Başlamak için, bitki dokusundan DNA'yı çıkarın ve DNA konsantrasyonunu belirleyin. Gerekli tüm bileşenleri 0,2 mililitrelik bir santrifüj tüpüne ekledikten sonra reaksiyonu ayarlayın. Primer amplifikasyonundan sonra, bir agaroz jelinin kuyucuklarına üç mikrolitre PCR ürünü ve iki mikrolitre 5.000 baz çifti DNA markörü yükleyin.
Voltajı 120 volta, akımı 400 miliampere ayarlayın ve elektroforezi 40 dakika boyunca çalıştırın. Jel sonuçlarını görüntülemek ve analiz etmek için çok yönlü bir jel görüntü analiz sistemi kullanın. Örneği bir sıralama biriminden geçirdikten sonra, Yeni Proje Oluştur'u seçin ve yazılım ana sayfasına gitmek için Tamam'a tıklayın.
Dosya menüsünde İçe Aktar ve Örnek Ekle'yi seçin. Dizi izleme formatı dosyasını seçin ve bunu, birleştirilmemiş örnekler altında işlenecek dosya olarak içe aktarın. Contig'i seçin.
Ardından Gelişmiş Montaj'a gidin ve Gruplar Halinde Birleştir'i seçin. Adları tanımlamanızı isteyen iletişim kutusu görüntülendiğinde, örnek adı parçalarını tanımla bölümünde dosya adını değiştirin ve hizalanmış sırayı görüntülemek için Birleştir'e tıklayın. Git'i seçin, ardından Arama Sırası'nı seçin ve eşleşen sırayı bulmak için Tamam'a tıklayın.
Contig'i seçin, ardından 5.8S ve 28S bölgelerini düşük kaliteli dizilerle birlikte kaldırmak için Sil'i seçin. Çıktıyı, eşleştirme için eklenmiş dizilerle dışa aktarın. NCBI'deki Nucleotide Database'i kullanarak bir BLAST araması seçin.
Global Farmakope Genom Veritabanına karşılık gelen tür tanımlama aracını ve spesifik astar ITS-2'yi seçin. NCBI'den bir dış grup olarak üç Angelica türünün ve bir Peucedanum praeruptorum türünün dizilerini indirin. Bu dizileri, elde edilen sonuç dizileriyle birlikte analiz edin.
Ardından Dosya'yı tıklayın. Dosyayı içe aktarmak için Dosya veya Oturum Aç'ı seçin ve bir iletişim kutusu görünecektir. Align'ı ve ardından DNA'yı seçin ve dizi karşılaştırması için Align by ClustalW'yi seçin.
Filogeniye gidin ve filogenetik bir ağaç oluşturmak için Komşu Birleştirme Ağacını Test Et'e tıklayın. Jel elektroforez sonuçları, AS1, AS2 ve AS3 numuneleri için yaklaşık 500 baz çifti civarında tek şeffaf bantlar gösterdi ve negatif kontrolde bant yoktu, bu da ekstrakte edilen DNA'nın başarılı bir şekilde amplifikasyonunu gösteriyor. Sıralama sonuçları, GPGD veritabanından elde edilen sonuçlarla eşleşen BLAST kullanılarak %100 dizi benzerliği ile Angelica sinensis'i tanımladı.
Filogenetik analizde, Angelica sinensis OR8797150.1 ile kümelenen ekleme dizileri, 100'lük bir önyükleme destek değeri ile Angelica sinensis olarak tanımlamayı kanıtladı.
