Analyzing Protein Expression in Salidroside Treated MCF-7 Cells by Western Blotting

Altı oyuklu bir plakanın kuyucuklarına farklı ilaçlar içeren iki mililitre MCF-7 hücresi ekleyerek başlayın. Hücre kültürlerini 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 24 saat inkübe edin. Hücreleri, dört santigrat derecede üç dakika boyunca 560 x g'da santrifüjleme ile hasat edin.

Daha sonra hücreleri iki kez ön soğutmalı PBS ile yıkayın, yıkamalar arasında üç dakika boyunca 560 x g'da santrifüjleyin. Yıkanmış hücrelere 50 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve numuneyi 15 dakika boyunca bir buz banyosuna koyun. Daha sonra numuneyi dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 8.550 x g'de santrifüjleyin ve süpernatan protein örneğini toplayın.

Protein örneğini yükleme tamponu ile dörde bir oranında birleştirin. Daha sonra, karışımı metal bir banyoda 10 dakika boyunca 100 santigrat derecede denatüre edin. Ardından karışımı oda sıcaklığında soğutun.

Protein örneğini %10 SDS poliakrilamid jel elektroforezi kullanarak ayırın. Proteinleri 0.22 mikrometrelik bir PVDF membranına aktarın. Membranı %5 BSA ile bloke ettikten sonra, gece boyunca dört santigrat derecede karşılık gelen primer antikorlarla inkübe edin.

Ertesi gün, zarı iki saat boyunca 37 santigrat derecede keçi anti-tavşan IgG sekonder antikoru ile inkübe edin. Daha sonra bir ECL kemilüminesans çözeltisi kullanarak membranları geliştirin ve temassız bir kantitatif Western blot görüntüleme sistemi kullanarak görüntüleri yakalayın. Western blot, salidrosid tedavisinin pro-apoptotik faktörler CC-9, CC-7, CC-3, Bim ve Bax'ın protein ekspresyonunu arttırırken, anti-apoptotik BCL-2'nin protein ekspresyonunu inhibe ettiğini gösterdi.

Salidroside, p-PI3K'nın PI3K'ya ve p-AKT'nin AKT'ye oranlarını belirgin bir şekilde sınırladı. Bu arada, mTOR, HIF-1 alfa ve Fox01'in protein ekspresyonu da önemli ölçüde baskılandı.