Спонтанная мышиная модель анапластического рака щитовидной железы

Резюме

Здесь мы представляем стандартный конвейер для получения опухолей ATC у мышей с помощью спонтанных генетически модифицированных моделей мышей. Далее мы представляем опухолевую динамику и патологическую информацию о первичных и метастазирующих поражениях. Эта модель поможет исследователям понять онкогенез и облегчит открытие лекарств.

Аннотация

Анапластический рак щитовидной железы (АТХ) является редким, но смертельным злокачественным новообразованием с мрачным прогнозом. Существует острая необходимость в более глубоких исследованиях канцерогенеза и развития АТХ, а также терапевтических методов, поскольку стандартные методы лечения у пациентов с АТХ практически исчерпаны. Однако низкая распространенность препятствовала тщательным клиническим исследованиям и сбору образцов тканей, поэтому в создании эффективных методов лечения был достигнут незначительный прогресс. Мы использовали генную инженерию для создания условно-индуцируемой мышиной модели ATC (mATC) на фоне C57BL/6. Мышиная модель ATC была генотипирована с помощью TPO-cre/ERT2; Браф^CA/вес; Trp53 ex2-10^/ex2-10 и индуцируется внутрибрюшинным введением тамоксифена. С помощью мышиной модели мы исследовали динамику опухоли (размер опухоли варьировал от 12,4 мм 2 до 32,5 мм² после 4 месяцев индукции), выживаемость (средний период выживания составил 130 дней) и метастазирование (метастазы в легкие произошли у 91,6% мышей) кривые и патологические особенности (характеризуются иммуногистохимическим окрашиванием Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 и Caspase-3). Результаты показали, что спонтанная mATC обладает очень похожей на опухолевую динамику и иммунологическое микроокружение с опухолями ATC человека. В заключение, при высоком сходстве патофизиологических признаков и унифицированных генотипов, модель mATC в некоторой степени устранила нехватку клинической ткани ATC и гетерогенность образца. Таким образом, это облегчило бы механизм и трансляционные исследования АТХ и обеспечило бы подход к изучению лечебного потенциала низкомолекулярных препаратов и иммунотерапевтических агентов для АТХ.

Введение

Рак щитовидной железы является одним из наиболее распространенных эндокринных злокачественных новообразований¹, происходящих из эпителия щитовидной железы. В последние годы заболеваемость раком щитовидной железы быстро возросла во всем мире². Рак щитовидной железы можно разделить на отдельные типы в зависимости от степени дифференцировки опухолевых клеток. На основании клинического поведения и гистологии карциномы щитовидной железы делятся на хорошо дифференцированные карциномы, включая папиллярную карциному щитовидной железы (ПТК) и фолликулярную карциному щитовидной железы (ФТК), низкодифференцированную карциному (ПДТК) и недифференцированную или анапластическую карциному щитовидной железы (АТХ)³. В отличие от ПТК, который является распространенным типом с легким поведением и лучшим прогнозом⁴, АТХ является редким и очень агрессивным злокачественным новообразованием, на долю которого приходится от 2% до 3% всех опухолей щитовидной железы⁵. Хотя АТХ встречается редко, он является причиной примерно 50% смертей, связанных с раком щитовидной железы, с удручающей выживаемостью (6-8 месяцев)^6,7. Более 50% случаев АТХ диагностируются как метастазы в легкие⁸. Помимо агрессивного характера АТХ, в клинике разработано ограниченное эффективное лечение. Таким образом, пациенты с АТХ имеют мрачный прогноз 9,10,11. Это говорит о том, что срочно необходимы дальнейшие углубленные исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе разработки АТХ и лечения.

Онкогенез АТХ является динамическим дедифференцированным процессом. Сложность сбора образцов опухолей человека на каждом этапе клинических исследований препятствовала пониманию механизма развития от хорошо дифференцированных до недифференцированных карцином. Напротив, использование мышиных моделей АТХ (mATC) благоприятствует сбору образцов mATC во всем курсе онкогенеза. Таким образом, мы можем лучше понять механизмы образования опухоли, проанализировав динамический дедифференцированный процесс. Кроме того, гетерогенность клинических образцов АТХ также способствовала трудностям в понимании молекулярного механизма. Тем не менее, мыши имели одинаковый генетический фон и содержались в одинаковой среде обитания, обеспечивая консистенцию каждой опухоли. Это облегчает изучение обобщенной роли развития УВД^12,13,14. Кроме того, mATC представляет собой модель опухоли in situ, которая может восстанавливать влияние анатомического расположения и тканеспецифического микроокружения. Таким образом, по сравнению с широко используемыми иммунодефицитными мышами, mATC представляет собой спонтанную мышиную модель с интактной иммунной системой и иммунным микроокружением.

Поэтому мы построили условно-индуцированный mATC со штаммом C57BL/6, который представляет собой мышиную модель, способную воспроизводить патологические особенности дедифференцированной карциномы щитовидной железы. Основываясь на этой модели, мы дали краткий обзор молекулярной основы, идей построения, патологических особенностей и приложений mATC. Кроме того, мы наблюдали и сообщали о росте опухоли, времени выживания, метастазировании и патологических особенностях mATC. Мы считаем, что это будет информационный обзор, который поможет другим исследователям легче использовать эту модель.

Мы построили условную индуцируемую модель mATC, о которой впервые сообщил McFadden¹⁵; Первоначально мы сконструировали мышей: TPO-cre/ERT2, Braf flox/wt и Trp53^flox/wt. В частности, мыши TPO-cre / ERT2 включали промотор пероксидазы щитовидной железы человека (TPO) (специфический для щитовидной железы промотор), стимулирующий экспрессию гена слияния cre-ERT2 (рекомбиназа cre, слитая с лиганд-связывающим доменом рецептора эстрогена человека). Cre-ERT2 обычно ограничивается цитоплазмой и попадает в ядро только при воздействии тамоксифена, который побуждает cre проявлять активность рекомбинантного фермента. Когда мышей скрещивают с мышами, несущими loxP-фланкированные последовательности, после индукции тамоксифена кре-опосредованная рекомбинация удаляет флоксированные последовательности в клетках щитовидной железы для достижения цели нокаута или выбивания определенных генов.

Кроме того, мыши Braf ^{flox / wt} являются аллелем человеческого Braf, основанного на системе cre-loxP. Мышиный транскрипт Braf^flox/wt кодируется эндогенными экзонами 1-14 и локсP-фланговыми человеческими экзонами 15-18. После кре-опосредованного иссечения флоксированных областей мутантный экзон 15 (модифицированный аминокислотной заменой V600E, связанной с конститутивно активным Braf^V600E при раке человека) и эндогенные экзоны 16-18 используются для генерации транскриптов. Кроме того, мыши Trp53 ^{flox / wt} являются нокаутными аллелями человеческого Trp53 и имеют сайты loxP, фланкирующие экзоны 2-10 Trp53. При скрещивании с мышами с кре-рекомбиназой кре-опосредованная рекомбинация удаляет флоксированную последовательность, чтобы нокаутировать Trp53. Затем мышей TPO-cre/ERT2, Braf flox/w и Trp53^flox/wt скрещивали для получения туберкулеза (TPO-cre^/ERT2; Braf^flox/wt) мыши и TBP (TPO-cre/ERT2; ^{Браф-флокс/вес}; Trp53^flox/вес) мышей, которые можно было бы использовать для генерации PTC и ATC. Примерно через 8 недель мышей индуцировали внутрибрюшинным (в/) введением 150 мг/кг тамоксифена, растворенного в кукурузном масле, в течение двух введений. Рост опухоли можно было контролировать с помощью высокочастотного ультразвукового исследования (первый момент времени УЗИ был зарегистрирован как день 0). Первичное УЗИ проводилось через 40 дней после введения тамоксифена.

протокол

Описанные здесь процедуры на животных были выполнены с одобрения Комитета по этике животных Западно-Китайской больницы, Сычуаньского университета, Чэнду, Сычуань, Китай.

1. Индукция мышей TBP

1. Определите генотип мышей
   1. Примерно через 3 недели отделите самок мышей от мышей-самцов. В то же время используйте зажим для ушной бирки, чтобы зафиксировать ушную бирку. Поместите ушные бирки в нижнюю половину и в среднюю треть уха, избегая области с наибольшей концентрацией капилляров.
   2. Аккуратно, но надежно удерживайте мышей. Крепко возьмитесь за основание мышиного хвоста. Поместите мышей на поверхность, которая позволит им захватывать.
   3. Аккуратно, но твердо положите свободную руку на плечи, затем быстро возьмитесь за загривок между большим и указательным пальцами. Зажмите мизинцем хвост.
   4. Смажьте хвост спиртом. Стерильными ножницами отрежьте образец кожи <5 мм и поместите его в чистый контейнер для образцов с этикеткой. Удалять шерсть мышей не нужно. Сожмите хвост стерильными губками для достижения гемостаза.
   5. Затем лизируют мышиный хвост и проводят полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для определения генотипа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После отрезания одного мышиного хвоста поверхность ножниц необходимо протереть спиртовой ватой, чтобы избежать взаимного заражения генов между мышиными хвостами. После помещения их в клетку за мышами необходимо наблюдать в течение 5 минут, чтобы найти какие-либо признаки кровотечения в месте раны. Обратитесь к таблице 1 для списка праймеров и настроек ПЦР, используемых в этом исследовании.
2. Тамоксифен-индуцированные мыши TBP
   1. Взвесьте 0,3 г тамоксифена и растворите его в 15 мл кукурузного масла с помощью ультразвука (мощность = 20%, продолжительность = 20 мин, температура = 4 °C) в концентрации 20 мг / мл. Хранить при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тамоксифен чувствителен к свету и должен быть помещен в коричневый контейнер.
   2. Примерно через 8 недель взвесьте мышей с помощью электронных весов и сделайте им внутривенную инъекцию тамоксифена в дозе 150 мг / кг, вводимую дважды с интервалом в 1 неделю.

2. Вскрытие и визуализация опухолей щитовидной железы и метастатических опухолей мыши

1. Подготовка
   1. Подготовьте инструменты для вскрытия: стерильные ножницы и щипцы, стерильное лезвие, бутылку с распылителем 75% спирта, линейку 20 см, штангенциркуль, бумажные полотенца и спиртовую вату.
   2. Раствор для фиксации тканей мыши: приготовьте 4% раствор для фиксации тканей параформальдегида.
   3. Очистите 10-сантиметровую посуду, наполненную примерно 10 мл стерильного фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) для временного хранения тканей, и промойте кровь на поверхности ткани.
2. Экстракция щитовидной железы
   1. Усыпляют мышей углекислым газом со скоростью потока 2,0 л/мин в течение 5 мин. Извлеките мышей из клетки и выполните вывих шейки матки.
   2. Поместите мышь на рассекающую доску брюшной стороной вверх и головой подальше от экспериментатора и зафиксируйте конечности на рассекающей доске стерильными иглами шприца. Для более удобного удаления ткани щитовидной железы используйте другую стерильную иглу шприца для фиксации головки.
   3. Продезинфицируйте шею тремя чередующимися раундами хлоргексидина или повидон-йодного скраба с последующим добавлением 75% спирта. Затем сделайте небольшой надрез над центром ключицы стерильными ножницами и щипцами.
   4. Продолжайте разрез по средней линии вверх ко рту. Найдите подчелюстную железу и удалите ее, чтобы обнажить анатомическое расположение щитовидной железы, которая находится рядом с щитовидным хрящом и трахеей.
   5. Найдите щитовидную железу, аккуратно рассеките щитовидную железу от остальной части области шеи стерильными ножницами, затем поместите удаленную щитовидную железу в 10-сантиметровую посуду, наполненную 10 мл стерильного PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время удаления щитовидной железы будьте осторожны и медленны и избегайте перерезания кровеносных сосудов шеи. Если сосуды шеи перерезаны, шея сразу же наполнится кровью, и кровь необходимо своевременно удалить спиртовыми губками, чтобы обнажить анатомическое расположение щитовидной железы. Перед удалением ткани щитовидной железы внимательно понаблюдайте за характеристиками левой и правой долей щитовидной железы (размер, форма и т. д.), чтобы избежать невозможности различить левую и правую доли щитовидной железы после удаления.
   6. При стерильной ПБС стерильными ножницами удаляют кровь с поверхности ткани щитовидной железы и аккуратно срезают трахею. Затем положите ткань щитовидной железы на стерильную ткань и измерьте размер левой и правой долей щитовидной железы штангенциркулем.
   7. Разделите левую и правую доли щитовидной железы на две части стерильным лезвием. Поместите одну часть в 2 мл 4% раствора параформальдегида для фиксации, а другую часть поместите в жидкий азот для консервации.
3. Экстракция легких и печени
   1. Продезинфицируйте живот тремя чередующимися раундами хлоргексидина или повидон-йодного скраба и 75% спирта. Затем ущипните чуть выше полового члена мыши и сделайте небольшой разрез, разрежьте по средней линии живота до подключичной кости и обнаживите брюшную полость.
   2. Найдите печень в верхней части живота и аккуратно удалите ее. Поместите печень в стерильный PBS.
   3. Аккуратно разрежьте диафрагму вдоль ребер, чтобы обнажить грудную полость. Затем возьмитесь за грудину и потяните вверх, чтобы еще больше расширить пространство. Найдите легкое и удалите его. Поместите удаленное легкое в стерильный PBS.
   4. Грубо наблюдать, нет ли метастазов в легких и печени. Подсчитайте количество метастазов и сделайте цифровую запись. После этого с помощью стерильного лезвия разделите ткани легких и печени на две части. Поместите одну часть в 3 мл 4% раствора параформальдегида для фиксации, а другую часть в жидкий азот для консервации.
   5. Обезвоживание тканей
      1. Положите салфетки в коробку для обезвоживания. Положите ящик для обезвоживания в корзину при градиентном обезвоживании спиртом следующим образом: 70% спирта в течение 1 часа; 80% спирт в течение 1 ч; 95% спирт в течение 30 мин; 95% спирт в течение 30 мин; безводный этанол I в течение 30 мин; безводный этанол II в течение 30 мин; ксилол I в течение 20 мин; ксилол II в течение 20 мин; парафин I в течение 30 мин; парафин II в течение 1 ч; парафин III в течение 30 мин.
   6. Вставьте пропитанные воском ткани в встраивающую машину.
      1. Сначала положите расплавленный воск во встраиваемую раму. Прежде чем воск затвердеет, извлеките ткань из коробки для обезвоживания и поместите ее во встраиваемую раму, затем прикрепите этикетку.
      2. Дайте воску остыть при -20 °C на морозильном столе. После того, как воск застынет, извлеките восковой блок из встраиваемой рамы и обрежьте его.
   7. Поместите обрезанный восковой блок на парафиновый слайсер, установленный толщиной 5 мкм и размером 2 см х 2 см. После секционирования дайте срезам всплыть на разбрасывателе с теплой водой при температуре 45 ° C, чтобы сгладить ткань. Поднимите ткань горкой и запекайте ломтики в духовке при температуре 65 °C в течение 2 часов.
   8. После того, как вода высохнет и воск растает, удалите предметное стекло с тканью и используйте его для окрашивания гематоксилином и эозином (HE) и иммуногистохимического (IHC) окрашивания¹⁶. Убедитесь, что срезы приклеены к предметным стеклам для окрашивания.

3. ОФ окрашивание первичной опухоли и легкого

1. Депарафинизация
   1. Горки со срезами поместить в ксилол на 10 мин.
   2. Перейдите в безводный спирт (100%) (две бутылки) примерно на 3 минуты каждая.
   3. Перейдите в 95% спирт (две бутылки) примерно на 3 минуты каждая.
   4. Перейдите в 80% спирт примерно на 3 минуты.
   5. Перейдите в 50% спирт примерно на 3 минуты.
   6. Перейдите в водопроводную воду и смойте спирт в течение примерно 1 минуты.
2. Окрашивание
   1. Переместите предметные стекла в гематоксилин на 8 мин.
   2. Переместите предметные стекла в воду на 1 мин, чтобы смыть гематоксилин; Ткань меняется с синего на красный.
   3. Переместите предметные стекла в 1% спирт соляной кислоты примерно на 30 с.
   4. Переместите горки в воду, промыв в течение 5 мин.
   5. Переместите предметные стекла в эозин на 90 с, затем промойте их водой в течение 5 минут.
   6. Переместите слайды в 50% спирт, 80% спирт, 95% спирт (две бутылки) и безводный спирт (100%) (две бутылки) на 1 минуту каждая.
   7. Переместите горки в ксилол на 5 минут.
   8. После того, как предметные стекла высохнут, запечатайте их нейтральной смолой.

Результаты

Мы индуцировали mATC для исследования роста опухоли, времени выживания мышей и патологических характеристик. После индукции мышей немедленно приносили в жертву, а образцы (щитовидная железа, легкие и печень) собирали после обнаружения одного из следующих состояний: 1) респираторный дист?...

Обсуждение

Критические шаги в протоколе вскрытия опухоли щитовидной железы
Во время рассечения нужно правильно понимать анатомическое расположение щитовидной железы. Щитовидная железа представляет собой железу в форме бабочки, расположенную на дорсальной стороне подчелюстной желе?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0)	MXB	Cat# MVS-0101
50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5)	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9071
Brafflox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Caspase-3	Beyotime	Cat# AC033
CD8	Cell Signaling Technology	Cat# 98941; RRID:AB_2756376
CD206	Cell Signaling Technology	Cat# 24595; RRID:AB_2892682
Chamber for anesthesia induction	RWDlifescience
Enhanced DAB chromogenic kit	MXB	Cat# DAB-2031
Eosin staining solution	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9613
F4/80	Abcam	Cat# 100790; RRID:AB_10675322
Foxp3	Cell Signaling Technology	Cat# 12653; RRID:AB_2797979
Fully enclosed tissue dehydrator	Leica Biosystems	ASP300S
Hematoxylin staining solution	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9610
HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine	Leica Biosystems
Ki67	Beyotime	Cat# AF1738
Rotating Slicer	RWDlifescience	Minux S700
SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems)	ZSGB-GIO	Cat# SP-9001
TPO-cre/ERT2 mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Trp53flox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Ultrasonic cell crusher	Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd	JY92-IIN
Ultrasound gel	Keppler	KL-250
Ultrasound system	VisualSonics	Vevo 3100