E14 veya E15 embriyosunun üzerindeki hava cebinin çevresi boyunca bir kalemle izlemek için bir yumurta mumcusu kullanın ve ana hatlarıyla belirtilen alanı şeffaf bantla örtün. Kavisli veya ince makas kullanarak, izlenen alanın etrafını yavaşça kesin. Embriyo zarını veya kan damarlarını kesmemeye dikkat edin.
Sonra kabuğun üst parçasını atın. Civciv embriyosunun kafasını kestikten sonra, kafayı soğuk, steril bir CMF çözeltisi ile 10 santimetrelik bir kaba yerleştirin. Steril ince forseps kullanarak, altta yatan dura mater ortaya çıkarmak için beyni kaplayan cildi soyun.
Beynin sol ve sağ taraflarındaki oluşan kafatası kemiklerini çıkarın. Oluşan kafatası kemikleri henüz beynin çoğunluğunu kapsamaz. Meninksleri yırtmak için nazikçe ince sivri forseps kullanın, beynin merkezini kaplayın ve beyni ortaya çıkarmak için her iki tarafa da soyun.
İnce kavisli forsepsler kullanarak, beyni alt önden yukarı doğru çekin ve yavaşça boşluğundan dışarı çekin. Beyni üç ana bölümüne ayırın: ön beyin, orta beyin veya optik tecta ve beyincik. İnce forseps kullanarak üstteki pia mater'i tecta'dan çıkarın ve disseke edilmiş beyin bölgelerini buz üzerinde küçük steril bir kaba yerleştirin.
Beyni gömmek ve dilimlemek için, optik tektum veya ön beyin bölgesini kavisli forsepslerle yavaşça bir kepçe olarak alın ve ekstra sıvıyı çıkarmak için steril gazlı bez üzerinde hafifçe lekeleyin. Uygun boyutta bir nesnenin etrafında alüminyum folyo oluşturarak basit bir kalıp hazırlayın. Burada nesne olarak küçük bir dikdörtgen metal titreşimli doku dilimleyici blok kullanılmıştır.
Steril bir transfer pipeti kullanın ve kalıbı düşük erimeli agarozla doldurun. Beyin bölgesini hızlı bir şekilde agaroza yerleştirin ve buz üzerinde yaklaşık dört ila beş dakika katılaşmasına izin verin. Safir bıçak kullanarak titreşimli bir doku dilimleyici üzerindeki bölümleri kesin.
Dilimi tepsiden almak ve çıkarmak için steril spatulayı kullanın. Bölümü yavaşça spatuladan ve başka bir steril spatula kullanarak bir membran kesici ucunun üzerine kaydırın. Beyin dilimlerinin altı kuyu plakasını, hücre kültürü inkübatöründeki membran eklerine 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte yerleştirin.
Kaplamadan sonraki gün, ortamı kesici ucun altından aspire etmek için steril bir Pasteur pipet kullanın ve membran kesici ucun altındaki her bir oyuğa bir mililitre taze dilim ortamı ekleyin. Daha sonra, GBM hücrelerini beyin dilimlerine tanıtmak için, beş mikrolitreye ayarlanmış 20 mikrolitrelik bir mikro pipet kullanarak kültür kabından bir ila birkaç sferoidi çıkarın. Medyayı sferoidlerle istenen beyin dilimine nazikçe atın ve sferoidlerin dilim üzerinde iki ila beş gün boyunca kültürlenmesine izin verin.
Kültürde bir hafta sonra x vivo optik tektum dilimlerinin canlılık sonuçları bu şekilde gösterilmiştir. Çekirdekler için bisbenzimid ile boyanmış ve laminin için immün boyanmış bir beyin diliminin konfokal görüntüleri, çeşitli konfigürasyonlarda optik olarak kesitlenmiş normal ve sağlam kan damarlarını açıkça göstermektedir. SOX 2 transkripsiyon faktörü ve bisbenzimid ile toplam çekirdekler için boyanmış beyin diliminin konfokal Z yığınının maksimum projeksiyon görüntüsü burada gösterilmiştir.
Bu sonuçlar, civciv embriyosu beyin dilimlerinin yaklaşık iki hafta boyunca membran ekleri üzerinde kültürlenebileceğini ve normal görünen kan damarları ve transkripsiyon faktörü ekspresyonu ile canlı kalabileceğini göstermektedir.
