Başlamak için, 24 oyuklu bir plakadaki bir kuyuya 500 mikrolitre ılık kültür jeli ekleyin. Fareden izole edilen disseke edilmiş bütün kesici dişleri hızlı bir şekilde kuyuya aktarın. Kesici dişleri durulamak için plakayı birkaç kez döndürün.
Bir kültür kabına 400 mikrolitre ılık kültür jeli ekleyin ve durulanmış kesici dişleri tabağa aktarın. Servikal halka bölgesini çanağın ortasına yerleştirmek için kesici dişi yönlendirin ve apikal kesici dişin eğimini istenen görüntüleme düzlemi için ayarlayın. Jel sertleştikten sonra, bir çift ince forseps kullanarak, ilgilenilen bölgenin üstündeki herhangi bir jeli çıkarın.
Numuneyi kaplamak için yemeğin kenarına yaklaşık 150 mikrolitre ılık kültür ortamı ekleyin. Dokunun yerleşmesine izin vermek için eksplant kültürünü 37 santigrat dereceye yerleştirin. Bir saat sonra mikroskobu ve iki fotonlu lazeri açın.
Kültür çanağını s'ye sabitleyintage adaptör ve profüzyon adaptör halkasını üstüne yerleştirin. Kültürü 37 santigrat derecede tutmak için s'yi bir sıcaklık kontrol cihazına bağlayın. Adaptör halkasının giriş ve çıkışını bir mikroprofüzyon pompasına bağlayın.
Bolluk hızını 20'ye ayarlayın ve ortamın bolluğunu numune üzerinde başlatın. Adaptör halkasının üzerine bir ACBR yerleştirin ve s'yi yükseltin.tage, objektif kültür ortamıyla temas etmek için ACBR'ye sığacak şekilde. GFP'yi görselleştirmek için lazer dalga boyunu 920 nanometreye çevirin.
Numuneyi bir göz merceği aracılığıyla bulduktan sonra, bir mikroskop yazılımıyla görselleştirin, ardından dört mikrometrelik Z adım boyutunu ve 14 saat boyunca beş dakikalık bir zaman aralığı ayarlayın. Zaman atlamalı görüntülemeyi başlatın ve sonraki dosyaları aşağı akış veri analizi için kaydedin. K14-Cre'nin hızlandırılmış mikroskobunda; R26-rtTA; tetO-H2B-GFP servikal loop, H2B-GFP sinyalleri ağırlıklı olarak servikal loopun trans-amplifiye edici bölgesinde gözlendi ve aktif hücre bölünmelerini gösterdi.
Ayrıca, mitotik hücrelerde metafaz plakasında kromozomların yoğunlaşması ve hizalanması, ardından anafaz sırasında ve iki yavru hücreye ayrışmaları gözlendi. Çoğu hücre bölünmesi, bazal membrana paralel daha az yatay bölünme ile bazal membrana göre dik veya eğik bir açıdaydı. Hücre bölünmesi olayları K14-Cre'de de belirgindi; Tüm epitel hücre zarlarının yeşil olarak etiketlendiği R26-mT / mG servikal döngüler.
Mitotik hücreler, hücre yuvarlaklaşması ve ardından sitokinez ile tanımlandı. K14-Cre'de; R26-mT/mG servikal döngüler, hem yatay hem de dikey hücre bölünmeleri de gözlendi.
