Primer hipokampal nöronların transfeksiyonundan iki gün sonra konfokal mikroskop kullanarak görüntülemeye hazırlanın. Canlı hücre odası ekini 60x subjektif ve lens yağını 37 santigrat dereceye ısıtın ve odayı %5 CO2'ye dengeleyin. Göz merceklerini kullanarak, kargo proteinini içeren kanaldaki transfekte nöronları tanımlayın.
Ardından, nöronları görüntülemek ve SCI-5 kanalının akson başlangıç segmentini tanımlamak için tara'ya tıklayın. Görüş alanını 32 x 128 piksellik dikdörtgen bir kutuya ayarlayın ve akson başlangıç segmentinin 50 ila 150 mikron distalindeki aksonun bir bölgesini görüntülemek için hareket ettirin. Kargo taşımacılığının yönünü ve yatırım getirisinin yönünü kaydedin, ardından dosya olarak kaydetmek için farklı kaydet'e basın.
Kutudaki noktaların sonraki görüntülerde üstte ve sağda görüneceğini unutmayın. Komagraf Çoklu Çizgisinin doğru yönlendirilmesini sağlamak için görüntünün hücre gövdesine en yakın tarafını ve akson terminaline en yakın tarafını kaydedin. 561 lazer gücünü 1.40'a, iğne deliğini 7.8'e, boyutu 128 piksel kareye ve hızı saniyede 32 kareye ayarlayın.
Arka plan sinyali tarafından engellenmeden tek tek kargo veziküllerinin taşınmasını görselleştirmek için kazancı ayarlayın. ROI açılır menüsünden dikdörtgen ROI çiz'i seçin ve ROI'yi tüm görüş alanını kaplayacak şekilde çizin. Ardından sağ tıklayın ve stimülasyon ROI S1 olarak kullan'ı seçin. Ardından ND kurulum sekmesinde, ön stimülasyon referans görüntüsünü toplamak için görüntü al'a tıklayın.
Ardından stimülasyonu ROI S1'e, gecikme olmayacak aralığa, 1,64 saniyelik süreye ve döngüleri yediye ayarlayın. Ardından, stimülasyon sonrası referans görüntüsünü toplamak için görüntü al'a tıklayın. Floresan kargonun ağartılmış yatırım getirisini yeniden doldurması için bir kurtarma süresi sağlamak üzere bekleme, alım yok, iki dakika'yı seçin.
Alım aralığını, gecikme yok, süreyi beş dakika, döngüleri, 8, 615'i seçin. ND kurulumu sekmesindeki stimülasyon ayarlarını uygula düğmesine ve ardından şimdi çalıştır'a tıklayın. Ayrıca analiz için iki nörondan taşıma videoları toplayın.
Görüş alanını tüm görüntüye sıfırlayın ve ardından ROI kutusu dahil olmak üzere 561 ve 647 kanallarında tam nöronun bir görüntüsünü toplayın. Protein ekspresyonunun fiksasyon sonrası teyidi için görüntünün çekildiği XY koordinatlarını kaydedin. Kargo proteini mAPL'nin Sinaptofizinini eksprese eden transfekte edilmiş bir nöronun canlı hücre görüntülemesi bu protokol kullanılarak gerçekleştirildi.
Akson başlangıç segmentindeki nöro fasin'in dış alanı da etiketlendi. Kargo taşımacılığının görüntülenmesi ilgilenilen aksonal bölgede gerçekleştirildi. Daha ileri görüntüleme sonrası immünofloresan analizi, tau proteini ve mAPL Sinaptofizin'in birlikte ekspresyonunu doğruladı.
