânceres humanos) e os éxons endógenos 16-18 são usados para gerar os transcritos. Além disso, camundongos Trp53 ^flox/wt são alelos nocaute de Trp53 humano e possuem sítios loxP flanqueando os éxons 2-10 de Trp53. Quando cruzada com camundongos com uma recombinase cre, a recombinação mediada por cre exclui a sequência floxada para nocautear Trp53. Em seguida, camundongos TPO-cre/ERT2, Braf flox/w e Trp53^flox/wt foram cruzados para obtenção de TB (TPO-cre^/ERT2; Braf^flox/wt) camundongos e TBP (TPO-cre/ERT2; Braf^flox/mf; Trp53^flox/m/m) camundongos, que poderiam ser usados para gerar PTC e ATC. Após aproximadamente 8 semanas, os camundongos foram induzidos por uma administração intraperitoneal (i.p.) de 150 mg/kg de tamoxifeno dissolvido em óleo de milho por duas administrações. O crescimento tumoral pôde ser monitorado por ultrassonografia de alta frequência (o primeiro momento da ultrassonografia foi registrado como Dia 0). A ultrassonografia inicial foi realizada 40 dias após a introdução do tamoxifeno.

Protocolo

Os procedimentos em animais aqui descritos foram realizados com a aprovação do Comitê de Ética Animal do West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan, China.

1. Indução de camundongos TBP

1. Identificar genótipo de camundongos
   1. Por volta das 3 semanas, separe os camundongos fêmeas dos machos. Ao mesmo tempo, use uma pinça de marca auricular para fixar uma marca auricular. Coloque as marcas auriculares na metade inferior e no terço médio da orelha, certificando-se de evitar a área com maior concentração de capilares.
   2. Segure suavemente, mas com segurança, os ratos. Segure firmemente na base da cauda do rato. Coloque os ratos em uma superfície que lhes permita agarrar.
   3. Coloque suavemente, mas com firmeza, a mão livre sobre os ombros e, em seguida, segure rapidamente o pescoço entre o polegar e o indicador. Segure o rabo com o dedo mínimo.
   4. Esfregue a cauda com álcool. Use uma tesoura estéril para cortar a amostra de pele <5 mm e colocá-la em um recipiente de amostra limpo com um rótulo. Não é necessário remover a pele dos ratos. Comprimir a cauda com esponjas estéreis para hemostasia.
   5. Em seguida, lisar a cauda murina e realizar a reação em cadeia da polimerase (PCR) para identificar o genótipo.
      NOTA: Depois de cortar uma cauda murina, a superfície da tesoura deve ser limpa com algodão alcoólico para evitar a contaminação mútua de genes entre caudas murinas. Depois de colocá-los em sua gaiola, os ratos devem ser observados por 5 minutos para procurar quaisquer sinais de sangramento no local da ferida. Consulte a Tabela 1 para obter a lista de primers e as configurações de PCR usadas neste estudo.
2. Camundongos TBP induzidos por tamoxifeno
   1. Pesar 0,3 g de tamoxifeno e dissolvê-lo em 15 mL de óleo de milho por ultrassom (potência = 20%, duração = 20 min, temperatura = 4 °C), na concentração de 20 mg/mL. Conservar a 4 °C.
      NOTA: O tamoxifeno é sensível à luz e precisa ser colocado em um recipiente marrom.
   2. Em torno de 8 semanas, pesar os ratos com balanças eletrônicas e dar-lhes uma injeção i.p. de tamoxifeno em uma dose de 150 mg/kg, administrada duas vezes com um intervalo de 1 semana.

2. Dissecção e imagem de tumores de tireoide de camundongos e tumores metastáticos

1. Preparação
   1. Prepare as ferramentas de dissecção: tesoura e pinça estéreis, lâmina estéril, frasco de spray de álcool 75%, borda reta de 20 cm, paquímetro vernier, papel toalha e algodão alcoólico.
   2. Solução de fixação de tecido de ratinho: preparar solução de fixação de tecido paraformaldeído a 4%.
   3. Limpe uma placa de 10 cm preenchida com cerca de 10 mL de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) para armazenamento temporário do tecido e lave o sangue na superfície do tecido.
2. Extração de tireoide
   1. Eutanasiar os camundongos com dióxido de carbono a uma vazão de 2,0 L/min por 5 min. Remova os ratos da gaiola e realize o deslocamento cervical.
   2. Coloque o mouse sobre a placa de dissecação com o lado ventral voltado para cima e a cabeça afastada do experimentador e fixe os membros na placa de dissecação com agulhas de seringa estéreis. Para uma remoção mais conveniente do tecido tireoidiano, use outra agulha de seringa estéril para fixar a cabeça.
   3. Desinfetar o pescoço com três rodadas alternadas de uma esfoliação com clorexidina ou iodopovidona, seguidas de álcool a 75%. Em seguida, faça uma pequena incisão acima do centro da clavícula com tesoura e pinça estéreis.
   4. Continue a linha média da incisão até a boca. Encontre a glândula submandibular e remova-a para expor a localização anatômica da tireoide, que é colocada perto da cartilagem tireoide e traqueia.
   5. Encontre a tireoide, disseque cuidadosamente a tireoide do resto da região do pescoço com tesoura estéril e, em seguida, coloque a tireoide removida em uma placa de 10 cm preenchida com 10 mL de PBS estéril.
      NOTA: Durante a remoção da glândula tireoide, seja suave e lento e evite cortar os vasos sanguíneos do pescoço. Se os vasos do pescoço forem cortados, o pescoço será imediatamente preenchido com sangue, e o sangue deve ser prontamente removido com esponjas de álcool para expor a localização anatômica da tireoide. Antes de remover o tecido tireoidiano, observe cuidadosamente as características dos lobos esquerdo e direito da tireoide (tamanho, forma, etc.) para evitar ser incapaz de distinguir entre os lobos esquerdo e direito da tireoide após a remoção.
   6. Em PBS estéril, remova o sangue da superfície do tecido tireoidiano com tesoura estéril e corte cuidadosamente a traqueia. Em seguida, coloque o tecido tireoidiano em um pano estéril e meça o tamanho dos lobos esquerdo e direito da glândula tireoide com paquímetro de Vernier.
   7. Divida os lobos esquerdo e direito da glândula tireoide em duas partes com uma lâmina estéril. Colocar uma parte em 2 mL de solução de paraformaldeído a 4% para fixação e colocar a outra parte em nitrogênio líquido para preservação.
3. Extração de pulmão e fígado
   1. Desinfetar o abdome com três rodadas alternadas de uma esfoliação de clorexidina ou iodopovidona e álcool a 75%. Em seguida, aperte logo acima do pênis do rato e faça uma pequena incisão, corte ao longo da linha média do abdômen até o osso subclávio e exponha a cavidade abdominal.
   2. Encontre o fígado na parte superior do abdômen e remova-o cuidadosamente. Coloque o fígado em PBS estéril.
   3. Corte cuidadosamente o diafragma ao longo das costelas para expor a cavidade torácica. Em seguida, segure o esterno e puxe para cima para ampliar ainda mais o espaço. Encontre o pulmão e remova-o. Coloque o pulmão removido em PBS estéril.
   4. Observar grosseiramente se há metástases no pulmão e no fígado. Conte o número de metástases e faça um registro digital. Depois disso, use uma lâmina estéril para dividir os tecidos pulmonar e hepático em duas partes. Colocar uma parte em 3 mL de solução de paraformaldeído a 4% para fixação e outra parte em nitrogênio líquido para preservação.
   5. Desidratação tecidual
      1. Coloque os tecidos na caixa de desidratação. Coloque a caixa de desidratação no cesto na desidratação com álcool degradê da seguinte forma: álcool 70% por 1 h; álcool a 80% por 1 h; álcool 95% por 30 min; álcool 95% por 30 min; etanol anidro I por 30 min; etanol anidro II por 30 min; xileno I por 20 min; xileno II por 20 min; cera de parafina I por 30 min; cera de parafina II por 1 h; cera de parafina III por 30 min.
   6. Incorpore os tecidos impregnados com cera na máquina de incorporação.
      1. Coloque a cera derretida na estrutura de incorporação primeiro. Antes que a cera se solidifique, remova o tecido da caixa de desidratação e coloque-o na estrutura de incorporação e, em seguida, prenda a etiqueta.
      2. Deixe a cera arrefecer a -20 °C na mesa de congelação. Depois que a cera se solidificar, remova o bloco de cera da estrutura de incorporação e corte-o.
   7. Coloque o bloco de cera aparado sobre um cortador de parafina, fixado a uma espessura de 5 μm e um tamanho de 2 cm x 2 cm. Após a secção, deixe as secções flutuarem num espalhador com água morna a 45 °C para achatar o tecido. Pegue o lenço de papel com uma lâmina e leve ao forno a 65 °C por 2 h.
   8. Após a água secar e a cera derreter, retirar a lâmina com o tecido e utilizá-la para coloração de hematoxilina e eosina (HE) e imunohistoquímica (IHQ)¹⁶. Certifique-se de que as seções estão aderidas às lâminas para coloração.

3. Coloração HE do tumor primário e pulmão

1. Desparafinação
   1. Coloque as lâminas com as seções em xileno por 10 min.
   2. Passe para álcool anidro (100%) (duas garrafas) por cerca de 3 min cada.
   3. Passe para o álcool a 95% (duas garrafas) por cerca de 3 min cada.
   4. Passe para o álcool a 80% durante cerca de 3 minutos.
   5. Passe para o álcool a 50% por cerca de 3 min.
   6. Passe para a água da torneira e lave o álcool por cerca de 1 min.
2. Mancha
   1. Mover as lâminas para a hematoxilina por 8 min.
   2. Mova as lâminas para a água por 1 min para lavar a hematoxilina; O tecido muda de azul para vermelho.
   3. Mova as lâminas em álcool de ácido clorídrico a 1% por cerca de 30 s.
   4. Mova as lâminas para a água, lavando por 5 min.
   5. Mova as lâminas para eosina por 90 s e, em seguida, lave-as com água por 5 min.
   6. Mova as lâminas em álcool 50%, álcool 80%, álcool 95% (duas garrafas) e álcool anidro (100%) (duas garrafas), por 1 min cada.
   7. Mova as lâminas para xileno por 5 min.
   8. Depois que as lâminas estiverem secas, sela-as com resina neutra.

Resultados

Induzimos o mATC para investigar o crescimento tumoral, o tempo de sobrevivência em camundongos e as características patológicas. Após a indução, os camundongos foram imediatamente sacrificados e amostras (tireoide, pulmão e fígado) foram coletadas uma vez que uma das seguintes condições foi encontrada: 1) desconforto respiratório causado pela compressão tumoral; 2) diminuição do apetite e vocalização anormal; 3) letargia incomum; e 4) perda de peso corporal superior a 20%. Durante o processo de amostrage...

Discussão

Etapas críticas dentro do protocolo de dissecção de tumor de tireoide
Durante a dissecção, a localização anatômica da glândula tireoide precisa ser corretamente compreendida. A glândula tireoide é uma glândula em forma de borboleta localizada no lado dorsal da glândula submandibular perto da cartilagem tireoide e da traqueia. Durante o procedimento, o corte das artérias sanguíneas de ambos os lados do pescoço foi cuidadosamente evitado.

Modificação...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0)	MXB	Cat# MVS-0101
50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5)	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9071
Brafflox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Caspase-3	Beyotime	Cat# AC033
CD8	Cell Signaling Technology	Cat# 98941; RRID:AB_2756376
CD206	Cell Signaling Technology	Cat# 24595; RRID:AB_2892682
Chamber for anesthesia induction	RWDlifescience
Enhanced DAB chromogenic kit	MXB	Cat# DAB-2031
Eosin staining solution	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9613
F4/80	Abcam	Cat# 100790; RRID:AB_10675322
Foxp3	Cell Signaling Technology	Cat# 12653; RRID:AB_2797979
Fully enclosed tissue dehydrator	Leica Biosystems	ASP300S
Hematoxylin staining solution	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9610
HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine	Leica Biosystems
Ki67	Beyotime	Cat# AF1738
Rotating Slicer	RWDlifescience	Minux S700
SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems)	ZSGB-GIO	Cat# SP-9001
TPO-cre/ERT2 mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Trp53flox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Ultrasonic cell crusher	Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd	JY92-IIN
Ultrasound gel	Keppler	KL-250
Ultrasound system	VisualSonics	Vevo 3100