Hacimsel Kas Kaybı (VML) Yaralanmasının Cerrahi Olarak Oluşturulmasını Takiben Sıçan Masseter Kasının İn vivo Fonksiyonel Değerlendirmesi

Özet

Hacimsel kas kaybı (VML) yaralanmaları endojen rejeneratif yeteneği aşarak kalıcı fonksiyonel eksikliklere neden olur. Mevcut VML araştırması öncelikle uzuv ve gövde kaslarına odaklanmaktadır. VML'nin mekanik çalışmalarını kraniyofasiyal kaslara genişletmek için, bu makale, VML hasarı öncesi ve sonrası masseter kas fonksiyonunun uzunlamasına değerlendirilmesi için in vivo bir yöntemi açıklamaktadır.

Özet

Hacimsel Kas Kaybı (VML) sivil ve askeri popülasyonlarda yaygındır ve vücudun doğal rejeneratif kapasitesini aşan zayıflatıcı bir iskelet kası yaralanmasını temsil eder. Bu yaralanmalar sadece kas liflerini değil, aynı zamanda sinirleri, kan damarlarını ve hücre dışı matrisi de bozar, iskelet kasının rejeneratif kapasitesini ezer ve kas yapısı ve fonksiyonunda ciddi fibrozis ve kalıcı eksikliklere yol açar. Mevcut klinik yönetimin birçok sınırlılığı vardır ve bu nedenle daha etkili terapötik yaklaşımlar geliştirmek için araştırmalar devam etmektedir. Bununla birlikte, özellikle, VML yaralanmalarına yapılan klinik öncesi vurgunun çoğu, kraniyofasiyal kaslar hakkında sınırlı araştırma ile uzuv ve gövde kaslarına odaklanmıştır. Kraniyofasiyal ve ekstremite/gövde kasları arasındaki gelişimsel biyoloji ve rejeneratif kapasitedeki farklılıklar, yaralanmaya özgü VML tedavi seçeneklerini daha fazla yönlendiren önemli bilgiler sağlayabilir. Ayrıca, fonksiyonel iyileşmenin değerlendirilmesi, terapötik etkinliğin belirlenmesi için kritik öneme sahiptir. Bu bağlamda, perkütan sinir stimülasyonu ile kas kasılmasının in vivo testi, aynı hayvanda bir çalışma boyunca tekrarlanan fonksiyonel değerlendirmeye izin veren minimal invaziv bir yöntemdir. Bu hususlar ışığında, bu yazıda VML yaralanmasından önce ve sonra sıçan masseter kasındaki kas fonksiyonunun in vivo değerlendirmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, sıçanlarda biyolojik olarak ilgili bir kraniyofasiyal VML hasarının oluşturulmasını ve fonksiyonel değerlendirmesini detaylandıran ilk yayınlanmış örnektir.

Giriş

Altta yatan iskelet kasını içeren yumuşak dokunun travmatik ve cerrahi yaralanmaları, hem siviller hem de yaralı savaşçılar için doku rekonstrüksiyonunun önündeki en büyük zorluklardan biri olmaya devam etmektedir¹. Aslında, savaş alanı yaralanmalarının yaklaşık% 20'si yaralı savaşçıların kraniyofasiyal bölgelerinde (baş ve yüz) de meydana ^gelir2. Ayrıca, ekstremite travması ve baş ve boyun yaralanmaları, son çatışmalardaki çatışma yaralanmalarının %>80'ini oluşturmaktadır². İskelet kasının yaralanmayı takiben onarma, yenilenme ve yeniden şekillenme konusunda oldukça iyi bilinen kapasitesine rağmen, kas dokusunun önemli bir bölümünün kaybını içeren bu daha ciddi yaralanmalar kendi başlarına iyileşme yeteneğine sahip değildir ve Hacimsel Kas Kaybı (VML) yaralanmaları olarak adlandırılır. Tanım olarak, VML, yaralanan kasın veya kas ünitesinin³ kalıcı estetik ve fonksiyonel eksikliklerine neden olur.

İlginç bir şekilde, kraniyofasiyal VML yaralanmasının ^2,4 prevalansına rağmen, bugüne kadar yapılan araştırmaların çoğu uzuv ^5,6,7,8 ve gövde ^9,10,11 kaslarına odaklanmıştır ve kraniyofasiyal kaslardaki VML yaralanmaları hakkında sadece bir avuç rapor ^{bulunmaktadır} 12,13,14 . Mevcut literatür, hem gelişimsel biyolojide hem de kraniyofasiyal ile ekstremite ve gövde kasları arasında rejeneratif kapasitede önemli farklılıklar olduğunu öne sürdüğünden, bu potansiyel olarak önemli bir translasyonel araştırma boşluğu sunmaktadır^15,16. Aslında, yüzün her iki tarafında 20'den fazla kas vardır - bu, kraniyofasiyal bölgenin göz kırpma, yutma ve çiğneme gibi birçok temel görevi yerine getirmede rol oynadığı gerçeğini yansıtır¹⁵. Ayrıca, kraniyofasiyal kaslar arasında bile, rejeneratif yetenek açısından farklılıklar ortaya çıkar. Örneğin, göz dışı kaslar, uzuv kaslarından daha hızlı yenileniyor gibi görünmektedir¹⁷. Buna karşılık, masseter tibialis anteriorundan (TA) daha yavaş bir rejeneratif yanıt ^gösterir18. Bu farklılıklar, en azından kısmen, kasların kökenlerinin dallıyomerik mi yoksa somit kaynaklı mı olduğuna bağlı olabilir - bu da hem farklı miktarlarda uydu hücresi hem de yerleşik uydu hücresi popülasyonlarının farklı gen ekspresyon profilleri ile sonuçlanır¹⁹. Kraniyofasiyal kaslar arasındaki benzersiz özelliklerin yanı sıra ekstremite ve gövde kaslarına göre göz önünde bulundurulması, kasa özgü VML yaralanmalarını ele alan özelleştirilmiş tedavi seçeneklerinin daha iyi terapötik gelişimi için önemli mekanik bilgiler sağlayabilir. Kaslara özgü bu farklılıklar, baş ve boyun rekonstrüktif ameliyatları için donör kas dokusu transfer seçenekleri olarak latissimus dorsi gibi tabaka benzeri kasların bilinen sınırlamalarını da açıklayabilir 20,21,22.

VML yaralanmasının yeri ne olursa olsun, şu anda tam form ve işlevi geri kazandırabilecek herhangi bir tedavi yoktur. Altın standart klinik yönetim, rehabilitasyonun yanı sıra otolog doku transferini de içerir; Bununla birlikte, birincisi tipik olarak gücü iyileştirmez ve donör bölge morbiditesi ^3,23 ile sonuçlanabilirken, ikincisi kaslarda fonksiyonel iyileşme veya kasılma kuvvetinin geri dönüşü üzerinde minimum etki ile hareket açıklığını iyileştirir ^1,6. Tüm bu nedenlerden dolayı, VML yaralanmasını takiben fonksiyonel kas dokusunun rejenerasyonu için daha etkili terapötik yaklaşımlar geliştirmek için araştırmalar devam etmektedir. Yakın zamanda yapılan bir analiz, VML hasarının sıçan modellerinde yapılan klinik öncesi çalışmaların, VML onarımı¹ için rejeneratif teknoloji çözümlerini geliştirmek için kritik önemini vurguladı.

Önceki çalışma 5,8,9,10,24,25'te belirtildiği gibi, VML sonrası fonksiyonel iyileşmenin değerlendirilmesi, terapötik müdahalelerin etkinliğini değerlendirmek için kritik öneme sahiptir. Spesifik olarak, yara iyileşmesi ve hacim iyileşmesi VML onarımının temel özellikleri olsa da, yaralanma ve tedavi sonrası kuvvet iyileşmesinin ölçülmesi, VML eksikliklerinden sorumlu çok ölçekli biyomekanik mekanizmaların yanı sıra fonksiyonel iyileşmeyi sağlayan mekanizmalara ışık tutmaya yardımcı olur. Bu nedenle, doku onarımı, hacim geri kazanımı ve gelişmiş kas gücü arasında bir bağlantı kurmak, VML onarımı⁹ için en etkili rejeneratif çözümleri belirlemek için mutlak bir gerekliliktir.

Bu bağlamda, bu fonksiyonel ölçümleri yapmak için üç ana yöntem vardır: (1) in vitro, (2) in situ ve (3) in vivo test - her biri kendi avantaj ve dezavantajlarını sunar⁸. Örneğin, in vitro test, canlı organizma dışında izole edilmiş kas fonksiyonunun incelenmesini içerir ve kas uyarılabilirliğini ve kasılmasını etkileyen çeşitli ilaçlar ve kimyasallarla kas stimülasyonunu daha doğrudan/spesifik olarak manipüle etme fırsatı sağlar²⁶. Bu yöntem, kas fonksiyonunun ve iyileşmesinin²⁷ hücresel ve moleküler yönleri hakkında ayrıntılı araştırmalara izin vermesine rağmen, gerçek kas fonksiyonunu ne kadar iyi özetlediğini^{sınırlayan kan} akışını ve innervasyonu ortadan kaldırır ^8,26. Yerinde test, kas hala doğal anatomik konumundayken ancak çevre dokulardan izole edilmişken kas fonksiyonunu değerlendirir^25,28. Bu yöntem innervasyon ve kan akışını korurken, kasın ayrılması bulguların in vivo ortama uygulanabilirliğini hala sınırlayabilir. Ek olarak ve belki de en önemlisi, hem yerinde hem de in vitro testler, aynı hayvanda zaman içinde fonksiyonel iyileşmenin izlenmesine izin vermek için gerekli olan uzunlamasına testleri engelleyen terminal prosedürlerdir. Buna karşılık, kas fonksiyonunun doğal ortamında değerlendirilmesini içeren in vivo test, fizyolojik bir bağlamda kas performansının daha eksiksiz bir şekilde anlaşılmasını sağlar²⁹. İn vivo çalışmalar aynı zamanda en az invaziv tekniktir ve bir çalışmanın süresi boyunca tekrar tekrar gerçekleştirilebilir²⁹. Perkütan elektriksel sinir stimülasyonu kullanılarak, tendonları, damar sistemini ve innervasyonu sağlam bırakırken belirli kaslarda fonksiyonel ölçümler toplanabilir³⁰. Bu boylamsal değerlendirmeler, aynı hayvanda iyileşmenin farklı aşamalarında meydana gelen ince ama önemli değişiklikler hakkında fikir verebilir. Bu yöntem genellikle küçük kemirgen modellerinde^kullanılır 8,31,32,33; Bununla birlikte, Pig³⁰ ve Dog^34'ün daha büyük hayvan modellerinde de kullanılmıştır.

Kraniyofasiyal VML yaralanmalarını takiben fonksiyonel iyileşmenin değerlendirilmesi ile ilgili yayınlanmış üç çalışma bulunmaktadır. Rodriguez ve ark. küçükbaş zygomaticus majör kasında bir kraniyofasiyal VML yaralanma modelini onarmak için bir yöntem hakkında rapor vermektedir. Yöntemleri, yalnızca son çalışma zaman noktasında uygulanabilen ve bu nedenle tek bir hayvanda boylamsal değerlendirmeye izin vermeyen bir yerinde test protokolünü detaylandırır¹³. Kim ve ark. bir VML yaralanmasını takiben fare çiğnemesinin sürekli elektromiyogram verilerini izlemek için nanomembran elektroniğinin kullanımı için bir yöntem tanımlamaktadır. Yaralı farelerden kontrole kıyasla önemli ölçüde daha düşük sinyal bildirdiler, ancak hareket artefaktlarının sinyal analizini etkilediğini ve farelerin zaman zaman devreyi çizmeye çalışacaklarını da belirttiler. Ek olarak, nanomembranın cilde güvenli bir şekilde bağlanmasına izin vermek için atimik, çıplak fareler kullanıldı, bu da şu anda bu yöntemin daha yaygın olarak kullanılan (ve uygun maliyetli) hayvan modellerinde daha geniş kullanımını engellemektedir¹². Son olarak, Zhao ve ark. fonksiyonel bir sonuç olarak, hayvanlarda beslenmeyi bozan, önemli ölçüde azalmış vücut ağırlığı artışına yansıyan fare masseterinde kritik boyutta bir VML kusurunu tanımlamaktadır¹⁴. Bu çalışmalar göz önünde bulundurularak, bu makale, trigeminal sinirin deri altı elektrotlarla uyarılması yoluyla bir VML yaralanmasından önce ve sonra sıçan çenesindeki kasılma fonksiyonunun in vivo longitudinal değerlendirmesi için çok yönlü ve minimal invaziv bir yöntemi açıklamaktadır. Test, bir dizi artan simülasyon frekansından (20-200 Hz) geçerken, bir dönüştürücü kasın üretilen kuvvetini ölçer. Bu ölçümler, diğerlerinin yanı sıra kas sertliğinin ve maksimal tetanozun belirlenmesine izin verebilir. Aşağıdaki protokol, travmatik bir VML yaralanmasını takiben ipsilateral ısırma kuvvetinin fonksiyonel iyileşmesini değerlendirmek için tasarlanmıştır ve bu nedenle, doğrulanmış bir VML yaralanmasının cerrahi olarak oluşturulması için bir protokol de içerir. Bu yöntem, çok çeşitli sıçanlar ve fareler üzerinde kolayca uygulanabilir ve uygun ekipman modifikasyonları ile daha büyük hayvan modellerine ve VML yaralanmalarına da uygulanabilir³⁰.

Protokol

Tüm hayvan işleme ve prosedürleri, Virginia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) Yönergelerine uygun olarak onaylanmış ve yapılmıştır. Bu deneylerde kullanılan sıçanlar, ameliyat sırasında 324.8 g ± 12.72 g ağırlığında 12-14 haftalık erkek Lewis sıçanlarıydı. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Masseter kasının VML yaralanması

1. Ekipman hazırlığı
   1. Ameliyattan önce, gerekli tüm aletlerin uygun şekilde sterilize edildiğinden emin olun: cerrahi örtüler, neşter, forseps, mikromakas, kanama durdurucular, dikişler ve gazlı bez.
   2. Isıtılmış bir platforma güç verin ve 37 °C'ye ayarlayın.
   3. Anestezi altında göz kuruluğunu önlemek için her iki göze de steril oftalmik merhem sürün. Hayvanı anestezi indüksiyon odasına koyun ve% 2 -% 3 izofluran verin (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
2. VML Yaralanmasının cerrahi olarak oluşturulması
   1. Hayvanı hazneden çıkarmadan önce uygun şekilde uyuşturulduğundan emin olun.
      NOT: Bu, hayvanın ayak parmağının sıkışmasına tepki vermemesi durumunda belirlenebilir.
   2. Hayvanı tartın ve sol tarafındaki yanal pozisyonda, burnu güvenli bir şekilde burun konisine gelecek şekilde bir ameliyat tahtasına yerleştirin ve izofluranın sürekli uygulanmasına izin verin.
   3. Uygun analjezik vererek, yüzün sağ tarafını tıraş ederek ve üç kez iyot ve alkollü sürüntü değişikliği ile alanı sterilize ederek hayvanı ameliyata hazırlayın. Bu çalışmalar için, analjezi için uzun süreli salınan buprenorfin kullanıldı (0.65 mg / kg vücut ağırlığı).
   4. Sıçanın bukkal bölgesi boyunca yaklaşık 2 cm'lik bir kesi yaparak ameliyata başlayın. Kesi, hayvanın burnu ve kulağı ile aynı hizada olmalıdır. Cildi ve fasyayı ayırmak için künt diseksiyon kullanın.
   5. Fasya boyunca benzer bir kesi yapın ve alttaki masseterden nazikçe inceleyin.
   6. Bukkal ve marjinal sinirleri bulun (Şekil 1A). Çıkarılacak alanı işaretlemek için steril bir cerrahi işaretleyici ve cetvel kullanın. Alan, fasiyal sinirler arasında uzanan açıkta kalan masseterin merkezinde 10 mm x 5 mm'lik bir dikdörtgen olmalıdır (Şekil 1B).
   7. Doku çıkarmaya başlamak için dikkatlice mikromakas kullanın. Son yaralanmanın 150 mg eksize edilmiş doku ile yaklaşık 4 mm derinliğe ulaştığından emin olun (Şekil 1C). Çıkarılan doku yüzeyel masseterin tam kalınlığından olacak ve kısmen derin masseterin içine gidecektir.
      NOT: Bu deneylerde çıkarılan ortalama doku kütlesi 146.1 mg ±1.16 mg idi.
   8. Sırasıyla emilebilir (6-0) ve emilmeyen (5-0) kesikli dikişler kullanarak fasyayı ve cildi kapatın.
3. Temizleme ve izleme
   1. Dikişten sonra, anestezi gazını kapatın ve bilincine geri dönüşünü izlemek için hayvanı ısıtılmış yüzeyde tutun. Sıçan bilincini geri kazanmaya başladığında, hayvanı kafese geri koyun ve uyanık ve yürüyene kadar izlemeye devam edin.
   2. Ameliyattan sonraki 3 gün boyunca hayvanı kontrol edin ve herhangi bir ağrı veya rahatsızlık belirtisi olup olmadığını değerlendirin.
   3. Ameliyattan sonraki 7 gün boyunca, çenedeki gerginliği azaltmak ve hayvanları iyi nemlendirmek/beslemek için hayvana yumuşak yiyecekler sağlayın.
   4. Kesilen dikişleri ameliyattan 7-10 gün sonra çıkarın ve çıkarılmadan önce yaranın tamamen kapandığından emin olun.
   5. Çalışmanın son zaman noktasını takiben, hayvanları IACUC yönergelerine göre ötenazi yapın. Masseter kaslarını eksplant edin ve sıvı nitrojen veya sıvı nitrojenle soğutulmuş izopentan içine daldırılarak flaş donar.
      NOT: Dondurulmuş doku örnekleri, gelecekteki histolojik değerlendirme için -80 °C'de uzun süreli saklanabilir.

2. Çenenin in vivo fonksiyonel değerlendirmesi

1. Ekipman hazırlığı
   1. Tüm ekipmanın doğru şekilde bağlandığını kontrol edin ve emin olun.
   2. Sırasıyla, (1) bilgisayarı, (2) iki fazlı stimülatörü, (3) çift modlu kol sistemini ve son olarak (4) 37 °C'ye ısıtmak için ısıtılmış bir platformu açın.
      NOT: Kullanım kılavuzu, stimülatör ve kol sisteminin doğru okumalar üretmesi için 1 dakikalık bir ısınma süresi belirtir. Ek olarak, herhangi bir hayvanı test etmeden önce platformun tamamen ısınması için 10-15 dakika bekleyin.
   3. Anestezi altında göz kuruluğunu önlemek için her iki göze de steril oftalmik merhem sürün. Test edilecek hayvanı anestezi indüksiyon odasına yerleştirin ve% 2 -% 3 izofluran sağlayın.
   4. Politetrafloroetilen kaplı elektrot uçlarını %70 etanol içine yerleştirerek sterilize edin.
   5. Dinamik Kas Kontrolü (DMC) Yazılımını bulun ve açın. Bu, işlevsel değerlendirmeyi gerçekleştirmek için gerekli olacaktır.
2. Yazılım kurulumu
   1. DMC Yazılımında, kurulum menüsünde Instant Stim'i bulun ve parametreleri istediğiniz değerlere değiştirin. Bu çalışmada, ön ayarlarından hiçbir parametre değiştirilmemiştir (Şekil 2A).
   2. Kurulum menüsü altında, verileri depolamak için bir otomatik kaydetme klasörü oluşturun ve seçin.
   3. Yazılım ekranının alt kısmına yakın bir yerde, Otomatik Kaydetme Tabanı başlıklı bir kutu bulun. Bunu, test edilen hayvana özgü bir başlığa değiştirin, örneğin, "sıçan#-zaman noktası" (Şekil 2B).
   4. Yazılım ekranının üst kısmındaki Sequencer'ı seçin. Açılan yeni pencerede, ekranın alt kısmındaki Sırayı Aç'ı seçin. Açılan dosya gezgininde önceden hazırlanmış sırayı seçin. Bu, Dizi penceresini frekans, uyaranların süresi ve dinlenme süresi gibi parametrelerin bir listesiyle dolduracaktır (Şekil 2C).
      1. Yükleme Sırası'na ve ardından Pencereyi Kapat'a tıklayın.
         NOT: Bu protokolde kullanılan dizi, her biri arasında 20 saniye dinlenme olan 9 adımdan (twitch, 20 Hz, 40 Hz, 50 Hz, 60 Hz, 80 Hz, 100 Hz, 150 Hz, 200 Hz) oluşur. Seğirme stimülasyonunun yanı sıra, tüm adımlar 500 ms sürelidir. Sekans protokolü, her laboratuvarın özel test hedeflerine göre ayarlanmalıdır.
   5. Yeni bir pencere açmak ve gerçek zamanlı veri alımının görüntülenmesini etkinleştirmek için Dosya > Canlı Veri İzleyicisi'ni seçin.
   6. Canlı Veri İzleyicisi penceresinde zaman ölçeğini, minimum y değerini ve maksimum y değerini manuel olarak veya otomatik ölçeklendirmeyi etkinleştirmek için kutuyu işaretleyerek ayarlayın.
3. Hayvan hazırlama
   1. Anestezi odasından çıkarmadan önce hayvanın uygun anestezi düzleminde olduğundan emin olun.
   2. İzofluranın sürekli uygulanmasına izin vermek için hayvanı sırtüstü pozisyonda, burnu güvenli bir şekilde burun konisine yerleştirin. Burnunu platformda güvenli bir şekilde tutmak için farenin çenesinin üst yarısının üzerine bir sabitleme halkası yerleştirin.
   3. Çenenin deney tarafında hayvanın boynunu ve yüzünü tıraş edin.
   4. Hayvanın üst yarısını, kollarına ve göğsüne bir kayış yerleştirip bağlayarak sabitleyin.
   5. X, Y ve Z düzlemlerini kontrol etmek için teçhizat platformunun yanında bulunan üç döner düğmeyi kullanarak ısırma kolu konumunu ayarlayın (Şekil 3A). Üst düğmeyi kullanarak, ısırma kolunu hayvana doğru indirin ve kolun ucunu hayvanın çenesinin hemen üzerinde olacak şekilde ayarlamak için diğer iki düğmeyi kullanın.
   6. Kafayı sabitlemek ve hareket etmesini önlemek için asılı halkayı hayvanın alt dişlerinin etrafına asmak için cımbız kullanın (Şekil 3B).
      NOT: Döngü, kuvvet dönüştürücüsünden 3 cm uzakta ısırma kolunda açılan bir delikten bulunur. Sistem ilk kullanımdan önce kalibre edilmelidir.
   7. Çene üzerindeki gerilimi artırmak için kolun yüksekliğini ayarlayın. Bu deneylerde kullanılan tekrarlanabilir temel gerilim ~ 0.5 N idi.
4. Elektrot yerleştirme
   1. Hayvanın çenesini palpe edin ve mandibulanın arka köşesini bulun. Elektrotları köşenin her iki tarafına yaklaşık 2-3 mm aralıklarla deri altından yerleştirin. Elektrotlar 3-5 mm derinlikte yerleştirilmelidir. Elektrotları yerinde tutmak için bir timsah klipsi ve stand kullanın.
   2. Canlı Veri Monitörü penceresinde, etkinleştirmek için Instant Stim etiketli büyük turuncu düğmeye tıklayın.
   3. Monitör, her stimülasyon sırasında yukarı doğru ani artışlar göstermeye başlamalıdır. Düğmeleri gerektiği gibi kullanarak elektrot yerleşimini ve kol kolu konumunu ayarlayın. Sadece çenenin ipsilateral tarafının aktivasyonu gözlenmelidir (Şekil 4).
   4. Yüksek güçlü iki fazlı stimülatörde, merkeze yakın "Aralık" ve "Ayarla" etiketli iki düğme vardır. Amperajı modüle etmek için Aralık düğmesini çevirmeye başlayın. Amper arttıkça, anlık stim zirveleri, art arda üç stimülasyonun aynı kasılma tepkileriyle sonuçlandığı seviye olarak belirlenen, plato haline gelene kadar büyüklük olarak artmaya başlayacaktır.
      1. Amperajı çok yükseğe çevirmekten kaçının, yani maksimum tepe noktalarının gözlemlendiği amperajın %20'den fazla olmamasına neden olun - çünkü bu, komşu kasların işe alınmasına ve yanlış kuvvet okumalarına neden olabilir.
   5. Çeneyi uyarmak için kullanılan mevcut "Aralık" yüzdesini modüle etmek için Ayar düğmesini çevirin. Seğirme yanıtını optimize etmek için akımda bir artış veya azalma gerekebilir.
   6. Elektrotların hala güvenli bir şekilde yerinde olduğunu onaylayın ve anlık uyarıyı durdurun.
   7. Canlı veri monitöründeki turuncu "Anında Stim" düğmesinin altında, gri Sırayı Başlat düğmesini bulun ve üzerine tıklayın.
   8. Stimülasyon protokolünün süresi boyunca eğrileri izlemeye devam edin. Stimülasyon frekansı arttıkça, üretilen maksimum kuvvet de artacaktır. Tetanoza ulaşıldığında, kuvvet eğrileri düzleşecektir (Şekil 5A).
5. Temizleme
   1. Fonksiyonel stimülasyon dizisinin tamamlanmasının ardından, elektrotları çıkarın ve %70 etanol ile silerek temizleyin. Eğer bu test edilecek son hayvan ise, elektrotlar kapaklarına geri yerleştirilebilir.
   2. Anestezi gazını kapatın, ancak bilincine geri dönüşünü izlemek için hayvanı ısıtılmış yüzeyde tutun. Sıçan bilincini geri kazanmaya başladığında, onu kafese geri koyun ve hayvan uyanık ve yürüyene kadar izlemeye devam edin.
   3. Veri toplama için kullanılan ekipmanı kapatın ve tüm yüzeyleri silin.

3. Veri analizi

NOT: Bu yöntem daha önce sıçan TA^8'in in vivo fonksiyonel testi için bir yöntemin belgelenmesi olarak tanımlanmıştır. Veri analizi, bu çalışmanın niyetlerini belirlemek için tasarlanmıştır ve protokoller, kullanıcının hedeflerine bağlı olarak değişebilir.

1. Dinamik Kas Analizi yazılımını bulun ve açın.
2. Yüksek Verim menüsüne tıklayın ve aynı anda birden fazla örneği analiz etmek için Kuvvet Frekansı Analizi'ni seçin.
3. Dosyaları Seç'i seçin ve analiz için istediğiniz kadar veri dosyasını vurgulayın. "Klasör Seç" düğmesi, örnekler dosya sistemi içinde açıkça adlandırılmışsa da kullanılabilir.
4. Taban Çizgisini Kaldır kutusunu işaretleyin. Bu, temel kuvveti her deneme için kaydedilen maksimum kuvvetten otomatik olarak kaldıracak ve mutlak maksimum değerleri sağlayacaktır.
5. Analiz Et düğmesine tıklayın ve ardından verilerin bir elektronik tablo olarak kaydedilebileceği Tabloyu Excel'e Aktar'a tıklayın. "İmleci Başlat" ve "İmleci Bitir" değerlerinin stimülasyonun zaman damgasını doğru bir şekilde yakaladığından emin olun. Gerekirse bu değerler manuel olarak ayarlanabilir.
6. Kaydedilen e-tabloyu açın.
   NOT: Kullanıcı, "Maksimum" sütununu kullanarak tüm frekanslarda üretilen maksimum kuvveti hesaplayabilir. Kuvvet-frekans eğrisi de oluşturulabilir (Şekil 5).

Sonuçlar

Önceki bir yayında açıklandığı gibi, tetanik eğriler, optimal sonuçları optimal olmayan sonuçlardan ayırt etmek için kullanılabilir⁸. Kas maksimum kuvvetine uyarıldığında ve tetanik kasılma süresi boyunca bu maksimumu koruduğunda ideal bir sonuç elde edilir. Bireysel seğirmelerin tetanik eğriler halinde toplanması genellikle 100 Hz'de veya sonrasında görünmeye başlayacaktır. Şekil 5A, 150 Hz'deki ideal eğrinin stimülasyonun başlangıcında keskin bir yükselişe, minimum salınımla maksimum kuvvet değerinde düz bir plato fazına ve stimülasyon durduğunda keskin, dikey bir aşağı dönüşe sahip olduğu için bu noktayı göstermektedir. İdeal olmayan tetanik eğriler, plato fazı sırasında salınımlar gösterebilir ve negatif veya pozitif bir eğim gösterebilir (Şekil 5C,D).

Bu fonksiyonel test protokolünün sonuçları, araştırmacıların hedeflerine ve çalışmanın deneysel tasarımına bağlı olarak farklı şekilde temsil edilebilir. Bu protokol söz konusu olduğunda, mutlak maksimum kuvvet, tüm stimülasyon frekanslarından ampirik olarak belirlenir ve test için her zaman noktasında grafiklendirilir. Bu, masseterde tarif edilen VML yaralanmasının yaratılmasından sonra her 4 haftada bir temel maksimum kuvvet üretiminin maksimum kuvvet üretimi ile karşılaştırılmasına izin verir (Şekil 1D). Karşılaştırma için, yaralanmamış hayvanlardan oluşan bir kohort (n = 4) da her zaman noktasında test edildi (Şekil 1E). Her bir zaman noktasındaki hayvan ağırlıkları da karşılaştırıldı (Şekil 1F). VML'den sırasıyla 4, 8 ve 12 hafta sonra, sıçanlar ortalama 7.958 N ±1.797 N, 7.183 N ±1.450 N ve 7.823 N ± 0.626 N maksimum kuvvet üretti. Tek Yönlü Tekrarlanan Ölçümler Fisher'ın En Az Anlamlı Farkı (LSD) ile Varyans Analizi (ANOVA) post hoc ikili karşılaştırmalar, VML yaralanması sonrası herhangi bir zaman noktasında bu değerler arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığını belirledi, bununla birlikte, hepsi 10.031 N ±0.564 N'lik ortalama temel kuvvetten önemli ölçüde farklıydı.

Şekil 1: VML yaralanmalı masseter kası için cerrahi şematik ve fonksiyonel sonuçlar. Anatomik yönelimi ve yaralanma oluşumu için sinir işaretlerini gösteren eksplante masseter kası (A). VML yaralanması oluşumundan önce (B) ve (C) sonrası ameliyat sırasında hayvan. Görüntülerin tümü (A) ile aynı yönde kaslarla sunulur. Sarı kesikli çizgi, kasın eksize edileceği bölgeyi gösterir. Massetere (D) VML yaralanması (n = 9) alan sıçanlarda ve ayrıca yaralanmamış bırakılan yaşa uygun kontrol sıçanlarında (n = 4) (E) başlangıçta ve zaman içinde maksimum kuvvet üretimi. Zaman içindeki sıçan vücut ağırlıklarının bir grafiği (F). (D), Fisher'ın LSD post hoc ikili karşılaştırmaları ile tek yönlü Tekrarlanan Ölçümler ANOVA'sını temsil eder, burada **= p < 0.01, ***= p < 0.001, ****= p < 0.0001. (A) ve (C) 'deki cetveller santimetre cinsindendir ve dereceler milimetre cinsindendir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İşlevsel test için yazılım başlatma. DMC yazılımı için parametre ayarı. Instant Stim'i istenen değerlere (A) ayarlama. Yazılım Grafiği Kullanıcı Arayüzü ve Otomatik Kaydetme Tabanı ayar kutusunun konumu (B). Test için kullanılan 9 adımlı protokol dizisinin seçimi (C). Burada görüntülenen değerler, bu etüt için kullanılan örnek değerlerdir, ancak diğerlerinin belirli kullanım durumlarına bağlı olarak optimize edilmeleri ve ayarlanmaları gerekebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Fonksiyonel teçhizat hareket eksenleri ve uygun hayvan konumlandırması. Şematik, fonksiyonel test donanımı üzerindeki üç ayar çarkının her biri ile kol kolu (A) için karşılık gelen hareket eksenleri arasındaki ilişkiyi göstermektedir. Fonksiyonel testlerden geçen, hayvanın platform ve diğer önemli teçhizat bileşenleri (B) üzerinde uygun sırtüstü pozisyonunu gösteren bir sıçanın örnek görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Test sırasında tek taraflı ve iki taraflı çene aktivasyonu örneği. (A), herhangi bir stimülasyondan önce sıçanın çenesinin dinlendiğini gösterir. Yanlış yerleştirilmiş elektrotlar, sarı oklarla (B) gösterildiği gibi iki taraflı çene kasılmasına neden olabilirken, uygun şekilde yerleştirilmiş elektrotlar istenen ipsilateral kasılmaya (C) neden olur. Sarı oklar çenedeki kasılma noktalarını gösterir. Ayrıca, bilateral (D) ve tek taraflı (E) kas aktivasyonu için 150 Hz'de örnek kuvvet-zaman eğrileri de gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Kabul edilebilir ve kabul edilemez denemeler için temsili stimülasyon-yanıt eğrileri. 40, 80 ve 150 Hz'de (A) örnek stimülasyon eğrileri, tetanik kasılmaya yol açan ve sırasında nelere dikkat edilmesi gerektiğini göstermek için. Stimülasyon frekansı arttıkça, kaydedilen tepe gerilimi de daha yüksektir, bu da başlangıçta ve VML'nin oluşturulmasından 8 hafta sonra yaralı hayvanların ortalamasını (n = 9) gösteren kuvvet-frekans eğrilerinde (B) gözlemlenebilir. (C,D), uygun olmayan tetanoz nedeniyle elektrot ayarlaması ihtiyacını gösterecek bir kuvvet tepkisinin şeklinin temsili örneklerini gösterin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Bu protokol, sıçan çenesinde üretilen ipsilateral ısırma kuvvetinin in vivo fonksiyonel testi için basit ve güvenilir bir yöntemi tanımlar. Ayrıca, sıçan masseter kasında bir VML yaralanmasının cerrahi olarak oluşturulması için bir yöntem de tarif edilmiştir. Kombinasyon halinde, bu yöntemler, travmatik bir kraniyofasiyal yaralanmadan önce ve sonra fonksiyonel iyileşmenin uzunlamasına bir değerlendirmesini yapmak için biyolojik olarak ilgili bir hayvan modeli sağlar. İn vitro ve in situ gibi diğer test yöntemleri de değerli bilgiler sağlayabilirken, tendonun izolasyonunu ve dokunun doğal ortamından çıkarılmasını gerektirir ve in vivo fonksiyonel sonuçların daha iyi anlaşılması için uygulanabilirliklerini sınırlar 8,25,26,27,28 . Uygun eğitim ve uygulama ile, bir araştırmacı bir hayvanı test için hızlı bir şekilde konumlandırabilecek ve maksimum kas kuvveti üretimini elde etmek için gerekli ayarlamaları yapabilecektir.

Uygun elektrot yerleşimini ve stimülasyonunu sağlamak için her hayvan için doğrulanması gereken teknik ayrıntılar vardır. İlk olarak, üst kesici dişler, farenin kafası ısıtılmış platformla tamamen temas halinde olacak şekilde sabitlenmelidir. Bu aynı zamanda inhale anesteziklerin sürekli uygulanması için sıçanın burnunu burun konisine yerleştirecektir. Kafa uygun konumda tutulmazsa, taban çizgisi gerilimi saptıkça kuvvet okumalarında tutarsızlıklar olacaktır. Ek olarak, hayvanın vücudu sırtüstü olmalı ve omurgası düz olmalıdır. Hayvanı uygun pozisyonda tutmak, elektrotun yerleştirilmesine ve doğru yerde bakımına yardımcı olacaktır. Son olarak, elektrotların yerleştirilmesi zor olabilir, çünkü çenenin sadece deneysel tarafını uyarmak için uygun derinlik ve aralıkta yerleştirilmeleri gerekir. Dikkat ve uygulama, tekrarlanabilir ve güvenilir sonuçlar için elektrot yerleştirmede usta olmakla ilgilidir. Elektrotlar oldukça hızlı bir şekilde donuklaşacaktır, bu nedenle onları sık sık değiştirmek gerekir. Kötü elektrot yerleşiminin ayırt edici özellikleri, aksesuar kasların aktivasyonu, pozitif/negatif eğimli kuvvet okumaları (stimülasyon sırasında elektrotların hareketi) veya kaynaşmamış/salınımlı bir tetanik dalga formudur⁸ (Şekil 5C,D).

Ayrıca, bu yöntemin, bu sistemin gelecekteki uygulamalarında bahsetmeyi ve dikkate almayı garanti eden birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, bu çalışmada yapılan ölçümler için yeterli olsa da, üst çeneyi sabitlemek için kullanılan halka en sert sistem olmayabilir. Bunun yerine, kulak çubuklarını kullanan stereotaksik bir yaklaşım, farenin üst çenesinin daha iyi tutulmasını sağlayabilir. Ek olarak, bu yöntemle test etmek için ayarlanan pozisyon olarak pasif bir gerilim değeri kullanıldı, bu da kasın optimal uzunluğunda (L_o) konumlandırılması durumunda elde edilecek maksimum kuvvet üretimi ile sonuçlanmayabilir. Aslında, L_o, hayvanın burada tarif edildiği gibi konumlandırılması ve ardından seğirme stimülasyonlarını çalıştırırken çene tıkanıklığının küçük (0,5-1 mm) artışlarla manipüle edilmesiyle belirlenebilir - L_o, maksimum seğirme kuvvetinin üretildiği optimal test pozisyonu olarak belirlenir. Bununla birlikte, masseter kası oldukça benzersiz bir geometriye ve harekete^{sahiptir 35,36} ve bu nedenle, örneğin uzuv kaslarının (tipik olarak L_o civarında çalışan) karakteristik özelliklerinden çok daha geniş bir uzunluk aralığında çalışır. Ancak çiğneme, ısırmaya göre daha dar bir aralıkta gerçekleşir. Bu nedenle, bu soruna mükemmel bir yaklaşım yoktur. Bu nedenle, bu soruna yaklaşmanın tek yolu temel bir gerilim belirlemek olmasa da, çene kaslarının optimal uzunluğu çenenin doğal açıklığının ötesinde olduğundan, bunu yapmak için mantıklı bir bilimsel gerekçe vardır. Ne olursa olsun, belirli bir pasif gerilimdeki maksimum kuvvet, L_o'daki maksimum kuvvetten farklı olsalar bile, fonksiyonun yönleri hakkında hala önemli bir fikir verir. Açıkçası, masseter kasının kuvvet-uzunluk ilişkisinin daha fazla araştırılması gerekmektedir. Son olarak, bu yöntem, sıçandaki trigeminal sinirin uyarılmasına bakar ve üç dala ayrılır: V1-V3. V3 veya mandibular sinir, motor bileşenli tek dal olsa da, masseter, temporalis, pterygoidler ve mylohyoid³⁷ dahil olmak üzere birçok kası innerve eder. Bu, dikkate alınması önemlidir, çünkü bu yöntemin yalnızca diğer araştırma araştırmalarıyla ilgili olabilecek masseter kuvvetini rapor etmediği anlamına gelir.

Bu teknik yönlere ve sınırlamalara rağmen, bu yöntemin sağlam ve tutarlı olduğu kanıtlanmıştır. Burada sadece ipsilateral test açıklanmış olsa da, protokol çenenin diğer tarafının ek testlerini içerecek şekilde kolayca değiştirilebilir. Masseter kasılmasının/fonksiyonunun iki taraflı testi, tek bir hayvanda sağlıklı/yaralı karşılaştırmaların yapılmasına izin verecek ve belki de yaralı ve/veya kontrol tarafında (yaralanmamış taraf) önemli telafi edici değişiklikleri aydınlatacaktır. Genel olarak, bu model, uzunlamasına kas fonksiyonunun yanı sıra fonksiyonel iyileşmeyi minimal invaziv bir şekilde değerlendirmek için güçlü bir araç sağlar. Bu nedenle, bu sistem, VML aracılı fonksiyonel eksikliklere katılan biyomekanik mekanizmaların değerlendirilmesinin yanı sıra, kraniyofasiyal bölgedeki VML yaralanmalarının onarımı için çeşitli terapötiklerin etkinliğini test etmek için geçerli olacaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 proof ethanol	Decon Labs		Diluted to 70% with deionized water
25 mm x 27 G monopolar needle electrodes	Chalgren Enterprises	111-725-24TP	Used to perform functional measurements
Alcohol Swabs	BD	326895	For sterilzation/cleaning
Alligator Clip and Stand/ Helping Hand Sodering Aid	Eclipse Enterprise	115584	Holding electrodes in place
Bead Sterilizer		18000-45	For surgery (resterilizing tools between animals)
Bi-phase Electrical Stimulator	Aurora Scientific	701C	Deliver electric impulses to animals during function testing
Bite lever	Custom		Cuttomized 3D printed (please contact the authors for details)
Compressed Oxygen Gas	Praxair	UN1072
Cotton tipped aplicators	Fisher	22363157	For surgery
Dual Mode Muscle Lever System	Aurora Scientific	309C	Used to perform functional measurements
Dynamic Muscle Data Acquisition and Analysis System	Aurora Scientific	615A	Used to collect and analyze functional measurements
Face mask	High Five	AM101	For surgery
Forceps	Integra Miltex	6-100	For surgery
Gauze	Medline	PRM21408C	For surgery
Hair Clippers	Phillips	MG3750	Fur removal
Hairnet	VWR	75829-204	For surgery
Isoflurane	Covetrud	29405
Isoflurane evaporizer funnel fill	Vet Equip	911103
Isoflurane Vaporizer	Kent Scientific	VetFlo-1231	Delivery of anesthesia
Large Rodent/Small Animal Apparatus	Aurora Sceintific	807B	Used with 309C motor for functional measurements
Microscissors	FST	91500-09	For surgery
Needle Driver	FST	1200-13	For surgery
Povidone-Iodine	Medline	MDS093943	For sterilzation/cleaning
Prolene Sutures 5-0	Ethicon	8698G	Suturing skin
Scalpel	Personna Medical	73-8030	For surgery
Scalpel Blade	Glass Van	1834	For surgery
Surgical drapes - ACT material	N/A	N/A	cut to 8 x 11 in and autoclaved prior to surgery
Surgical Gloves	Encore	5711103PF	For surgery
Surgical gown	VWR	414004-467	For surgery
T/Pump Heating/Cooling Pump	Braintree Scientific, Inc	TP-700	Heating animal platforms for surgery and function testing - set to continuous therapy time at 38/100 temperature
VaporGuard Activated charcoal filter	Vet Equip	931401
Vicryl Sutures 6-0	Ethicon	J492G	Suturing fascia