Постановка успешной сортировки для выделения внеклеточных везикул

Резюме

Этот протокол дает подробное описание сортировки внеклеточных везикул (ВВ), выделяемых мезенхимальными стромальными клетками. В частности, основное внимание уделяется настройке приборов и оптимизации условий сортировки. Цель состоит в том, чтобы отсортировать внеклеточные везикулы с сохранением их характеристик.

Аннотация

Внеклеточные везикулы (ВВ), высвобождаемые мезенхимальными стромальными клетками (МСК), содержат набор микроРНК с регенеративной и противовоспалительной ролью. Таким образом, очищенные MSC-EV рассматриваются как терапевтический вариант следующего поколения для широкого спектра заболеваний. В этом протоколе мы описываем стратегию успешной сортировки ВВ от надосадочной жидкости жировых МСК (МСК), часто используемых в ортопедической регенеративной медицине.

Во-первых, мы описали подготовку образца, уделяя особое внимание этапам выделения EV и мечения карбоксифлуоресцеином сукцинимидиловым эфиром (CFSE) для обнаружения флуоресценции; Далее мы подробно описали процесс сортировки, который составляет основную часть протокола.

В дополнение к правилам, определенным в рекомендациях MISEV 2023 и MIFlowCyt EV, мы применили специальные экспериментальные условия, касающиеся размера, частоты и давления оболочки сопла. Морфологические параметры устанавливаются с помощью валиков диаметров, выбранных для покрытия теоретического диапазона размеров EV. После сортировки ASC-EV мы провели проверку чистоты отсортированной фракции, повторно проанализировав ее с помощью сортировщика и проверив распределение EV по размерам с помощью метода анализа с отслеживанием наночастиц.

В связи с растущей важностью электромобилей наличие чистой популяции для изучения и характеристики становится критически важным. В этой статье мы продемонстрируем выигрышную стратегию для настройки сортировки для достижения этой цели.

Введение

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой гетерогенную группу мембранно-структурированных везикул, выделяемых почти всеми клетками, ограниченных липидным бислоем, неспособных к самостоятельной репликации¹. Они могут быть обнаружены в нескольких биожидкостях, таких как плазма крови, сыворотка, слюна, грудное молоко, моча, жидкость бронхиального лаважа, амниотическая жидкость, спинномозговая жидкость и злокачественный асцит². Одной из основных функций ВВ является транспортировка различных молекул, включая нуклеиновые кислоты, белки, липиды и углеводы, между донорской и реципиентной клетками. Это может происходить с помощью различных механизмов, таких как прямое слияние мембран, рецептор-лигандное взаимодействие, эндоцитоз и фагоцитоз ^3,4. По этой причине было продемонстрировано, что они играют важную роль во многих физиологических и патологических процессах, и они демонстрируют значительные перспективы в качестве новых биомаркеров заболеваний, в качестве средств доставки лекарств и в качестве терапевтических^{агентов.}

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) представляют собой мультипотентные клетки, которые могут быть выделены из многих тканей, включая жировую ткань, пульпу зуба, пуповинную кровь, плаценту, амниотическую жидкость, желе Уортона и даже мозг, легкие, тимус, поджелудочную железу, селезенку, печень и почки. В последние годы они привлекли значительный интерес к регенеративной медицине⁷. Мезенхимальные стволовые клетки (ASC), полученные из жировой ткани, могут быть получены из жировой ткани с помощью менее инвазивной процедуры по сравнению с другими источниками, такими как костный мозг, что приводит к снижению риска тяжелых осложнений и позволяет избежать^{этических проблем.}

Кроме того, жировая ткань содержит значительно более высокую концентрацию МСК, чем костный мозг (1% против >0,01%) и другие источники, такие как дерма, пульпа зуба, пуповина и плацента. МСК играют решающую роль в регенерации поврежденных тканей и клеток благодаря их способности к дифференцировке и секреции широкого репертуара факторов роста, хемокинов и цитокинов; Эти терапевтические преимущества объясняются их способностью к дифференцировке, а также тем фактом, что они выделяют широкий репертуар факторов роста, хемокинов и цитокинов. Ярким примером является терапевтический потенциал МСК для лечения ортопедических заболеваний, при этом термин «заболевания опорно-двигательного аппарата» имеет наибольшее количество зарегистрированных клинических исследований за clinicaltrials.gov год (по состоянию на 13^мая 2024 года).

Кроме того, МСК могут также секретировать ВВ, которые участвуют в регенерации тканей путем передачи информации поврежденным клеткам или тканям и проявляют биологическую активность, аналогичную материнской клетке ^9,10. По этой причине МСК-ВВ могут быть ценной заменой клеточной терапии для достижения бесклеточного подхода¹¹, с двумя клиническими исследованиями с использованием МСК-ВВ для ортопедических состояний (NCT05261360 и NCT04998058). Тем не менее, все еще существует ряд проблем для клинического применения электромобилей. Например, существуют некоторые опасения по поводу методов изоляции электромобилей: большинство из них не гарантируют чистоту или целостность везикул. Кроме того, некоторые методы изоляции являются сложными, трудоемкими и имеют низкую повторяемость, что делает их непригодными для клинического использования¹².

Сортировка клеток, с другой стороны, является широко используемым методом, который позволяет выделить отдельные клетки из гетерогенных клеточных суспензий с использованием специфических флуоресцентных^{маркеров13}. Его можно использовать для многих применений и адаптировать к различным типам образцов. Однако, несмотря на то, что сортировка клеток является хорошо зарекомендовавшей себя и широко используемой технологией, сортировка EV по-прежнему очень сложна, поскольку большинство EV находятся ниже минимального порога обнаружения даже для самых чувствительных проточных цитометров. Есть некоторые особенности, которые делают сортировщик более подходящим для этой цели. Прежде всего, с помощью системы Jet-in-air, в которой поток, суспензирующий частицы, опрашивается лазерами на воздухе, а не внутри проточной ячейки; Эта система сохраняет образец, снижая напряжение, которому он подвергается. Вторым важным моментом является наличие полосы «затемнения» между потоком и линзой сбора, которая снижает фоновый оптический шум прибора. Несмотря на то, что фоновый шум низкий, он не устраняется полностью и представляет собой эталон, который обеспечивает частичное окно в события, попадающие под пороговое значение: это очень важно для анализа событий, которые близки к «пределу обнаружения» прибора¹⁴. Наконец, сортировщик оснащен двухканальным прямым рассеянием (FSC) с двумя различными масками, которые обеспечивают улучшенную дискриминацию между мелкими и крупными частицами в образце.

На основе этого мы разработали протокол, направленный на выделение меченых MSC-EV карбоксифлуоресцеина сукцинимидилового эфира (CFSE) с помощью высокочувствительного клеточного сортировщика. Чтобы свести к минимуму манипуляции с электромобилями и сохранить их целостность и количество, мы избегали этапов ультрацентрифугирования во время подготовки образцов. Кроме того, условия сортировки были скорректированы таким образом, чтобы свести к минимуму нагрузку на везикулы, включая дальнейшую оптимизацию нашего прибора за счет снижения давления сортировки, связанного с размером сопла (сопло 70 мкм при давлении 35 фунтов на квадратный дюйм).

протокол

Протокол здесь состоит из четырех частей: (1) Подготовка образцов, (2) Характеристика ASC-EVs, (3) Сортировка ASC-EV и (4) Анализ после сортировки. Схема, представляющая рабочий процесс, показана на рисунке 1.

Рисунок 1: Блок-схема протокола. На блок-схеме показаны этапы, включенные в протокол. (1) подготовка образцов, (2) характеристика везикул перед сортировкой, (3) сортировка и (4) анализ везикул после сортировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

1. Подготовка образцов

1. Коллекция надосадочной жидкости, обогащенная внеклеточными везикулами (EV)
   1. Размораживание или сбор жировых МСК (ИСС), которые были культивированы в пассаже до сбора ВВ (обычно проходы с 1 по 5), и посев на каждый ПСС изолируют идентичное количество клеток (например, 1 миллион клеток на 175^см2 поверхности колбы приводит к примерно 60%-70% слиянию).
   2. Выращивайте ASC в соответствующей питательной среде (DMEM-F12 для данного протокола) с добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS) без EV или лизата тромбоцитов человека (hPL), в соответствии с требуемым протоколом, в течение 48-72 ч.
      1. Чтобы получить FBS или hPL без EV, ультрацентрифугу при 120 000 x g в течение ночи при 4 °C и используйте надосадочную жидкость.
         ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента под отображаемой центробежной силой всегда понимается среднее значение для используемого прибора, ротора и труб. Имейте в виду, что разные роторы или трубки могут иметь переменную перегрузку на оборот и k-фактор. Для простого сравнения роторов и регулировки перегрузки и скорости обратитесь к одной из доступных таблиц преобразования https://www.beckman.it/centrifuges/rotors/calculator.
   3. При 90% слиянии клеток отделите и подсчитайте ИСК и суспендируйте в нужном объеме бессывороточной среды, в идеале 1 мл на 1 x 10⁶ ИСС. Высевают АСК в суспензии в 24-луночные планшеты по 1 мл на лунку. Без сыворотки клетки останутся во взвешенном состоянии и образуют сфероид. Через 96 ч соберите надосадочную жидкость.
   4. Удалите плавающие клетки и мусор с помощью последовательного центрифугирования при 4 °C: 400 x g в течение 10 мин, 1 000 x g в течение 10 мин, 2 000 x g в течение 10 мин и дважды 4 000 x g в течение 10 мин.
   5. Отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтр 0,22 мкм, чтобы удалить оставшиеся частицы размером более 220 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте немедленно для последующих применений или храните не более одной ночи при температуре 4 °C или заморозьте при -80 °C, если дальнейшие действия не будут выполнены в течение 24 часов.
2. Окрашивание электромобилей для сортировки
   1. Приготовьте 5 мМ раствор 5(6)-карбоксифлуоресцеина диацетата N-сукцинимидилового эфира (CFSE). Используйте его свежеприготовленным или заморозьте при температуре -20 °C в защищенном от света месте.
   2. Приступайте непосредственно к шагам 1.1.1-1.1.5 (в течение 24 ч) или размораживайте хранящиеся ВВ-содержащие надосадочные жидкости при температуре 4 °С.
   3. Перед окрашиванием нагрейте надосадочную жидкость при температуре 37 °C и добавьте CFSE до конечной концентрации 10 мкМ (500-кратное разбавление). Выдерживать в течение 1 ч при температуре 37 °C в темноте.
   4. Во время инкубации добавьте 2 мл PBS в центробежный концентратор (мембрана из регенерированной целлюлозы, MWCO 100 кДа), крышку и центрифугируйте при давлении 4 000 x g в течение 10 минут в роторе с качающимся ведром. Удалите нефильтрованный PBS со дна фильтрующего устройства и отсасывайте фильтрат из сборной трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный протокол центробежной ультрафильтрации основан на обработке до 15 мл образца (максимальный объем).
   5. Добавьте до 15 мл образца в центробежный концентратор и закройте устройство. Центрифуга при давлении 4 000 x g до 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В результате получается окончательный образец в среднем 500 μл. Однако в зависимости от таких факторов, как характер образца и скорость потока, время центрифугирования, необходимое для достижения желаемой концентрации, может варьироваться.
   6. Снимите устройство с центрифуги и опорожните сборную пробирку. Добавьте в фильтрующее устройство 14 мл PBS. Центрифуга при давлении 4 000 x g до 30 мин.
   7. Повторите шаг 1.2.6.
   8. Извлеките из фильтрующего устройства концентрированный образец EVs, окрашенный CFSE, примерно 500 μл и храните 100 μL при температуре 4 °C в темноте, продолжая сортировку оставшегося образца.

2. Характеристика ASC-EV

1. Вестерн-блоттинг маркеров EV
   1. Гранулы ASC (1 x 10⁶) при 376 x g при RT в течение 5 мин и суспендировать в соответствующем буфере для лизиса с добавлением ингибиторов протеазы. Проведите количественное определение белка с помощью выбранного анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как показывает опыт данного исследования, наилучшие результаты количественной оценки достигаются с помощью метода анализа бицинхониновой кислоты.
   2. Количественно определить концентрированный надосадочный слой в эквиваленте 1 x 10⁶ ASC по методу Брэдфорда или гранулированные EV, соответствующие 1 x 10⁶ ASC при 100 000 x g при 4 °C в течение 1 ч, и суспендировать в соответствующем буфере для лизиса с добавлением ингибиторов протеазы. Проведите количественное определение белка с помощью выбранного анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как показывает опыт данного исследования, наилучшие результаты количественной оценки для гранул EV достигаются с помощью метода анализа бицинхониновой кислоты.
   3. Если вместо очищенных EV используется концентрированный надосадочный агент, лизируйте образцы в 5% 2-меркаптоэтанола и 2x буфере Laemmli.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как показывает опыт данного исследования, как концентрированная надосадочная жидкость, так и очищенные ВВ дают сопоставимые результаты для положительных и отрицательных маркеров ВВ.
   4. Загрузить и разделить образцы (1-10 мкг) в 10% полиакриламидный гель при напряжении 110 В в течение 90 мин.
   5. Перенести на нитроцеллюлозную мембрану при давлении 250 мА на 120 мин.
   6. Окрашивание мембраны с помощью Ponceau S для визуализации образцов и переноса по лестнице. Удалите Ponceau S с PBS под легким встряхиванием.
   7. Заблокируйте мембраны 5% обезжиренным сухим молоком и 0,1% подростком в PBS в течение 60 минут.
   8. Зондирующие мембраны с соответствующими антителами при рабочих разведениях, включая положительные (например, в данной работе CD9, CD81, TSG101 и Flotillin) и отрицательные (например, в данной работе Calnexin) маркеры EV, при 4°С в течение суток.
   9. Промыть 0,1% Tween в PBS и инкубировать с соответствующими пероксидазными вторичными антителами в течение 45 мин при ЛТ до выявления полосы с помощью системы ECL по выбору. Получение изображений с помощью доступной системы визуализации (рис. 2A).
2. Проточный цитометрический анализ маркеров EV: поверхностное окрашивание
   1. Перед применением центрифугируйте каждое моноклональное антитело (mAb) при 15 000-17 000 x g в течение 30 минут при 4 °C для устранения агрегатов, которые могут вызывать ложноположительные сигналы. Далее мАТ фильтруют в отдельные центробежные фильтрующие трубки размером 0,22 мкм при давлении 1000 x g при 4 °C до тех пор, пока вся смесь не пройдет через фильтр и на поверхности фильтра не останется жидкости с антителами. Храните mAb при температуре 4 °C.
   2. Приготовьте разведение EV, окрашенных CFSE в соотношении 1:10 (см. шаг 1.2.1-1.2.8) в PBS, отфильтрованном по 0,22 мкм.
   3. Инкубируйте 100 мкл образцов или 0,22 мкм отфильтрованных PBS с EV-специфичными mAb (анти-CD9/63/81) или MSC-специфичными mAb (анти-CD44) или MSC-специфичными mAb (анти-CD44), ранее титрованными. Проводить инкубацию при температуре 4 °C в темноте в течение 30 минут.
      Примечание: Этот протокол, разработанный для обнаружения типичных ВВ и маркеров линии МСК, может быть расширен на все другие маркеры клеточной линии или подтип-специфичные для ВВ поверхности. Не используйте флуорохромы, попадающие в канал флуоресцеина изотиоцианата (FITC), чтобы избежать перекрытия при окрашивании CFSE на электромобилях. Выполните однократное окрашивание с использованием каждого mAb, конъюгированного с одним флуорохрома, например, аллофикоцианином (APC). Многоцветное окрашивание возможно, но необходимо включить контроль для устранения потенциальных проблем со стерическими препятствиями антителами. Необходимо протестировать отдельные антитела по отдельности или в составе смеси и убедиться в том, что сигнал сопоставим. Кроме того, FMO должны быть включены в систему контроля.
   4. Настройте калибровку разброса, как описано в шаге 3.2.
   5. Создание точечной диаграммы логарифмической шкалы бокового рассеяния (SSC) в сравнении с логарифмической шкалой FITC и прогоните трубку с фильтрацией 0,22 мкм либо PBS, либо неокрашенных EV; установите пороговое значение на канале FITC и настройте его на максимальные значения, исключающие большую часть фонового шума. Нарисуйте регион, определяющий положительные события CFSE.
   6. Создайте график гистограммы APC, стробированный по области положительных событий CFSE, и прогоните трубку с фильтрацией 0,22 мкм либо PBS, либо неокрашенных EV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для усиления APC используйте усиление, установленное с помощью контроля качества прибора, хотя рекомендуется выполнить определенное усиление для оптимизации характеристик инструмента.
   7. Добавьте 200 мкл PBS, отфильтрованного по 0,22 мкм, к окрашенным образцам и соберите. Используйте низкий расход (10 мкл в минуту) для сбора и записи. Если возможно, запишите не менее 5 000 событий в положительный гейт FITC.
   8. Используйте элемент управления PBS, окрашенный mAb, для обнаружения возможных неспецифических сигналов mAb. Считывание всех пробирок с одной и той же скоростью потока для обеспечения согласованности между прогонами.
   9. Чтобы избежать перекрестного загрязнения пробы, запустите моющее средство в течение 10 секунд между каждой анализируемой пробиркой, а затем 10 с деионизированной (DI) водой (Рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание нестабильности прибора Fluidics получите образец в течение 10 секунд, а затем начните запись.
3. Анализ маркера EV методом проточной цитометрии: внутриклеточное окрашивание
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для внутриклеточного окрашивания используйте специальный набор, содержащий реагенты для фиксации и пермеабилизации. Анти-кавеолин mAb конъюгирован с Alexa 488. Окрашивание IC проводилось в отсутствие CFSE.
   1. Перед использованием центрифугируйте mAb, как описано ранее (шаг 2.2.1).
   2. Для внутриклеточного окрашивания следуйте инструкциям производителя (рисунок 2C).
4. Определение концентрации и размера EV с помощью анализа с отслеживанием наночастиц (NTA)
   1. Сделайте соответствующие разведения образцов для получения 20-120 событий в кадре обзора дисплея прибора NTA.
   2. Введите образцы в камеру для образцов инструмента NTA с помощью инсулинового шприца объемом 1 мл.
   3. Настройте программное обеспечение NTA для записи следующим образом: 5 стандартных измерений, по 60 с каждое, и насос расхода, установленный на 30.
   4. Установите интенсивность света на соответствующее значение, позволяющее четко различить частицы на фоне, и запустите скрипт захвата в программном обеспечении NTA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка уровня камеры может повлиять на обнаружение частиц. Если значение слишком велико, возникает молочный фон и сильное рассеяние света частиц, охватывающее большую часть сигналов частиц. Если значение слишком низкое, хотя и получается более темный фон, возможно, будет пропущено большинство менее ярких событий. Каждый образец должен контролироваться для оптимальной настройки.
   5. Отрегулируйте коэффициент разбавления, если количество частиц на кадр меньше 20 или больше 80.
   6. Установите пороговое значение 4 для анализа среднего модального размера и концентрации частиц надосадочной жидкости. Учитывайте исходные коэффициенты разведения.
   7. Очищайте камеру прибора деионизированной водой после каждого образца, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
   8. Откройте программное обеспечение для анализа NTA и выполните анализ полученных образцов с учетом коэффициента разбавления (рисунок 2D).
5. Определение характеристик морфологии EV с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)
   1. Соберите концентрированный надосадочный слой ASC или изолируйте EV путем ультрацентрифугирования (100 000 x g при 4 °C в течение 1 ч) с последующей суспензией гранул в том же объеме PBS.
   2. Дайте 5 мкл концентрированной надосадочной жидкости или EV впитаться на решетках с углеродным покрытием в течение 10 минут. Промокните лишние капли жидкости фильтровальной бумагой.
   3. Провести отрицательное окрашивание 2% уранилацетатом в водной суспензии в течение 10 мин с использованием идентичного объема капли образца (5 мкл). Удалите излишки уранилацетата, прикоснувшись к сетке фильтровальной бумагой.
   4. Высушите решетку при комнатной температуре (RT) и рассмотрите ее с помощью просвечивающего электронного микроскопа при напряжении 120 кВ (рис. 2E).

Рисунок 2: Характеристика ASC-EVs. (A) Репрезентативный вестерн-блот положительных (CD9, CD81, TSG101 и Flotillin) и отрицательных (Calnexin) маркеров. Сообщается о соответствующих молекулярных массах, а в качестве контроля используются лизаты ASC. (B) Анализ маркеров EVs методом проточной цитометрии. Анализировали экспрессию следующих маркеров: CD9, CD63, CD81 и CD44. Только CFSE-положительные ASC-EV были проанализированы на экспрессию маркеров. Гистограммы представляют собой неокрашенные (красные гистограммы) и окрашенные (синие гистограммы) ASC-EV. (В) Проточная цитометрия внутриклеточный анализ маркера EVs Caveolin. Гистограммы представляют собой неокрашенные (серая гистограмма) и окрашенные (синие гистограммы) ASC-EV. (D) Определение характеристик ASC-EV компанией NTA. Гистограммы представляют собой концентрацию (частиц/мл)/размер (нм) образца. e) Визуализация ASC-EV с помощью TEM. Масштабные линейки = 100 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Сортировка ASC-EV

1. Настройка сортировщика ячеек
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сортировщик клеток представляет собой проточный цитометр, который позволяет выделить чистую популяцию из гетерогенного исходного образца. Сортировщик ячеек отделяет целевые частицы путем колебания потока с помощью пьезоэлектрика с высокой частотой для генерации капель, содержащих событие. Капли, содержащие интересующие частицы, такие как клетки или везикулы, заряжаются и отклоняются через металлические отклоняющие пластины. Отсортированная фракция используется для выполнения последующего анализа.
   1. Откройте напорный трубопровод и пропылесосьте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые сортировщики имеют автоматический запуск, в то время как другие имеют ручной запуск. Сортировщик с ручным запуском является предпочтительным, так как он позволяет оптимизировать некоторые технические характеристики, такие как частота, давление и выбор наконечника форсунки. В частности, рекомендуется работать с частотой 66 000 Гц, давлением 35 psi и соплом 70 мкм.
   2. Включите прибор, откройте шкаф биобезопасности и запустите программное обеспечение сортировщика.
   3. Нагнетайте давление в гидродинамической системе, а затем включите ее в жидкостную систему.
   4. Активируйте Drop Drive, пьезоэлектрический кристалл в сопле, который вибрирует, образуя капли.
   5. Выполните процедуру удаления пузырьков для устранения наличия пузырьков в системе, а затем запустите пробирку 5 мл чистящего раствора в течение 5 минут при высоком перепаде давления и 5 мл пробирки деионизированной воды в течение 5 минут.
   6. Выполните процедуру запуска вручную.
      1. На вкладке «Управление лазером» нажмите кнопку «Питание лазера », чтобы включить питание лазера.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите эту процедуру для всех лазеров: синего 488 нм, желто-зеленого 561 нм, фиолетового 405 нм и красного 640 нм.
      2. Изучите вертикальное выравнивание потока.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В случае необходимости переместите ступень сборки сопла, в частности, передний и задний микрометр, левый и правый микрометр, а также кардан для регулировки вертикального выравнивания и проверки вертикального потока с помощью верхнего и нижнего микрометра; Для наилучшего выравнивания поток должен быть вертикальным на каждом лазере. Если вы впервые используете определенную насадку, необходимо выполнить лазерную задержку . На сенсорной панели на вкладке «Лазер и перехват потока » выберите правильный размер сопла, нажмите кнопку «Лазерная задержка » и следуйте инструкциям по лазерной задержке, чтобы выполнить процедуру лазерной задержки. Как правило, при изменении давления тубуса и, следовательно, кончика сопла, лазерное определение задержки выполняется до нахождения юстировки. В конце процедуры лазерной задержки предлагается выполнить процедуру вычитания фонового изображения, следуя инструкциям на экране, чтобы свести к минимуму фоновый сигнал.
      3. Выполните определение лазерного пятна, нажав на вкладку «Перехват лазерного потока», кнопку с зеленой стрелкой и следуя инструкциям на сенсорном мониторе.
   7. Инициализируйте Intellisort. Установите частоту падения и значение амплитуды по умолчанию, при котором поток образует каплю.
      1. После выполнения этого шага загрузите сохраненную конфигурацию. Чтобы загрузить сохраненную конфигурацию настроек, выберите «Загрузить настройку сортировки » на панели инструментов программного обеспечения сортировщика. Проверив различные частоты и амплитуды, выберите лучшую, которая обеспечивает наилучшую устойчивость к падениям. Работают на частоте 66 000 Гц и амплитуде около 40-45 В.
   8. Выполните процедуру точного лазерного выравнивания .
      1. Загрузите в пробоотборник пробирку объемом 5 мл с валиками для выравнивания QC и запустите ее; выберите на вкладке Fine Alignment нужный параметр по оси X и Y для того, чтобы визуализировать хорошо уплотненные и коллимированные бусины. В области отображения данных выберите в первую очередь 488 - 513/26-H для параметра по оси Y и 488-FSC1-H для параметра по оси X. Затем, чтобы выполнить тонкую настройку всех лазеров, выберите 405-488/59-H для параметра по оси Y и 640-795/70-H для параметра по оси X.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранные параметры зависят от конфигурации лазера сортировщика. Рекомендация по работе с прибором заключается в выборе лазеров с наибольшим пространственным разнесением на полосе точечного отверстия. Для этого используют фиолетовый лазер (405 нм) и красный лазер (640 нм).
      2. После того, как специалист по сортировщику проверит ручное выравнивание, выполните автоматический контроль качества. Выберите диаметр валиков для контроля качества: диаметр 3 мкм.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В конце этой процедуры результатом может быть то, что контроль качества не пройден или контроль качества пройден. В случае, если контроль качества не удается, необходимо вручную оптимизировать центровку.
      3. Сохраните данные контроля качества в программном протоколе Alignment.
   9. Завершение процедуры Intellisort
      1. Расположите отклоняющие пластины в правильном положении в сортировщике и включите напряжение (рекомендуется зарядка 3 000 В на отклоняющих пластинах).
      2. Выберите 6 Tube Holder для сортировки выхода, включите потоки, выбрав их на индикаторе потока, и выполните тестовый поток.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если потоки четко не разделены и не определены, отрегулируйте фазу заряда, дефраннинг или измените другие параметры, чтобы получить четко определенный и не колеблющийся поток.
      3. Включите кнопку Intellisort Automatic Drop Delay Definition . Этот шаг позволяет установить правильную задержку падения. После этого шага снова проверьте потоки.
      4. Активируйте режим обслуживания Intellisort. Проверьте задержку сброса вручную.
      5. Загрузите ручной протокол Drop Delay в программное обеспечение сортировщика. Приобретите флуоресцентные контрольные шарики.
      6. Вставьте правильный держатель слайдов. В программном обеспечении сортировщика выберите «Сортировать > мастер задержки сброса». Выберите Логика сортировки.
      7. Проверьте с помощью флуоресцентного микроскопа наличие 97% флуоресцентных шариков на пятой луже.
2. Настройка прибора: калибровка разброса
   ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка рассеяния выполняется с использованием бусин Verity Shells (далее именуемых полыми органическими гранулами кремнезема). Эти кремнеорганические шарики характеризуются распределением показателя преломления и свойствами светорассеяния, более близкими к электромобилям, чем к полистирольным шарикам, что позволяет при настройке напряжения SSC и FSC лучше различать события, подобные EV, и электронный шум. Органоорганические гранулы кремнезема состоят из двух флаконов со смесями гранул: VER01A (189 нм шариков) и VER01B (374 нм шариков). Каждый флакон содержит смесь полых кремнеорганических гранул и зеленых флуоресцентных бусин длиной 380 нм, называемых эталонными бусинами. Концентрация полых органических гранул кремнезема составляет 1 x 10⁸ гранул/мл.
   1. Приготовьте образец гранул VER01A и VER01B, разбавив по одной капле (50 мкл) каждого из них в 1 мл 0,22 мкм отфильтрованного PBS с конечной концентрацией 5 000 бусин/мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием сделайте вихревую обработку бусин в течение 5 секунд.
   2. Создайте точечную диаграмму логарифмической шкалы SSC в сравнении с логарифмической шкалой FITC.
   3. Получите швы VER01B и отрегулируйте напряжение, чтобы хорошо различить эталонные швы в верхней правой части точечной диаграммы SSC/FITC (Рисунок 3A).
   4. Установите область вокруг этой популяции бусин.
   5. Создайте точечную диаграмму логарифмической шкалы SSC в сравнении с логарифмической шкалой FSC. Определите эталонные бусины и популяцию бусин VER01B. Задайте область вокруг популяции бусин VER01B (рисунок 3B).
   6. Приобретите бусины VER01A и создайте область вокруг этой популяции бусин (Рисунок 3C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта популяция бусин частично перекрывается с фоновым шумом инструмента.
   7. Получите PBS с фильтрацией 0,22 мкм и отрегулируйте порог для снижения фонового шума прибора без потери визуализации мельчайших бусин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка рассеяния может быть выполнена с использованием шариков FSC Megamix (далее именуемых гранулами полистирола FSC), смеси флуоресцентных шариков со следующими диаметрами: 100 нм, 300 нм, 500 нм и 900 нм. Использование полых органоорганических гранул кремнезема должно быть предпочтительнее, чем гранул из полистирола FSC, поскольку они имеют распределение показателя преломления и свойства рассеяния света, аналогичные электромобилям. Популяция 300 нм гранул полистирола FSC перекрывается с эталоном полых органоорганических гранул кремнезема. Таким образом, затвор на основе полых кремнеорганических гранул кремнезема выбирает EV аналогичного размера на проточном цитометре.
3. Получение образцов
   1. Создайте точечную диаграмму логарифмической шкалы SSC в сравнении с логарифмической шкалой FITC, получите PBS с фильтрацией 0,22 мкм и определите эталонный фоновый шум (рис. 4A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установите скорость потока цитометра в положение «Низкая» и контролируйте скорость потока. Количество событий/ов не должно превышать 2 000 событий/с. Расход Низкий означает при низком перепаде давления.
   2. Возьмите контрольный образец (неокрашенные электромобили) и проверьте скорость потока. Убедитесь, что количество событий/ов составляет около 5 000 событий/с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество событий превышает предложенное, разбавьте образец.
   3. Получите окрашенный PBS и обработанный как образец CFSE, и убедитесь, что положительные события не видны (рис. 4B).
   4. Приобретите образец окрашивания CFSE. Разбавляют его исходя из скорости потока. Нарисуйте регион, определяющий положительные события CFSE, и регион, определяющий отрицательные события CFSE. В качестве контроля используйте неокрашенный образец (рисунок 5A, B). Это регионы сортировки.
4. Сортировка образцов
   1. В программном обеспечении сортировщика откройте новый протокол (на панели инструментов выберите Файл > протокол > Новый).
   2. В программном обеспечении сортировщика нажмите «Настройка сбора данных»; в окне Acquisition Parameter выберите интересующие каналы и отключите остальные. Для этой конкретной панели поддерживаются следующие сигналы: 488-FSC1, 488-FSC2, 488-SSC и 488-513/26 (для сигнала CFSE).
   3. Найдите на пробоотборнике 5 мл пробирки с образцом. На сенсорном экране нажмите кнопку Загрузить , а на панели инструментов программного обеспечения сортировщика выберите Сбор данных > Начать (или нажмите кнопку F2 ). Появится окно с образцами свойств; Вставьте имя образца и нажмите OK.
   4. Создайте панель, с интересующим вас участком и создайте стратегию стробирования.
      1. На панели инструментов программного обеспечения сортировщика выберите Гистограмма > Создать гистограмму.
      2. В рабочей области создадим три точечных графика, первый с параметром 488-FSC1 Height-Log по оси x и параметром Height-Log по оси Y 488-SSC Height-Log, второй с параметром Height-Log по оси X 488-FSC2 и параметром Height-Log по оси Y 488-SSC Height-Log, третий с параметром Height-Log по оси X 488-513/26 CFSE Height-Log и по оси Y 488-SSC Height-Log.
   5. На вкладке Сортировка определите регионы, которые необходимо отсортировать. В программном обеспечении сортировщика нажмите кнопку Настройка сортировки. В окне Сортировка логики и статистики выберите область для сортировки в построителе логики.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы принять решение о сортировке, необходимо учитывать различные настройки: «Логика сортировки», «Режим сортировки» и «Огибающая». Логика сортировки относится к стратегии стробирования. События, которые находятся за пределами выбранных ворот, не сортируются. Режим сортировки связан с конечным выводом. Работайте в режиме Очищения, таким образом, все отсортированные капли содержат только желаемые положительные события. Drop Envelope определяет, сколько капель будет начислено и отсортировано в зависимости от местоположения в дропе положительного события: выберите 1-2 капли, чтобы быть уверенным, что все положительные события отсортированы.
   6. Когда расход стабилен, остановите сбор данных (на панели инструментов программного обеспечения сортировщика выберите Сбор > Остановить или нажмите кнопку F2 еще раз). Начните сортировку (на панели инструментов программного обеспечения сортировщика выберите «Сортировать» > «Пуск » или нажмите кнопку F4 ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем начать сортировку, проверьте тестовый поток. Убедитесь, что отсортированная фракция правильно попадает в сборную пробирку.
   7. Сохраните настройку сортировки. На панели инструментов программного обеспечения сортировщика выберите «Сортировка» > «Сохранить настройки сортировки».
5. Проверка чистоты отсортированного населения
   1. Промойте прибор, набрав 5 мл чистящего раствора в течение 10 минут при высоком перепаде давления и 5 мл воды DI в течение 10 минут.
   2. Получите PBS с фильтрацией 0,22 мкм и убедитесь, что нет CFSE-положительных событий.
   3. Развести 5 мкл отсортированного образца в 100 мкл 0,22 мкм отфильтрованного PBS.
   4. Соберите и запишите все объемы образцов (рис. 5C, D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сообщается о повторном анализе как положительных, так и отрицательных отсортированных EV CFSE.

Рисунок 3: Настройка физических параметров с помощью полых органических гранул кремнезема. (A) Точечная диаграмма SSC/FITC: для установки параметра SSC использовались опорные зеленые флуоресцентные шарики. Точечная диаграмма SSC/FSC из (B) бусин VER01B и (C) VER01A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Эталонный фоновый шум. (A) Точечная диаграмма SSC/CFSE образца PBS. (B) Точечная диаграмма SSC/CFSE образца PBS + CFSE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Сортировка окрашенных ASC-EV CFSE. (A) Точечная диаграмма SSC/CFSE неокрашенных EV, (B) Окрашенные CFSE EV, (C) отрицательные CFSE EV после сортировки и (D) CFSE положительные EV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

4. Анализ после сортировки

ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за ограниченного количества материала после сортировки может оказаться невозможным выполнить все анализы. С полученной суммой выполняются следующие действия.

1. Определение характеристик EV с помощью проточной цитометрии: поверхностное окрашивание (см. шаг 2.2)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как описано ранее для предварительной сортировки образцов, за исключением подготовки образцов. Образцы после сортировки можно использовать в неразбавленном виде.
   1. Используйте неразбавленные отсортированные образцы и действуйте в соответствии с пунктом 2.2.3. (Рисунок 6А)
2. Определение концентрации и размера EV с помощью NTA (см. шаг 2.4)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как описано ранее для предварительной сортировки образцов, за исключением подготовки образцов. Образцы после сортировки можно использовать в неразбавленном виде.
   1. Используйте неразбавленные отсортированные образцы и действуйте в соответствии с шагом 2.4.2. (Рисунок 6В)
3. Определение характеристик морфологии EV с помощью ПЭМ (см. шаг 2.5)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как описано ранее для предварительной сортировки образцов, за исключением подготовки образцов.
   1. Добавьте 2 мл PBS в центробежный концентратор (мембрана из регенерированной целлюлозы, MWCO 100 кДа), крышку и центрифугуйте при давлении 4 000 x g в течение 10 минут в роторе с качающимся ведром. Удалите нефильтрованный PBS со дна фильтрующего устройства.
   2. Фильтрат аспирата из сборной пробирки. Описанный протокол центробежной ультрафильтрации основан на обработке образцов объемом до 15 мл (максимальный объем).
   3. Добавьте до 15 мл образца в фильтр AU-15 и закройте устройство крышкой. Центрифуга при давлении 4 000 x g до 30 мин. Сконцентрируйте до минимального объема, который позволяет устройство, примерно 100-150 μл.
   4. Извлеките концентрированную отсортированную пробу EV из фильтрующего устройства и действуйте, как описано ранее для предварительной сортировки проб TEM (шаг 2.5.2) ( рис. 6C).

Рисунок 6: Характеристика отсортированных ASC-EV. Проточный цитометрический анализ маркеров EV. Анализировали экспрессию следующих маркеров: CD9, CD63, CD81 и CD44. Только CFSE-положительные ASC-EV были проанализированы на экспрессию маркеров. (A) Гистограммы представляют собой неокрашенные (красные гистограммы) и окрашенные (синие гистограммы) ASC-EV. (B) Определение характеристик ASC-EV компанией NTA. Гистограммы представляют собой концентрацию (частиц/мл)/размер (нм) образцов предварительной сортировки (слева) и после сортировки (справа). (C) Визуализация ASC-EV с помощью ПЭМ предварительной сортировки (слева) и последующей сортировки (справа) пробы. Масштабные линейки = 100 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

Гранулы из полистирола FSC были отсортированы для проверки настройки прибора и условий сортировки. Шарики из полистирола FSC представляют собой смесь флуоресцентных шариков в диапазоне от 100 нм, 300 нм, 500 нм и 900 нм, которые видны на канале FITC. На рисунке 7A п?...

Обсуждение

Анализ и сортировка EV является сложной задачей из-за их небольшого размера и того факта, что они близки к пределу обнаружения большинства проточных цитометров. Наша цель состояла в том, чтобы разработать протокол для изоляции электромобилей, полученных из AMSC, помечен?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester	Merck	150347-59-4
Adipose Mesenchymal Stromal Cells	Wepredic, Parc d'affaires, 35760 Saint-Grégoire, France		Cells used in this study
Alexa 488 anti-Caveolin	R&D Systems	IC5736G	Flow cytometry antibody
APC anti-human CD44	BioLegend	338805	Flow cytometry antibody
APC anti-human CD63	BioLegend	353007	Flow cytometry antibody
APC anti-human CD81 (TAPA-1)	BioLegend	349509	Flow cytometry antibody
APC anti-human CD9	BioLegend	312107	Flow cytometry antibody
BC CytoFLEX S	Beckman Coulter		BC CytoFLEX S equipped with 3 lasers, Blue, Red and Violet
Flow-Check Pro Fluorospheres	Beckman Coulter	A63493	Fluorescent control beads for MoFLO Astrios EQ
FlowJo software (version 10.8.1)	BD	version 10.8.1	Analysis software
IntraSure kit	BD Biosciences	641776	Fixation and permeabilization for intracellular staining
Megamix-Plus FSC	BioCytex	7802	FSC polystyrene beads
MoFLO Astrios EQ	Beckman Coulter		MoFLO Astrios EQ equipped with 4 lasers, Blue, Yellow - Green, Violet and Red
Mouse anti-FLOT1 antibody	BD Transduction Laboratories	610820	Western Blot antibody
NanoSight NS300	Malvern	NS300
Rabbit anti-Calnexin antibody	Origene	TA336279	Western Blot antibody
Rabbit anti-CD9 and CD81 antibody (ExoAb antibody kit)	System Biosciences	EXOAB-KIT-1	Western Blot antibodies
Rabbit anti-TSG101 antibody	Merck	HPA006161	Western Blot antibody
Triton X-100	Merck	9036-19-5
Ultra Rainbow Fluorescent Particles	Spherotech	URFP-30-2
Ultracel 100 kDa MWCO	Merck	UFC910024
VER01 - Verity Shells	Exometry		Organo silica beads for scatter calibration