Bu çalışma, Alman Ulusal Bilim Vakfı (DFG) ve Federal Risk Değerlendirme Enstitüsü (BfR Almanya) tarafından desteklenmiştir.

Dört önemli adımlar içeren protokol tüm tasarım üzerinde Şekil 1&#39;de tasvir edilmiştir. Tüm adımlar tam ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Konfokal görüntüleme ile yaklaşık 24 saat takip Hücre izolasyonu, iletimi ve kültür, daha sonra üst üste ve zorunlu bir zaman çizelgesi. Virüs yapımı öncesinde hücre izolasyonu yapılmalı ve daha sonra genetik transdüksiyon için kullanılır. 1. Sıçan kalp yetişkin kardiyak miyositler izolasyonu <ol><li> Yetişkin erkek Wistar sıçan ağırlığı yaklaşık 250 g (6-12 hafta) 100 g vücut ağırlığı başına 170 ul anestezi çözüm intraperitoneal anesthetised. </li><li> Ayrıca, bir sitrat solüsyonu (2 ul / g vücut ağırlığı), ameliyat sırasında kan pıhtılaşmasını önlemek için enjekte edilir. </li><li> Langendorff Perfüzyon Set-Up hazırlanmalıdır. Tüm çözümler oksijen ile doymuş olmalıdır. </li><li> Sıçan anesthetised olduğunda, hayvan cerrahi gemide sabit ve vücudun üst kısmı% 70 etanol ile dezenfekte edilir. </li><li> Hayvan karotis ile keserek öldürdü. </li><li> Toraks makas kullanılarak açıldı. Kalp ve aort şimdi erişilebilir olmalıdır. Perikard kaldırılır. </li><li> Buz gibi soğuk bir çözüm A + (5 ml), kalp tutuklanması ve kan yıkamak için 26-gauge iğne kullanılarak her iki ventrikülde enjekte edilir. </li><li> Aort bir kelepçe ile yakaladı ve aortik ark kesilir ilk dallanma oluşur. </li><li> Kalp, göğüs kaldırılır ve aorta retrograd Langendorff-perfüzyon izin forseps ile bir set-up ve bir kelepçe perfüzyon kanülü takılı. Aort kapakları foraminate farkında olun. </li><li> Kalp, aort / kanül etrafında lanmas sabit olması gerekiyor. Açık gemi bağlandı gerekir. </li><li> Kalp oksijen doymuş çözüm yaklaşık 70 mbar basınç altında 10 dakika oda sıcaklığında (23 ° C) A + retrograd perfüzyon. Hiç hava kabarcığı aort girdiğinizden emin olun. </li><li> Perfüzyon çözüm 37 sıcaklıkta bir Liberase çözüm açıldığında ° C peristaltik bir pompa vasıtasıyla 4 ml / dak hızında yaklaşık 25 dk. Perfüzyon sonunda kalp mermer beyaz bakmak gerekir. Sindirim süresi durum / doku durumuna adapte edilmesi gerekebilir. </li><li> Kalp perfüzyon set-up alınan ve 37 ° C sıcaklıkta A Petri kabı içeren çözüm yerleştirilir. Kalan damarları ve kulakçıklar kesilir. Gemiler atılır ve kulakçıklar gerekirse (Bu protokolü parçası) farklı şekilde tedavi edilir. Ventriküller yaklaşık 6 adet ayrılır. </li><li> Adet, 37 ° C ve 5 dakika boyunca 37 ° C su banyosunda hafifçe çalkalanır. Sıcaklıkta 20 ml solüsyon içeren 100 ml Erlenmeyer şişesinin aktarılır Sonunda Süpernatant atılır. </li><li> Yukarıda açıklanan prosedür bir veya iki kez tekrarlanır. Süpernatant hafif opak görünmelidir. </li><li> Ekstraselüler kalsiyum konsantrasyonu artış, 37 1 / 2 B çözeltisi 20 ml ekleyerek ° C artık bir çözüm kalan hücre ve doku tarafından başlatılan Erlenmeyer şişesi . Bu ek bir 5 dakika 37 ° C su banyosunda hafifçe sarsıldı. Daha sonra süpernatant atılır. </li><li> 20 ml solüsyon B 1 / 2 daha ekleyin. (Çözüm / süpernatant canlı hücreler içermelidir.) Hücrelerin bir damla, bir ters hücre kültürü mikroskobu bir petri kabına aktarılır. Hücreleri yüksek spontan aktivite (kasılmaları), hücreleri geri kalanına gelene kadar beklemek bir ihtiyacı göstermektedir. </li><li> Bir kez daha süpernatantı atılır ve 20 ml 1 / 2 B çözeltisi eklenir. </li><li> Plastik Pasteur pipeti ucu delikten ajite doku parçaları kolayca geçebilir ki böyle bir şekilde kesilir. Alev tedavi ile keskin kenarları yumuşatılmış (eritilmiş). </li><li> Şimdi doku parçaları hafifçe ve nazikçe triturated. Doku parçaları hücrelerine &quot;çökmeye&quot; olmalı. </li><li> Hücre içeren süpernatant dekante ve deney türüne bağlıdır ve ampirik olarak tespit edilmelidir istenilen hücre yoğunluğu ulaşmak için B çözeltisi ile seyreltilir. </li></ol> 2. Için bir füzyon proteini transdüksiyon adenovirüs İnşaatı Adenovirüs üretmek için MP Biyomedikal Transpose-Reklam adenoviral Vector Sistemi 1 kullanılır. Bu protokol, floresan füzyon proteini veya GEB s 2 ve test giriş vektörü (pCR259) ile başlar . <ol><li> 100 ul HighQ-1 Transpose-AD ™ 294 yetkili hücreleri ile bir miktar ilgi gen içeren yukarıda bahsedilen ilk pCR259 vektör 10 ng dönüşür. </li><li> Bu karışım 42 45 s için bir ısı şoku ° C tarafından takip edilmekte ve ilave 2 dakika süreyle buz üzerinde depolanan buz üzerinde 20 dk inkübe edilir. </li><li> 900 &amp; muL 4 saat boyunca yavaşça sallanarak unselective LB-orta ve 37 büyümeye ° C. </li><li> Plaka 50 ul ul Kloramfenikol (Cm, 20 mg / ml), ampisilin (100 mg / ml), tetrasiklin (15 mg / ml), X-Gal (280 mg / ml LB-orta içeren plakalar üzerinde 100 ve 200 ul ) ve IPTG (40 mg / ml). (Daha yoğun ve hızlı mavi bir boyama 300μg/ml daha pahalı boya Bluo-Gal kullanarak mümkündür. Özellikle kullanılması gerektiğini mavi / beyaz koloniler tanıma ve ayırt edici çok tanıdık değildir) </li><li> 37 az 24 saat için büyümek ° C. Mavi koloniler iyi tanımlanması mümkündür 4 ° C kadar bırakın. Koloni almak ve bazı kolonilerin çoğaltmak üç antibiyotik içeren başka bir plaka, X-Gal ve IPTG ve bunları 37 gece boyunca büyümesine izin ° gerçekten beyaz karar problemleri olduğunda C. Not) HighQ 1 Transpose-AD ™ 294 hücre içeren iki önemli plazmid bulunan adenovirüs omurga (Transpose-Reklam ™ 294) ve bir yardımcı hedefine sitelerine ilgi gen ekleme aracılık transposase, ifade plazmid, plazmid Transpose-AD 294 LacZ gen. </li><li> Virüs omurga ilgi gen 2,7-2,9 açıklanan koloni-PCR gerçekleştirmek içeren pozitif koloniler belirlemek için. Çoklu klonlama yeri (ileri 5 ters 5 &#39;3 GCGGATAACAATTTCACACAGG&#39;, &#39;3 CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG&#39;) yan primerler vektör kullanın ve eklenen gen olmaksızın% 100 beyaz koloniler ile bir koloni PCR Transpose-AD 294 plazmid için bir denetim yapmak ve bir mavi koloni çıkar. Mavi koloniler kısa bir PCR parçası (~ 200bp), ilgi gen içeren koloniler, büyük bir PCR ürünü (ilgi gen uzunluğuna göre) ve iki parça birden çok hücre kolonileri ile koloniler vermek ve ayrılmış olması daha fazla kullanılır. </li><li> Bir ana karışımı aşağıdaki tabloya göre hazırlıklı olmak gerekiyor. </li><li> Otoklavlanmış bir kürdan ile% 100 beyaz tek bir koloni seçin ve bu koloninin ilk Cm LB-plaka üzerinde bir çoğaltmak. </li><li> Koloni PCR karışımı içine aktarın. PCR-mix PCR karışımı bir sürü emmek önce kürdan kaldırmak daha 3-4 kez Twirl. PCR protokolü ekleme ve kullanılan polimeraz kb bağlıdır. Primer tavlama sıcaklığı 57 ° C ve 35 döngülerinin bir kullanım tavsiye edilir. </li><li> Büyümeye pozitif klonların gece kültürleri (Cm LB-orta) ve merkezkaç kuvvetinin büyük bir virüs vektör bozar, çünkü dönüş kolonsuz ticari bir kit ile plazmid izole. </li><li> 100 ul DH5α yetkili hücreleri izole plazmid 0.5 mg Dönüşümü. 30 dakika buz üzerinde hücre DNA inkübe edin. Isı şoku 45 s 42 ° C ve 2 dakika süreyle buz ayarlanır. </li><li> 900 ul unselective LB-orta ekleyin ve 1 saat için 37 ° C yavaşça sallanarak büyüyecek. </li><li> Plaka 50 Cm, X-Gal ve IPTG LB-orta içeren bir plaka üzerinde ul. 37 ° C&#39;de 24 saat inkübe edin. </li><li> Pick up ve ayrı Ampisilin, Tetrasiklin ve Kloramfenikol plakaları IPTG ve X-Gal içeren 20% 100 beyaz koloniler kadar çoğaltmak. Bunları 37 gece boyunca büyümeye ° C % 100 beyaz, kloramfenikol dirençli, ampisilin ve tetrasiklin duyarlı koloniler seçin. </li><li> Colony-PCR (isteğe bağlı): pozitif klonların eklemek içerdiğini kontrol etmek için koloni-PCR ile tekrar test edilebilir. </li><li> Olumlu bir rekombinant tek bir koloni seçin ve Cm ile 600 ml LB-orta büyümeye. </li><li> Plazmid maxi kiti kullanılarak plazmid izole edin. </li><li> 37 az iki saat boyunca Pac ile plazmid Digest 5 mikrogram °, C ve 65 reaksiyonu durdurmak ° C&#39;de 20 dk. </li><li> 10 ul son bir hacmi 30 dakika oda sıcaklığında bir SpeedVac tüm sindirimi Konsantre veya fenol-kloroform ekstraksiyon yöntemi kullanabilirsiniz. </li><li> Dondurulmuş QBI-HEK 293 hücreleri 37 ° C su banyosunda yavaşça sallanarak bir şişe çözülme. % 70 etanol ile flakonun dışında durulayın ve steril bir kaput aseptik devam. </li><li> , Steril 15 ml tüp hücreleri aktarın nazik ajitasyon, damla damla 10 ml DMEM (10% FCS) ve 250xg pelet hücreleri 10 dakika santrifüj. </li><li> Süpernatant atın. Hafifçe aşağı yukarı pipetleme ve 10 ml DMEM (10% FCS) pelletini tekrar. </li><li> 75 cm 2 balonuna Tohum ve hücrelerin% 10 FCS ile 10 ml DMEM ekleyin. 37 gece boyunca inkübe ° C% 5 CO 2 inkübatör. </li><li> Ertesi gün hücre yoğunluğu olun. QBI-HEK 293 hücreler bir 1:10 ila 1:20 oranında bölünmüş olmalıdır. </li><li> Hücreler orta çıkarın ve 1-3 dakika için 2 ml tripsin ile trypsinize. 10 dakika 250xg hücreleri ve santrifüj 10 ml DMEM verin. </li><li> Orta dikkatlice çıkarın ve hücreleri için 10 ml taze orta vermek, tekrar süspansiyon ve hücreleri saymak. </li><li> 2x10 5 ile altı kuyu, 3x10 5 Levha </s&gt; 4x10 5, 5x10 5 ve 6x10 5 hücre. 37 çanak ° C&#39;de bir CO 2-inkübatör. </li><li> Ertesi gün% 50 izdiham konsantre Pac I sindirimi ile transfect ile iyi kullanmak. Biz Lipofectamine 2000 transfeksiyon ile iyi bir deneyim var, ama aynı zamanda diğer yöntemleri (kalsiyum fosfat transfeksiyon gibi) uygun olmalıdır. </li><li> Üstel büyüme işlemi sırasında hücreler almak için transfeksiyon önce 3-4 saat orta değiştirin. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 5 ul Lipofectamine 250 ul DMEM ve inkübe ile karıştırın. </li><li> DNA Lipofectamine-Orta Karışımı verin (Pac I sindirmek) ve reaksiyon tüpü karşı dokunarak karıştırmak pipetleme karıştırılması yok. Karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. </li><li> Transfeksiyon karışımı hücrelere Kutu ve karıştırmak için plaka kaya. 37 ° ° C&#39;de% 5 CO 2 ile inkübe edin. 4-5 saat sonra orta değiştirin. </li><li> İki gün sonra transfeksiyon hücreleri orta ve yeni bir kültür şişesi (75 cm 2) vermek. </li><li> 5 dakika kadar 500 ul tripsin hücreleri Trypsinize. Hücreleri için 1 ml DMEM verin, kültür balona 17 ml taze orta (FCS ile DMEM) ile birlikte, tüm karışım ve koyun. 37 ° hücreleri Yetiştirmek ° C,% 5 CO 2 ile sitopatik etkiler (CPE) görünür olana kadar. CPE gibi nasıl görünmesi gerektiğini öğrenmek için Şekil 2&#39;ye bakınız. </li><li> 50 ml tüp orta hücreleri toplayın ve hücrelerin dondurulması -80 ° C Üç donma / çözülme döngüsü (-80 ° C/37 ° C su banyosu) ile hücreleri kırın. </li><li> 8000xg ve 4 20 dakika Santrifüj ° C 100mm çaplı çanak içine süpernatantı Durusu ve pelet atın. Süzüntü süpernatantı 0.45μm gözenek boyutu ile steril bir filtre kullanın. Bu ilk virüs stoku (geçit 1). </li><li> 75cm 2 balon QBI-HEK 293 hücreleri% 70 izdiham ile birlikte bir uyum sağlamak bu hisse senedinin 1 / 3 kullanın. 37 ° ° C&#39;de ve% 5 CO 2 CPE s görünür olana kadar. </li><li> Hücrelerin CPE onları toplamak ve daha önce yaptığımız gibi virüsleri ayıklamak göstermektedir. Bu virüsün 2 geçit. </li><li> 2.37 ve 2.38 ile virüs geçişini adımları yineleyin 2 ve olana kadar virüs amplifikasyon yeterli bir virüs stokunun ulaşır. Virüs özel santrifüj tüpleri (Millipore ultracel-100 membran ile Amicon Ultra-15 Santrifüj filtre ünitesi) ile konsantre ve -80 ° C&#39;de birkaç ay saklanabilir Bulaşıcı parçacıkları bir plaket tahlil saymak için kullanırlar. </li><li> Hücreleri transduce ve virüsün daha fazla amplifikasyon için 2 ya da daha yüksek virüs geçişini kullanın. </li></ol> 3. Birincil hücre kültürü ve adenoviral transdüksiyon <ol><li> 20 mm çaplı steril yuvarlak kapak fişleri, standart 12-iyi levhalar yerleştirilir. </li><li> 20 ul ECM çözümü her kapak astar üzerine eşit olarak dağıtılır. Kalıntıları atılır. Kurutma en az 1 saat izin için 37 ° C. Alternatif kaplama oda sıcaklığında (12 saat) gece boyunca kurutulur. </li><li> Her iyi antibiyotik ve ITS içeren takviyeleri ile 1 ml Orta M199 ile doludur. </li><li> 200 ila 400 ul arasında bir hücre süspansiyonu (1.21 adım), her bir kuyunun eklenir. Hücrelerin ekimi gerçekleşir 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatör . </li><li> Hücreler tortu izin verilir ve 1 saat sonra orta değiştirildi. </li><li> Orta hemen değiştirdikten sonra, virüsü içeren solüsyonu (geçit 2 veya daha yüksek) bir yeterli miktarda plaka yavaşça sallanarak karıştırılır. </li><li> Uzun vadeli bir kültür ortamı durumda 2 günde bir değiştirilir. </li><li> 24 saat sonra transfeksiyon GEB ifade saptanabilir. </li></ol> 4. Konfokal 3D hücre içi yapılar için görüntüleme ve Ca 2 + Sinyali Herhangi bir konfokal mikroskop Konfokal görüntüleme yapılabilir. Ancak, kalsiyum görüntüleme deneyleri video oranı (25-30 Hz) en az bir toplama hızı gerektirir. Bu, çoklu ışın tarayıcıları (örneğin Nipkow disk, alan veya kilo-ışını dizi tarayıcı süpürüldü) ya da çok hızlı tek ışınlı tarayıcı (örneğin rezonans tarayıcı veya acousto optik deflektörü (AOD)-scanner) kullanılabilir teknolojiler kısıtlar. Ref bir bakış için bkz. 3. 3D-hücre içi görüntüleme z-drive gerektirir. Burada bir kilo-ışını dizi tarayıcı (VTinfinity, VisiTech Int, Sunderland, İngiltere) kullanılır. <ol><li> Mikroskop ve bilgisayar çevre donanımlarının bir çalışma moduna ayarlanması gerekir. Özellikle lazer için istikrarlı bir çıkış gücüne ulaşana kadar bu dönemi bir ısınma gerekebilir. </li><li> Hücreler bir deney odası (kapak kayma transferi) transfer edilmesi gerekir. Lamelleri hücreleri ile bir deney odasına aktarılır. 1mL Tyrode solüsyonu (1.8 mM ekstrasellüler kalsiyum içeren) sonra eklenir. </li><li> Deney odasına mikroskop sahnede yerleştirilmesi gerekiyor. Uyarım elektrotlar, perfüzyon set-up ve daha fazla peripheral cihazlar, örneğin sıcaklık kontrolü, buna göre düzenlenmiş olması gerekir. </li><li> Hücreler odaklı ve beyaz ışık ve / veya epifluorescent aydınlatma ile seçilecektir. </li><li> Toplama, lazer gücü, pozlama süresi vs ya da bütün bir deney protokolü gibi parametreleri set-up ihtiyacı var. </li><li> Zaman serileri ve / veya Z-kesit görüntüleri elde edilebilir. </li><li> Set-up daha gelişmiş çok modlu ölçümlerde elektrofizyoloji (yama-kelepçe) ve / veya floresan photobleach sonra yeniden dağıtılması (sıkı bağlamak) veya iki foton fotoliz gibi maddelerin uncaging gibi optik manipülasyonu kullanarak yapılabilir. </li><li> Görüntü analizi, özellikle 3D rekonstrüksiyon Imaris (Bitplane AG, Zürih, İsviçre), hız (Doğaçlama, Coventry, Birleşik Krallık) veya Arivis Tarayıcı (arivis GmbH, Rostock, Almanya) gibi özel analiz yazılımları yapılmaktadır. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Protokolün nihai sonuçlar daha fazla veri elde etmek için kullanılmaktadır olabilir görüntü dizileri. Bir örnek, hücre içi organel yapısı ve soruşturma. Şekil 3 golgi 3 boyutlu düzenleme örnek gösteriyor. Elektron mikroskobu aksine tüm soruşturmalar canlı hücreler yapılabilir. <img src="/files/ftp_upload/1433/JoVEFig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: önemli deneysel adımlar Genel akış. <img src="/files/ftp_upload/1433/JoVEFig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: Sol görüntü transduced% 90-95 confluency kültür Q-HEK hücreleri gösteriyor. Sağ tarafına viral transdüksiyon sonra Cytopatic etkileri gösterilmiştir. Hücreler ve yuvarlak plakanın alt terketmez. Bu hücrelerin çekirdeğini aktif virüs üretimin bir sonucu olarak hücrelerin büyük bir kısmını kaplar. <img src="/files/ftp_upload/1433/JoVEFig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3: golgi hedefleyen bir YFP füzyon proteini ile transfekte Yetişkin sıçan kalp miyosit. Adenoviral gen transferi (bir gün kültür) sonra kardiyak miyositler floresan füzyon proteini ifade eder. Panel A z-yığından alınan tek bir konfokal dilim gösteriyor. Panel B&#39;de aynı hücrede bir teorik nokta dağılım fonksiyonu (PSF) kullanarak deconvolution sonra tasvir edilmiştir. Bu de bulanık görüntü yığını, daha sonra hücre render ve panel C veya 3 boyutlu yüzey rekonstrüksiyonu (D) &#39;de gösterildiği gibi bir 3D ses yeniden yapılanma almak için kullanılır. Bar 10 mm temsil eder.

<ol>
	<li>Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, ., Licha, K., Lin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Imaging II. Vol. 7370, 737008-737008 (2009).</li><li>Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+Drosophila+melanogaster+pupae+with+mesoscopic+fluorescence+tomography.">In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography.</a> Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).</li><li>Kaestner, L., Lipp, P., Shorte, S. L., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 289-289 (2007).</li><li>Kaestner, L., Lipp, P., Popp, J., von Bally, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optics in Life Science. Vol. 6633, 66330K-66330K (2007).</li><li>Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+delivery+of+short+hairpin+RNA+(shRNA)+mediates+efficient+gene+silencing+in+terminally+differentiated+cardiac+myocytes.">Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes.</a> Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).</li></ol>

Sıçan kardiyomiyositlerinin izolasyonu için açıklanan prosedür, gerekirse diğer türler, örneğin fare 4 adapte edilebilir. Uyarlanması gereken bir parametre sindirim için enzim karışımı (aşağıya bakın) ve aynı zamanda sindirim süresi. Bazı türler (örneğin fare) hücreler, diğerleri (örneğin, sıçan) daha kırılgan olabilir farkında olun. Kollajenaz seçimi muhtemelen izolasyon prosedürü en önemli adımdır. Hemen hemen hiçbir partiden partiye var...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Anesthesia solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 &mu;l Rompun (2% Xylazinhydrochlorid)</td>
</tr>
<tr>
<td>Citrate solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution A+</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Liberase solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>F. Hoffmann&#x2010; La Roche Ltd.</td>
<td>11988476 001</td>
<td>500 &mu;l stock solution in 15 ml solution A (stock solution:
10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.)</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Content of solution A plus 200 &mu;M CaCl2 and 0.1% DNase solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution B1/2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1:1 mixture of solution A and solution B</td>
</tr>
<tr>
<td>DNase solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma&#x2010; Aldrich Co.</td>
<td>D4527</td>
<td>Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris&#x2010;HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol</td>
</tr>
<tr>
<td>Extracellular matrix protein (ECM) solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracellular matrix protein (ECM) solution</td>
<td>E1270</td>
<td>1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL
medium M199</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture medium M199</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PAA</td>
<td>E15&#x2010;834</td>
<td>Medium M199 supplemented with 1 &mu;l/ml ITS solution and 20 &mu;l/ml penicillin&#x2010;streptomycin solution (5000 units/ml)</td>
</tr>
<tr>
<td>ITS solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 &#x03BC;l Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear
solution. Aliquots can be frozen.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tyrode</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Master mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5 &mu;l 10&#215;PCR&#x2010;Buffer, 5 &mu;l MgCl2 (25 mM), 2 &mu;l forward primer, 2 &mu;l reverse primer, 1 &mu;l dNTP&#180;s (10 mM each), 33 &mu;l H2O, 1 &mu;l DMSO, 1 &mu;l Taq&#x2010;DNA polymerase for each sample</td>
</tr>
<tr>
<td>LB&#x2010;Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Pac I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>R0547L</td>
<td>preparation: 50 &mu;g DNA, 5 &mu;l 10&#215;buffer, 0.5 &mu;l 100&#215;BSA,
0.75 &mu;l Pac I, fill with H2O up to final volume of 50&mu;l</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging

Yetişkin kalpleri izole kardiyak miyositler, yaygın bir model bir yere, bir tarafta, embriyonik ve neonatal kas hücreleri ve diğer çalışan bir kalp arasındaki yarım olarak kabul edilir. Böylece, kardiyomiyositlerde kardiyak hücre fizyolojisi ve patofizyolojisi için iyi bir model olarak hizmet, ilaç gibi araştırmalar için transgenik hayvan modellerinde keşif için. Burada kalp hücreleri izole bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca kardiyak miyositler bir genetik manipülasyon transgenik hayvan yetiştiriciliği olmadan nasıl yapılabilir: Bu uzun vadeli bir kültür kombinasyonu (1 hafta) ve adenoviral gen transferi. Ikinci bir virüs inşaat hücrelerinin transdüksiyon açıklanmıştır. Bu ifade için genetik olarak kodlanmış biyosensörler (GEBs), floresan füzyon proteinleri kullanılır, ama aynı zamanda ifade üzerinde protein ve düzenleme, örneğin RNAi kullanarak aşağı olabilir. Burada bir füzyon proteinin hücre içi yapısı (Golgi) boyama ifade için bir örnek sağlar. Böyle bir protein ekspresyonu, hücre içi yapıların bir 3D-yeniden inşası için z yığınlarının konfokal görüntüleme ile görüntülenebilir. Protokol, hücre kültürü, moleküler biyoloji ve biyofizik state-of-the-art oluşur ve böylece hücresel kardiyoloji yeni ufuklar keşfetmek için bir yaklaşım sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging at JoVE.com

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Yetişkin, kardiyak miyositler hayvan kalpleri izole edilebilir ve birkaç gün kültüre temel hücrelerdir. Bu kültür süre içinde adenoviral gen transferi, genetik olarak kodlanmış biyosensörler (GEBs) ya da floresan füzyon proteinleri ifade etmek için kullanılır. Her iki yaklaşım konfokal mikroskobi ile hücresel soruşturma izin verir.

Konfokal Görüntüleme İzolasyon ve Yetişkin kardiyak miyositler Genetik Manipülasyon

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

isolation-genetic-manipulation-adult-cardiac-myocytes-for-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K Görüntüleme.  Universty of Saarland. Yetişkin, kardiyak miyositler hayvan kalpleri izole edilebilir ve birkaç gün kültüre temel hücrelerdir. Bu kültür süre içinde adenoviral gen transferi, genetik olarak kodlanmış biyosensörler (GEBs) ya da floresan füzyon proteinleri ifade etmek için kullanılır. Her iki yaklaşım konfokal mikroskobi ile hücresel soruşturma izin verir.

Video: Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Yetişkin Sıçan Kalp miyositler İlköğretim Kültür

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Biyoloji

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Yetişkin Mouse Hipokampal dentat girus diseksiyonu

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

Ca aynı anda Ölçümler İnsan Atriyal miyositlerin izolasyonu<sup&gt; 2 +</sup&gt; Geçici ve Membran Akımlar

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

Görüntüleme Hücre Membran Hasarı ve Onarımı ilgilendim hücrealtı Süreçleri

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve<em&gt; In vitro</em&gt; Kalp hipertrofisi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

Yetişkin fareler ile Sinoatriyal Düğüm miyositlerin İzolasyonu, Kültür ve Fonksiyonel Karakterizasyonu Yöntemleri

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...