Escherichia coli BL21 DE3 hücrelerinin dönüşümüne başlamak için, 50 mikrolitre yetkin hücre süspansiyonu alikotunu buz üzerinde çözün. Yetkili hücre süspansiyonuna bir mikrolitre pET 28a Sumo TRF2 plazmid DNA'sı ekleyin ve süspansiyonu karıştırmak için tüpü hafifçe döndürün. Dönüşümden sonra, 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu mililitre kanamisin başına 50 mikrogram içeren bir luria bertani veya LB agar plakasına yayın.
Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, dönüştürülmüş hücrelerin bir kolonisini seçin ve mililitre kanamisin başına 50 mikrogram ile desteklenmiş beş mililitre LB ortamında kültürleyin. 37 santigrat derecede 18 saat inkübe edin, 220 RPM'de çalkalayın.
İnkübasyondan sonra, kültürü son konsantrasyon olarak bir milimolar IPTG ile indükleyin. Protein ekspresyonunu teşvik etmek için 20 santigrat derecede 17 saat inkübe edin. Ham protein ekstraktlarını, yükleme tamponu ile birlikte bir SDS-PAGE jeli üzerine yükleyin.
Numuneleri başlangıçta 30 dakika boyunca 100 voltta, ardından bir tris-glisin tamponunda 50 dakika boyunca 120 voltta çalıştırın. Ardından, protein ekspresyonunu görselleştirmek için Coomassie mavisi ile boyayın. Protein saflaştırması için, ham protein ekstraktını dört santigrat derecede 40 dakika boyunca 38.000 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtresinden süzün.
Filtrelenmiş süpernatanı, bağlama tamponundaki önceden dengelenmiş nikel sütununa yükleyin. Sütunu bağlayıcı tampon ile yıkayın ve proteini hazırlanan imidazol gradyanı ile elüte edin, her biri bir mililitrelik 12 fraksiyon toplayın. Depolama için konsantre ve tampon değişimli proteine% 50'lik bir nihai konsantrasyona gliserol ekleyin.
Escherichia coli'deki TRF2'nin ekspresyonu, indüksiyondan önce ve sonra TRF2'ye karşılık gelen farklı bantların ortaya çıktığı SDS-PAGE tarafından gösterildiği gibi başarılı bir şekilde gösterilmiştir.
