Hücre dışı vezikül izolasyonu için başarılı bir sıralama ayarlama

Özet

Bu protokol, mezenkimal stromal hücreler tarafından salınan hücre dışı veziküllerin (EV'ler) sıralanmasının ayrıntılı bir tanımını sağlar. Özellikle, cihaz ayarına ve sıralama koşullarının optimizasyonuna odaklanır. Amaç, özelliklerini koruyarak hücre dışı vezikülleri sıralamaktır.

Özet

Mezenkimal stromal hücreler (MSC'ler) tarafından salınan hücre dışı veziküller (EV'ler), rejeneratif ve antienflamatuar rollere sahip bir dizi mikroRNA içerir. Bu nedenle, saflaştırılmış MSC-EV'ler, çok çeşitli hastalıklar için yeni nesil bir terapötik seçenek olarak öngörülmektedir. Bu protokolde, genellikle ortopedik rejeneratif tıp uygulamalarında kullanılan adipoz türevli MSC'lerin (ASC'ler) süpernatantından EV'leri başarılı bir şekilde ayırma stratejisini rapor ediyoruz.

İlk olarak, floresan tespiti için karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE) ile EV izolasyonu ve etiketleme adımlarına odaklanarak numune hazırlamayı tanımladık; Akabinde protokolün ana kısmını oluşturan tasnif sürecini detaylı bir şekilde gerçekleştirdik.

MISEV 2023 ve MIFlowCyt EV kılavuzlarında tanımlanan kurallara ek olarak, nozul boyutu, frekansı ve kılıf basıncı ile ilgili özel deneysel koşullar uyguladık. Morfolojik parametreler, EV boyutunun teorik aralığını kapsayacak şekilde seçilen çap boncukları kullanılarak oluşturulur. ASC-EV'lerin tasnifinden sonra, tasnif edilen fraksiyonun sorter ile yeniden analiz edilerek ve nanopartikül izleme analiz tekniği ile EV boyut dağılımını doğrulayarak saflık kontrolü gerçekleştirdik.

EV'lerin artan önemi nedeniyle, incelemek ve karakterize etmek için saf bir nüfusa sahip olmak çok önemli hale geliyor. Burada, bu hedefe ulaşmak için sıralamayı ayarlamak için bir kazanan stratejisi gösteriyoruz.

Giriş

Hücre Dışı Veziküller (EV'ler), hemen hemen tüm hücreler tarafından salınan, bir lipid çift tabakası ile sınırlandırılmış, kendi başlarına çoğalamayan heterojen bir zar yapılı vezikül grubudur¹. Kan plazması, serum, tükürük, anne sütü, idrar, bronş lavaj sıvısı, amniyotik sıvı, beyin omurilik sıvısı ve malign asit gibi çeşitli biyosıvılarda bulunabilirler². EV'lerin ana işlevlerinden biri, nükleik asitler, proteinler, lipitler ve karbonhidratlar dahil olmak üzere çeşitli molekülleri bir verici ve bir alıcı hücre arasında taşımaktır. Bu, doğrudan membran füzyonu, reseptör-ligand etkileşim....

Protokol

Buradaki protokol dört bölümden oluşmaktadır: (1) Numune hazırlama, (2) ASC-EV'lerin karakterizasyonu, (3) ASC-EV'lerin sınıflandırılması ve (4) Sıralama sonrası analiz. İş akışını temsil eden bir şema Şekil 1'de gösterilmiştir.

Şekil 1: Protokol Akış şeması. Akış şeması, protokolde yer alan adımları gösterir. (1) numune hazırlama, (2) tasnif öncesi veziküllerin kara....

Sonuçlar

FSC polistiren tanecikleri, cihaz kurulumunu ve sıralama koşullarını doğrulamak için sıralanmıştır. FSC polistiren boncuklar, 100 nm, 300 nm, 500 nm ve 900 nm arasında değişen floresan boncukların bir karışımıdır ve FITC kanalında görülebilir. Şekil 7A , sıralamadan önce dört boncuk popülasyonu ile FITC günlük ölçeği nokta grafiğine karşı SSC günlük ölçeğini göstermektedir. 100 nm, 300 nm ve 500 nm'lik floresan popül.......

Tartışmalar

EV'leri analiz etmek ve sıralamak, küçük boyutları ve çoğu akış sitometresinin algılama sınırına yakın olmaları nedeniyle zordur. Amacımız, CFSE ile etiketlenmiş AMSC'lerden türetilen EV'leri izole etmek için bir protokol geliştirmekti. CFSE, antikorlar tarafından verilen protein agregatları gibi istenmeyen partiküllerin oluşumu olmadan, bildirilen yüksek EV etiketleme verimliliği (%≥90) nedeniyle boyama yöntemi olarak seçilmiştir. Bununla birlikte, estera.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester	Merck	150347-59-4
Adipose Mesenchymal Stromal Cells	Wepredic, Parc d'affaires, 35760 Saint-Grégoire, France		Cells used in this study
Alexa 488 anti-Caveolin	R&D Systems	IC5736G	Flow cytometry antibody
APC anti-human CD44	BioLegend	338805	Flow cytometry antibody
APC anti-human CD63	BioLegend	353007	Flow cytometry antibody
APC anti-human CD81 (TAPA-1)	BioLegend	349509	Flow cytometry antibody
APC anti-human CD9	BioLegend	312107	Flow cytometry antibody
BC CytoFLEX S	Beckman Coulter		BC CytoFLEX S equipped with 3 lasers, Blue, Red and Violet
Flow-Check Pro Fluorospheres	Beckman Coulter	A63493	Fluorescent control beads for MoFLO Astrios EQ
FlowJo software (version 10.8.1)	BD	version 10.8.1	Analysis software
IntraSure kit	BD Biosciences	641776	Fixation and permeabilization for intracellular staining
Megamix-Plus FSC	BioCytex	7802	FSC polystyrene beads
MoFLO Astrios EQ	Beckman Coulter		MoFLO Astrios EQ equipped with 4 lasers, Blue, Yellow - Green, Violet and Red
Mouse anti-FLOT1 antibody	BD Transduction Laboratories	610820	Western Blot antibody
NanoSight NS300	Malvern	NS300
Rabbit anti-Calnexin antibody	Origene	TA336279	Western Blot antibody
Rabbit anti-CD9 and CD81 antibody (ExoAb antibody kit)	System Biosciences	EXOAB-KIT-1	Western Blot antibodies
Rabbit anti-TSG101 antibody	Merck	HPA006161	Western Blot antibody
Triton X-100	Merck	9036-19-5
Ultra Rainbow Fluorescent Particles	Spherotech	URFP-30-2
Ultracel 100 kDa MWCO	Merck	UFC910024
VER01 - Verity Shells	Exometry		Organo silica beads for scatter calibration