Modèle murin spontané de cancer anaplasique de la thyroïde

Résumé

Ici, nous présentons un pipeline standard pour obtenir des tumeurs ATC murines par des modèles murins spontanés génétiquement modifiés. En outre, nous présentons la dynamique tumorale et des informations pathologiques sur les lésions primaires et métastasées. Ce modèle aidera les chercheurs à comprendre la tumorigenèse et facilitera la découverte de médicaments.

Résumé

Le cancer anaplasique de la thyroïde (CTA) est une tumeur maligne rare mais mortelle dont le pronostic est sombre. Il est urgent de mener des recherches plus approfondies sur la cancérogenèse et le développement de l’ATC, ainsi que sur les méthodes thérapeutiques, car les traitements standard sont essentiellement épuisés chez les patients atteints d’ATC. Cependant, la faible prévalence a entravé les études cliniques approfondies et la collecte d’échantillons de tissus, de sorte que peu de progrès ont été réalisés dans la création de traitements efficaces. Nous avons utilisé le génie génétique pour créer un modèle murin ATC inductible conditionnellement (mATC) dans un arrière-plan C57BL/6. Le modèle murin ATC a été génotypé par TPO-cre/ERT2; Braf^CA/poids; Trp53 ex2-10^/ex2-10 et induit par injection intrapéritonéale de tamoxifène. Avec le modèle murin, nous avons étudié la dynamique tumorale (la taille de la tumeur variait de 12,4 mm 2 à 32,5 mm² après 4 mois d’induction), la survie (la période de survie médiane était de 130 jours) et les métastases (métastases pulmonaires survenues chez 91,6% des souris) courbes et caractéristiques pathologiques (caractérisées par une coloration immunohistochimique Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 et Caspase-3). Les résultats ont indiqué que le mATC spontané possède une dynamique tumorale et un microenvironnement immunologique très similaires aux tumeurs ATC humaines. En conclusion, avec une grande similitude dans les caractéristiques physiopathologiques et les génotypes unifiés, le modèle mATC a résolu la pénurie de tissu ATC clinique et l’hétérogénéité des échantillons dans une certaine mesure. Par conséquent, il faciliterait le mécanisme et les études translationnelles de l’ATC et fournirait une approche pour étudier le potentiel de traitement des médicaments à petits molécules et des agents d’immunothérapie pour l’ATC.

Introduction

Le cancer de la thyroïde est l’une des tumeurs malignes endocriniennes les plus courantes¹, provenant de l’épithélium thyroïdien. Ces dernières années, l’incidence du cancer de la thyroïde a augmenté rapidement dans le monde^{entier 2}. Le cancer de la thyroïde peut être divisé en types distincts en fonction du degré de différenciation des cellules tumorales. Sur la base du comportement clinique et de l’histologie, les carcinomes thyroïdiens sont divisés en carcinomes bien différenciés, y compris le carcinome papillaire de la thyroïde (PTC) et le carcinome folliculaire de la thyroïde (FTC), le carcinome peu différencié (PDTC) et le carcinome indifférencié ou anaplasique de la thyroïde (ATC)³. Contrairement au PTC, qui est un type commun avec un comportement doux et un meilleur pronostic⁴, l’ATC est une tumeur maligne rare et très agressive qui représente 2% à 3% de toutes les tumeurs thyroïdiennes⁵. Bien que l’ATC soit rare, il est responsable d’environ 50 % des décès liés au cancer de la thyroïde, avec une survie lamentable (6 à 8 mois)^6,7. Plus de 50 % des cas d’ATC sont diagnostiqués comme des métastases pulmonaires⁸. En plus de la nature agressive de l’ATC, un traitement efficace limité a été développé en clinique. Par conséquent, les patients ATC ont un pronostic sombre 9,10,11. Cela suggère que d’autres études approfondies sont nécessaires de toute urgence sur les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement de l’ATC et du traitement.

La tumorigenèse de l’ATC est un processus dynamique dédifférencié. La difficulté de prélever des échantillons de tumeurs humaines à chaque étape des études cliniques a entravé la compréhension du mécanisme de développement des carcinomes bien différenciés aux carcinomes indifférenciés. En revanche, l’utilisation de modèles ATC murins (mATC) favorise la collecte d’échantillons de mATC dans l’ensemble du cours de tumorigenèse. Par conséquent, nous pouvons mieux comprendre les mécanismes de formation tumorale en analysant le processus dynamique dédifférencié. En outre, l’hétérogénéité des échantillons cliniques ATC a également contribué à la difficulté de comprendre le mécanisme moléculaire. Néanmoins, les souris partageaient les mêmes antécédents génétiques et étaient maintenues dans des environnements de vie similaires, assurant la cohérence de chaque tumeur. Cela facilite l’exploration du rôle généralisé du développement ATC^12,13,14. De plus, le mATC est un modèle tumoral in situ qui peut restaurer l’influence de l’emplacement anatomique et du microenvironnement tissulaire spécifique. En tant que tel, comparé aux souris immunodéficientes couramment utilisées, le mATC est un modèle murin spontané avec un système immunitaire intact et un microenvironnement immunitaire.

Par conséquent, nous avons construit le mATC induit conditionnellement avec la souche C57BL/6, qui est un modèle murin capable de reproduire les caractéristiques pathologiques du carcinome thyroïdien dédifférencié. Sur la base de ce modèle, nous avons donné un bref aperçu de la base moléculaire, des idées de construction, des caractéristiques pathologiques et des applications du mATC. En outre, nous avons observé et rapporté la croissance tumorale, le temps de survie, les métastases et les caractéristiques pathologiques du mATC. Nous croyons qu’il s’agira d’un aperçu informatique pour aider d’autres chercheurs à utiliser ce modèle plus facilement.

Nous avons construit un modèle mATC inductible conditionnel, tel que rapporté pour la première fois par McFadden¹⁵ ; initialement, nous avons construit des souris : TPO-cre/ERT2, Braf flox/wt et Trp53^flox/wt. Plus précisément, les souris TPO-cre / ERT2 incluaient le promoteur de la peroxydase thyroïdienne humaine (TPO) (un promoteur spécifique de la thyroïde), entraînant l’expression d’un gène de fusion cre-ERT2 (une cre recombinase fusionnée à un domaine de ligand du récepteur des œstrogènes humains). Cre-ERT2 est généralement confiné au cytoplasme et ne pénètre dans le noyau que lorsqu’il est exposé au tamoxifène, ce qui induit le cre à exercer une activité enzymatique recombinante. Lorsque les souris sont croisées avec des souris portant des séquences flanquées de loxP, après induction de tamoxifène, la recombinaison médiée par la cré supprime les séquences floxées dans les cellules thyroïdiennes pour atteindre le but d’assommer ou de frapper dans des gènes spécifiques.

De plus, les souris Braf ^{flox / poids} sont un allèle knock-in de Braf humain basé sur le système cre-loxP. Le transcrit murin Braf^flox/wt est codé par les exons endogènes 1-14 et les exons humains flanqués de loxP 15-18. Après excision médiée par la cre des régions floxées, l’exon 15 mutant (modifié par une substitution d’acides aminés V600E liée à Braf^V600E constitutifment actif dans les cancers humains) et les exons endogènes 16-18 sont utilisés pour générer les transcrits. De plus, les souris Trp53 ^flox/poids sont des allèles knockout de Trp53 humain et ont des sites loxP flanquant les exons 2-10 de Trp53. Lorsqu’elle est croisée avec des souris avec une cre recombinase, la recombinaison médiée par cre supprime la séquence floxed pour éliminer Trp53. Ensuite, des souris TPO-cre/ERT2, Braf flox/w et Trp53^flox/poids ont été croisées pour obtenir la tuberculose (TPO-cre^/ERT2; Braf^flox/poids) souris et TBP (TPO-cre/ERT2; Braf^flox/poids; Trp53^flox/poids) souris, qui pourraient être utilisées pour générer PTC et ATC. Après environ 8 semaines, les souris ont été induites par une administration intrapéritonéale (i.p.) de 150 mg / kg de tamoxifène dissous dans de l’huile de maïs pendant deux administrations. La croissance tumorale a pu être surveillée par échographie à haute fréquence (le premier point temporel de l’échographie a été enregistré au jour 0). L’échographie initiale a été réalisée 40 jours après l’introduction du tamoxifène.

Protocole

Les procédures animales décrites ici ont été effectuées avec l’approbation du Comité d’éthique animale de l’hôpital de Chine occidentale, Université du Sichuan, Chengdu, Sichuan, Chine.

1. Induction de souris TBP

1. Identifier le génotype des souris
   1. Vers 3 semaines, séparer les souris femelles des souris mâles. Dans le même temps, utilisez une pince d’étiquette d’oreille pour fixer une étiquette d’oreille. Placez les étiquettes d’oreille dans la moitié inférieure et sur le tiers moyen de l’oreille, en vous assurant d’éviter la zone avec la plus forte concentration de capillaires.
   2. Retenez doucement mais solidement les souris. Saisissez fermement à la base de la queue de la souris. Placez les souris sur une surface qui leur permettra de saisir.
   3. Placez doucement mais fermement la main libre sur les épaules, puis saisissez rapidement la peau du cou entre le pouce et l’index. Tenez la queue avec le petit doigt.
   4. Tamponnez la queue avec de l’alcool. Utilisez des ciseaux stériles pour couper l’échantillon de peau de <5 mm et le mettre dans un récipient d’échantillon propre avec une étiquette. Il n’est pas nécessaire d’enlever la fourrure des souris. Comprimez la queue avec des éponges stériles pour atteindre l’hémostase.
   5. Ensuite, lyser la queue murine et effectuer une réaction en chaîne de la polymérase (PCR) pour identifier le génotype.
      REMARQUE: Après avoir coupé une queue murine, la surface des ciseaux doit être essuyée avec du coton alcoolisé pour éviter la contamination mutuelle des gènes entre les queues murines. Après les avoir placées dans leur cage, les souris doivent être surveillées pendant 5 minutes pour rechercher tout signe de saignement sur le site de la plaie. Reportez-vous au tableau 1 pour la liste des amorces et les paramètres de PCR utilisés dans cette étude.
2. Souris TBP induites par le tamoxifène
   1. Peser 0,3 g de tamoxifène et le dissoudre dans 15 mL d’huile de maïs par ultrasons (puissance = 20 %, durée = 20 min, température = 4 °C), à une concentration de 20 mg/mL. Conserver à 4 °C.
      REMARQUE: Le tamoxifène est sensible à la lumière et doit être placé dans un récipient brun.
   2. Vers 8 semaines, pesez les souris avec des balances électroniques et donnez-leur une injection intraveineuse de tamoxifène à une dose de 150 mg / kg, administrée deux fois avec un intervalle de 1 semaine.

2. Dissection et imagerie des tumeurs thyroïdiennes de souris et des tumeurs métastatiques

1. Préparation
   1. Préparez les outils de dissection: ciseaux et pinces stériles, lame stérile, vaporisateur d’alcool à 75%, bord droit de 20 cm, étriers verniers, essuie-tout et coton alcoolisé.
   2. Solution de fixation de tissu de souris: préparer la solution de fixation de tissu paraformaldéhyde à 4%.
   3. Nettoyez un plat de 10 cm rempli d’environ 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) pour un entreposage temporaire des tissus, et lavez le sang à la surface du tissu.
2. Extraction thyroïdienne
   1. Euthanasier les souris avec du dioxyde de carbone à un débit de 2,0 L/min pendant 5 min. Retirez les souris de la cage et effectuez une luxation cervicale.
   2. Placez la souris sur la planche de dissection avec le côté ventral vers le haut et la tête éloignée de l’expérimentateur, et fixez les membres sur la planche de dissection avec des aiguilles de seringue stériles. Pour un retrait plus pratique du tissu thyroïdien, utilisez une autre aiguille de seringue stérile pour fixer la tête.
   3. Désinfectez le cou avec trois cycles alternés d’un gommage à la chlorhexidine ou à la povidone iodée suivi d’un gommage à 75 % d’alcool. Ensuite, faites une petite incision au-dessus du centre de la clavicule avec des ciseaux et des pinces stériles.
   4. Continuez l’incision à mi-chemin jusqu’à la bouche. Trouvez la glande sous-maxillaire et retirez-la pour exposer l’emplacement anatomique de la thyroïde, qui est placée près du cartilage thyroïdien et de la trachée.
   5. Trouvez la thyroïde, disséquez soigneusement la thyroïde du reste de la région du cou avec des ciseaux stériles, puis mettez la thyroïde retirée dans un plat de 10 cm rempli de 10 ml de PBS stérile.
      REMARQUE: Lors de l’ablation de la glande thyroïde, soyez doux et lent et évitez de couper les vaisseaux sanguins du cou. Si les vaisseaux du cou sont coupés, le cou sera immédiatement rempli de sang et le sang doit être rapidement retiré avec des éponges à alcool pour exposer l’emplacement anatomique de la thyroïde. Avant de retirer le tissu thyroïdien, observez attentivement les caractéristiques des lobes gauche et droit de la thyroïde (taille, forme, etc.) pour éviter de ne pas pouvoir distinguer les lobes gauche et droit de la thyroïde après le retrait.
   6. Dans le PBS stérile, retirez le sang de la surface du tissu thyroïdien avec des ciseaux stériles et coupez soigneusement la trachée. Ensuite, mettez le tissu thyroïdien sur un chiffon stérile et mesurez la taille des lobes gauche et droit de la glande thyroïde avec des étriers verniers.
   7. Divisez les lobes gauche et droit de la glande thyroïde en deux parties avec une lame stérile. Mettre une partie dans 2 mL de solution de paraformaldéhyde à 4% pour la fixation, et mettre l’autre partie dans de l’azote liquide pour la conservation.
3. Extraction des poumons et du foie
   1. Désinfectez l’abdomen avec trois cycles alternés d’un gommage à la chlorhexidine ou à la povidone iodée et d’alcool à 75%. Ensuite, pincez juste au-dessus du pénis de la souris et faites une petite incision, coupez le long de la ligne médiane de l’abdomen jusqu’à l’os sous-clavier et exposez la cavité abdominale.
   2. Trouvez le foie dans la partie supérieure de l’abdomen et retirez-le soigneusement. Placez le foie dans du PBS stérile.
   3. Coupez soigneusement le diaphragme le long des côtes pour exposer la cavité thoracique. Ensuite, saisissez le sternum et tirez vers le haut pour élargir encore plus l’espace. Trouvez le poumon et retirez-le. Mettez le poumon enlevé dans PBS stérile.
   4. Observez grossièrement s’il y a des métastases dans le poumon et le foie. Comptez le nombre de métastases et prenez un enregistrement numérique. Après cela, utilisez une lame stérile pour diviser les tissus pulmonaires et hépatiques en deux parties. Mettre une partie dans 3 mL de solution de paraformaldéhyde à 4% pour la fixation et une autre partie dans de l’azote liquide pour la conservation.
   5. Déshydratation tissulaire
      1. Mettez les mouchoirs dans la boîte de déshydratation. Mettez la boîte de déshydratation dans le panier à gradient de déshydratation alcoolique comme suit: 70% d’alcool pendant 1 h; 80% d’alcool pendant 1 h; 95% d’alcool pendant 30 min; 95% d’alcool pendant 30 min; éthanol anhydre I pendant 30 min; éthanol anhydre II pendant 30 min; xylène I pendant 20 min; xylène II pendant 20 min; cire de paraffine I pendant 30 min; cire de paraffine II pendant 1 h; cire de paraffine III pendant 30 min.
   6. Incorporez les tissus imprégnés de cire dans la machine d’encastrement.
      1. Mettez d’abord la cire fondue dans le cadre d’encastrement. Avant que la cire ne se solidifie, retirez le tissu de la boîte de déshydratation et placez-le dans le cadre d’encastrement, puis fixez l’étiquette.
      2. Laisser refroidir la cire à -20 °C sur la table de congélation. Une fois la cire solidifiée, retirez le bloc de cire du cadre d’encastrement et coupez-le.
   7. Placer le bloc de cire taillé sur une trancheuse à paraffine, réglée sur une épaisseur de 5 μm et une taille de 2 cm x 2 cm. Après la section, laisser flotter les sections sur un épandeur avec de l’eau tiède à 45 °C pour aplatir le tissu. Ramasser le mouchoir avec une lame et cuire les tranches dans une étuve à 65 °C pendant 2 h.
   8. Une fois l’eau sèche et la cire fondue, retirez la lame avec le tissu et utilisez-la pour la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (HE) et immunohistochimique (IHC)¹⁶. Assurez-vous que les sections sont collées aux lames pour la coloration.

3. Coloration HE de la tumeur primaire et du poumon

1. Déparaffinage
   1. Mettez les lames avec les sections dans du xylène pendant 10 min.
   2. Passer à l’alcool anhydre (100%) (deux bouteilles) pendant environ 3 minutes chacune.
   3. Passer à 95% d’alcool (deux bouteilles) pendant environ 3 minutes chacune.
   4. Passer à 80% d’alcool pendant environ 3 min.
   5. Passer à 50% d’alcool pendant environ 3 min.
   6. Déplacez-vous dans l’eau du robinet et lavez l’alcool pendant environ 1 min.
2. Coloration
   1. Déplacer les lames dans l’hématoxyline pendant 8 min.
   2. Déplacez les lames dans l’eau pendant 1 min pour éliminer l’hématoxyline; Le tissu passe du bleu au rouge.
   3. Déplacer les lames dans de l’alcool d’acide chlorhydrique à 1% pendant environ 30 s.
   4. Déplacez les toboggans dans l’eau en les lavant pendant 5 min.
   5. Déplacez les lames dans l’éosine pendant 90 s, puis lavez-les à l’eau pendant 5 min.
   6. Déplacez les lames dans 50% d’alcool, 80% d’alcool, 95% d’alcool (deux bouteilles) et d’alcool anhydre (100%) (deux bouteilles), pendant 1 min chacune.
   7. Déplacer les lames dans le xylène pendant 5 min.
   8. Une fois les lames sèches, scellez-les avec de la résine neutre.

Résultats

Nous avons induit mATC pour étudier la croissance tumorale, le temps de survie de la souris et les caractéristiques pathologiques. Après l’induction, les souris ont été immédiatement sacrifiées et des échantillons (thyroïde, poumon et foie) ont été prélevés une fois que l’une des conditions suivantes a été trouvée: 1) détresse respiratoire causée par la compression tumorale; 2) diminution de l’appétit et vocalisation anormale; 3) léthargie inhabituelle; et 4) perte de poids corporel de plus de 2...

Discussion

Étapes critiques du protocole de dissection tumorale thyroïdienne
Pendant la dissection, l’emplacement anatomique de la glande thyroïde doit être correctement compris. La glande thyroïde est une glande en forme de papillon située sur la face dorsale de la glande sous-maxillaire près du cartilage thyroïdien et de la trachée. Pendant la procédure, la sectionnement des artères sanguines des deux côtés du cou a été soigneusement évité.

Modification et...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0)	MXB	Cat# MVS-0101
50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5)	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9071
Brafflox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Caspase-3	Beyotime	Cat# AC033
CD8	Cell Signaling Technology	Cat# 98941; RRID:AB_2756376
CD206	Cell Signaling Technology	Cat# 24595; RRID:AB_2892682
Chamber for anesthesia induction	RWDlifescience
Enhanced DAB chromogenic kit	MXB	Cat# DAB-2031
Eosin staining solution	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9613
F4/80	Abcam	Cat# 100790; RRID:AB_10675322
Foxp3	Cell Signaling Technology	Cat# 12653; RRID:AB_2797979
Fully enclosed tissue dehydrator	Leica Biosystems	ASP300S
Hematoxylin staining solution	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9610
HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine	Leica Biosystems
Ki67	Beyotime	Cat# AF1738
Rotating Slicer	RWDlifescience	Minux S700
SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems)	ZSGB-GIO	Cat# SP-9001
TPO-cre/ERT2 mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Trp53flox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Ultrasonic cell crusher	Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd	JY92-IIN
Ultrasound gel	Keppler	KL-250
Ultrasound system	VisualSonics	Vevo 3100