Başlamak için, üç dakika boyunca 1.000 g'da telomerik kısıtlama parçaları DNA'sı içeren yedi HeLa hücre hattının gücüne bir kez 10 santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 200 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. SDS proteinaz K ve sodyum klorür tedavisinden sonra, hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca 16.900 g'da santrifüjleyin.
Süpernatanı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve yüzen lipitlerden veya tortulardan kaçınarak eşit hacimde izopropanol ekleyin. Yüksek hızda santrifüjleyin ve peleti 500 mikrolitre% 70 etanol ile yıkayın. DNA peletini kuruttuktan sonra, 475 mikrolitre TE tamponunda dikkatlice yeniden süspanse edin ve tüpün altına hafifçe vurarak hafifçe karıştırın.
Şimdi, mililitre RNAsay başına 25 mikrolitre 10 miligram ekleyin ve pelet tamamen eriyene kadar tüpe hafifçe vurun. Daha sonra, 1/10 hacim üç molar sodyum asetat ve iki hacim soğuk %100 etanol ekleyin ve tüpü iki ila üç saat boyunca eksi 80 santigrat dereceye yerleştirin. Santrifüjleme ve% 70 etanol yıkamadan sonra, DNA peletine 100 mikrolitre TE tamponu ekleyin, karıştırmak için tüpe hafifçe vurun ve tamamen çözünmesi için iki saat boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin.
DNA sindirimi için, dört mikrogram genomik DNA'yı bir mikrolitre CviAII, iki mikrolitre 10X sindirim tamponu ve su ile birleştirerek toplam 20 mikrolitre hacme ulaşın. Karışımı 25 santigrat derecede 12 saat inkübe edin. Bir termal döngüleyicide, karışımı üç dakika boyunca 75 santigrat derecede ısıtın.
Ardından, 25 santigrat dereceye ulaşana kadar sıcaklığı her 30 saniyede bir 0,1 santigrat derece azaltın. Temizledikten ve kuruduktan sonra, alt kapak kızaklarını 20 mikrolitre %0,1 nitroselüloz ile kaplayın ve referans boncukları ekleyin. Kapak fişlerini 100 santigrat derecede dört dakika pişirin.
Akış hücreli sandviçi monte edin. Ve 85 santigrat derecede ısıttıktan sonra, Parafilm kanalı kapatana kadar düzeneğe masaj yapmak için iki çubukla masaj yapın. Bir mıknatıs kullanarak 10 mikrolitre M-270 boncuğu 50 mikrolitre çalışma tamponu ile beş kez yıkayın.
Yıkadıktan sonra, sindirilmiş genomik DNA'nın üzerine boncukları 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne ekleyin. Boncukları ve DNA örneğini karıştırmak için tüpü birkaç kez hafifçe vurun. Karışımı bir saat buz üzerinde bırakın.
İnkübasyondan sonra, karışımı 500 mikrolitre çalışma tamponu ile üç kez yıkayın ve boncukları yıkamalar arasında 10 dakikalık aralıklarla aşağı çekmek için bir mıknatıs kullanın. Numuneyi çalışan bir tamponda yeniden süspanse edin ve karışımın 30 mikrolitresini akış hücresine yükleyin. Bağlanmamış manyetik boncukları 30 dakika sonra yıkayın.
Akış hücresini objektif merceğin üzerine yerleştirdikten sonra, dikey konfigürasyonda düzenlenmiş bir çift beş milimetre kübik mıknatıs seçin ve görüntüleme için mıknatıs tutucuyu manyetik cımbızın ışık yolunun x ekseni ile hizalayın. Grafik programlama yazılımını başlatın ve manyetik cımbız için denetleyicileri bağlayın. Akış hücresinin altındaki bir referans boncuğu bulmak için görüş alanını ayarlayın ve referans boncuğu net kırılma halkaları gösterecek şekilde objektif merceğini hafifçe ayarlayın.
Kuvvet rampası tahlilleri için motor hareketlerini kontrol etmek için MATLAB'da bir komut dosyası yazın. Tek moleküllü deneyleri test etmek için komut dosyasını grafik programlama yazılımına aktarın. Yavaş bir akış hızında, akış hücresine 200 mikrolitre 10 nanomolar TRF1 yükleyin.
30 dakikalık bağlamadan sonra, saniyede artı/eksi bir piconewton kuvvet yükleme hızına sahip bir kuvvet rampası deneyi için bir komut dosyası seçin. Veri dosyalarını adlandırın ve denemeyi çalıştırın. Genomik DNA bütünlüğü, agaroz jel elektroforezi kullanılarak doğrulandı ve elde edilen TRS, çeşitli insan hücre dizileri boyunca tutarlı uzunluklar gösterdi.
TRS'deki telomerik tekrar dizileri, açık hibridizasyon sinyalleri gösteren güney lekeleme yoluyla tespit edildi. Kuvvet rampası tahlilinden elde edilen kuvvet uzatma eğrileri, gerilme sırasında zikzak desenler gösterdi ve bu da protein DNA etkileşimlerinin koptuğunu gösterdi. Telomerik DNA protein komplekslerinin ayrışma kinetiği, kuvvet ve ayrışma hızı arasında doğrusal bir ilişki gösterdi.
Ayrıca, insan hücrelerinden elde edilen telomerik DNA'nın uzunluk heterojenliği, çeşitli uzunluklardaki telomerlerdeki döngü oluşum mekanizmasını araştırır.
