LRC-V. Bu çalışmada, sayıları bir öncelik her zaman öğrencilerin eğitim harika bir Profesör Dr. Adriel D. Johnson bellek adamak istiyor. Biz, Adriel sizi özledim. Biz bu çalışmada açıklanan deneyler ona yardım için Jacqueline Moreno minnettarız. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı, MCB-0615390 CY sağlanan hibe tarafından desteklenen ve LRC-V verilen start-up fonları tarafından. Huntsville Alabama Üniversitesi.

1. Hücre Ücretsiz Özü hazırlanması. <ol><li> İki pelet bakteriyel bir kuru Escherichia coli gram orta-log faz kültürler tampon yarım litre ile iki kez yıkanır elde edilen A içeren 10 mM Tris-asetat, pH 8.0, 14 mM magnezyum asetat, 60 mM potasyum asetat ve 50 mg 5000 X g de 5 dakika santrifüj 4 / ml phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) ° C Yıkadıktan sonra, bakteriyel pelet tampon A. 40 mL yeniden süspanse </li><li> Bakteri hücrelerinin 6000 psi basınç uygulayarak, bir Fransız Basın kullanarak etkileniriz. Bu basınç, 600 adet bir-inç piston kullanarak karşılık gelir. Kesintiye süspansiyon temiz bir cam tüp (50 ml) toplanır. </li><li> Kesintiye süspansiyon 1 mM dithiotreitol (DTT) ile tedavi edilir ve 30 dakika 30.000 xg&#39;de santrifüj. Meydana gelen supernatant kullanarak, santrifüj işlemi tekrarlanır. Son süpernatant mikrotüpler (1 ml) sürülür. Son olarak, alikotları, kuru buz-etanol karışımı veya sıvı nitrojen kullanılarak dondurulur ve -60 saklanır ° C veya -80 ° C </li></ol> 2. RF2, Tüketilmiş Hücre ayıklar hazırlanması. <ol><li> Protein A sepharose 4B bulamaç boncuk 4,5 ml 5 ml, bir saat, oda sıcaklığında dönen bir tekerlek kullanarak bir anti-RF2 anti-serum ile karıştırılır. Karışımı antiserum boncuklar ayrı xg 2500 santrifüj edilir. Süpernatantı atılması üzerine, anti-RF2 antikorları (anti-RF2 boncuk) içeren bu boncukları daha sonra 1 ml 35 mM içeren tampon B tabanda tarafından yıkanır Tris-asetat, pH 7.8, 10 mM magnezyum asetat, 30 mM amonyum asetat, 60 mM potasyum glutamat ve 5 mg / ml leupeptin proteinaz inhibitörüdür. Anti-RF2 boncuk sonra santrifüj kullanarak aynı koşullar yukarıda belirtilen tampon B ayrılır. Yıkama işlemi iki kez tekrarlanır. </li><li> Bir mL hücre özü 4, dönen bir tekerlek kullanarak anti-RF2 boncuk 150 mcL ile karıştırılır ° C, iki saat boyunca. Karışımı boncuklar hücre özü ayrı 10.000 xg&#39;de santrifüj edilir. Süpernatant 150 mcL başka bir anti-RF2 boncuk ile tekrar kaldırılır ve tedavi edilir. Bu prosedür ortaya çıkan hücre özü çözümü ile bir kez daha tekrarlanır. Son hücre ekstresi solüsyonu (100 mcL) mikrotüpler içine dağıtılır. Alikotları, kuru buz-etanol karışımı veya sıvı nitrojen ile dondurulur ve -60 saklanır ° C veya -80 ° C </li></ol> 3. DNA Şablon hazırlanması. <ol><li> Şekil 1, her dNTP 0.2 mikromolden ve 50 U belirtilen oligodeoxynucleotides her birinin 0.4 nanomol ile karıştırma 600 femtomoles dizileri tercüme içeren plazmid şablonu (Şekil 1) 1 ml PCR reaksiyon hazırlayın Taq- Stratagene A.Ş. tarafından verilen tampon DNA polimeraz amplifikasyon reaksiyon aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirin: 94 ° C, 2 dakika süreyle (94 ° C - 30 s, 55 ° C - 30 s, 72 ° C 1 dakika için; 30 siklus) ve 72 ° C 12 dak. </li><li> 1 / 10, 3 M sodyum asetat hacmi, pH 5.2 ve buz gibi soğuk etanol 2 cilt ekleyerek DNA presipite PCR ürünleri arındırın. Yağış prosedürü bir kez daha tekrarlayın. Dietil-pyrocarbonate (DEPC) tedavi su 100 mcL DNA tekrar Tipik olarak, bu yordamı 100 mikrogram 600 bp DNA ürün verir. </li><li> PCR ürünleri agaroz jel elektroforezi ile bütünlüğünü doğrulayın. </li></ol> 4. Biotin Etiketli mRNA hazırlanması. <ol><li> 5 mikrogram, ATP, CTP, GTP, UTP 0,3 mikromolden, biotin-16-UTP 50 nanomol, ve 10 mcL 0.5 mikromolden ile oluşturulan PCR-DNA parçasının karıştırma DEPC arıtılmış su in vitro transkripsiyon reaksiyon 100 mcL hazırlayın Promega A.Ş. tarafından verilen tampon T7 enzim karışımı reaksiyon karışımı 37 ° C&#39;de 3 saat. Elde edilen mRNA miktarını ölçmek için, DNA şablonu RNaz-ücretsiz DNaz ekleyerek ortadan kaldırılmalıdır. 37 ° reaksiyon ° C &#39;de 10 dakika inkübe edin. </li><li> 1 / 10 hacim 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ve 2 cilt soğuk etanol eklenerek RNA presipite mRNA ürünleri arındırın. Yağış prosedürü bir kez daha tekrarlayın. DEPC tedavi su 100 mcL mRNA tekrar Genellikle, 600 nt biotin 1-2 mg arasında bu usul verimleri mRNA ürün olarak nitelendirdi. </li><li> Biotin etiketli mRNA ürünleri agaroz jel elektroforezi ile bütünlüğünü doğrulayın. </li></ol> 5. Çeviri Ribozomlar İçeren Peptidil-tRNA izolasyonu. <ol><li> 75 nanomol her on dokuz amino asit-radyoaktif bir amino asit, amino asit dışında yerini olacağını 10-15 mikrogram biotin etiketli mRNA karıştırma DEPC arıtılmış su in vitro çeviri reaksiyon karışımı bir 500 mcL hazırlayın , radyoaktif bir amino asit (37MBq) μCi, 50 ve 20-5<html> 0, 40 mM Tris-asetat, pH 8.0, 10 mM magnezyum asetat, 175 mM potasyum asetat, 10 mM amonyum asetat, 2 mM DTT, 2 mM ATP, 0.5 içeren bir tampon reaksiyon karışımı RF2-tükenmiş hücre özü, mcL GTP mM, 30 mM fosfoenolpiruvat (KEP), 0.3 U / mL pirüvat kinaz (PK),% 3.5 polietilen glikol 8000, 1 mM spermidin, 20 mcg / mL folinik asit ve 250 mg / ml tRNA ( E.) coli. Reaksiyon karışımı 37 ° C&#39;de 10 dakika. Reaksiyon bileşenlerinin yanı sıra sırası çok önemlidir. Hücre özü, amino asitler ve ribozomların aktivasyon izin oda sıcaklığında 5 dakika inkübe son karışımı içeren tampon çözelti ile karıştırılmalıdır. Daha sonra, biotin etiketli mRNA&#39;ların eklenir. Kimyasal modifikasyonu prosedürleri kullanarak yapısal analizler için, radyoaktif bir amino asit eklenmesi gerekli değildir. </li><li> - Çeviri Reaksiyon karışımı içeren 35 mM Tris-asetat, pH 8.0, 10 mM magnezyum asetat, 175 mM potasyum asetat, 10 mM amonyum asetat ve 1 mM DTT tampon C askıya streptavidin paramanyetik boncuk (SMB), 3 mL ekle. Yeni süspansiyon oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. </li><li> Manyetik ayırma standları kullanarak bir manyetik alan (MF) uygulayarak karışımı SMB ayırın. </li><li> Tampon C SMB yeniden süspanse ve MF kullanarak tekrar boncuklar ayrı. Bu yıkama işlemi iki kez tekrarlayın. Tampon C 500 mcL boncuk süspanse edin, buz süspansiyon saklamak ve hemen sonraki yordamı gerçekleştirmek. </li></ol> 6. İzole Ribozomlar Peptidil-tRNA İçeren Analizi. Peptidil-tRNA için <ol><li> 50 mM Tris-HCl, pH 6.8,% 2.5 (v / v) gliserol,% 4 sodyum dodesil sülfat, 2 mM DTT ve 0.2 mg içeren bir yükleme tamponu 10 mcL SMB 10 mcL Mix (tampon C askıya) / ml Bromophenol Mavi. Örneklerin% 10 Tris-tricine poliakrilamid jeller çalıştırarak boncuklar bağlı bileşenleri giderin. </li><li> Jeller bir vakum jel kurutma makinesi ile kurutun. </li><li> X-ray film kurutulmuş jel açığa peptidil-tRNA bütünlüğünü ve saflaştırma olun. </li></ol> Ribozomal RNA <ol start="4"><li> DEPC arıtılmış su ile hazırlanan 2 mM ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solüsyonu 190 mcL ve 10 mcL boncuk süspansiyonu, su ile fenol dengelenmiş 200 mcL ekleyin. Dinç vorteks süspansiyon karıştırın ve oda sıcaklığında 3 dakika 10.000 xg&#39;de santrifüj organik faz inorganik faz ayrı. Yeni bir mikrotüp üst su tabakası toplayın. </li><li> 1 / 10 hacim 3 M sodyum asetat, pH 5.2, 20 mg / ml, glikojen çözüm ve buz gibi soğuk etanol 2 cilt 1 mcL ekleyerek su tabakası RNA çöktürün. RNA 10 mcL DEPC arıtılmış su tekrar </li><li> Agaroz jel elektroforezi ile ribozomal RNA&#39;lar bütünlüğünü doğrulayın. Genellikle, boncuk süspansiyon 50 mcL ribozomal RNA 1μg verir. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 2 özetlenen yordamı kullanarak izole tercüme ribozomların kalite ve işlevsellik değerlendirilmesi analizler bir dizi sonuçlarını göstermektedir. Poliakrilamid jeller çözülmesi eşsiz bir grup gözlem SMB (Şekil 2A) bağlı biotin etiketli mRNA&#39;ların bağlı polipeptidlerin varlığını gösterir. Bu yordamı kullanarak arıtma ribozomal RNA&#39;lar ribozomların yanı sıra, bu biotin etiketli mRNA&#39;ların bağlı (Şekil 2B) varlığı kurar. Puromycin Buna ek olarak, bir antibiyotik ribozom peptidil-transferaz aktivitesine yol, doğmakta olan peptidil tRNAs 1 bölünme. Bu bir değişim (Şekil 2C) poliakrilamid jeller izole polipeptid göç desen olarak görülmektedir. Birlikte, bu veriler SMB &#39;ye bağlı biotin etiketli mRNA&#39;ların peptidil-tRNAs ile fonksiyonel ribozomlar içerdiğini göstermektedir. Ribozom fonksiyonu (Şekil 3A), özel peptidil tRNAs içeren tercüme ribozomların izolasyon peptidil-tRNAs, antibiyotik ve diğer moleküllerin etkilerini çalışma izinleri, ribozom yapısı (Şekil 3B). Antibiyotik sparsomycin burada örnekler sundu ve amino asit olan triptofan (Trp) izole ribozomlar (Şekil 3A) RF2 doğmakta olan tnaC-tRNA peptidil-tRNA indüklenen hidrolitik bölünme inhibe. Ribozom sparsomycin veya Trp etkileşim de tercüme Ribozom (Şekil 3B) 23S rRNA oluşturan bazı nükleotidlerin yapısal değişikliklere neden olur. Özetle, prosedür kullanılarak elde edilen biyolojik materyalin moleküler çeşitli faktörler ile etkileşimi üzerine ribozom fonksiyonu inhibisyonu dahil yapısal temas ek anlayış elde edilmesinde yararlı Burada anlatılan. ove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 peptidil-tRNAs içeren tercüme ribozomlar üretmek ve arındırmak için kullanılır Usul. DNA parçalarının ca. Şekilde gösterildiği tnaC gen ve bitişik bölge, içeren, uzunluğu 650 bp, biotin, [(biyo) UMP] mRNA içeren mRNA&#39;ların hazırlanıyor şablon olarak kullanılır . Bu DNA parçalarının rakamın üstündeki belirtilen oligodeoxynucleotides kullanarak PCR prosedürleri ile üretilmektedir. Altı çizili harf nükleotid astar olarak kodlanmış T7 organizatörü yerini işaretleyin. Kalın harfler tnaC mRNA dizilerinin çeviri kullanılan Parlatıcı Dalgarno dizisi göstermektedir. DNA parçası T7 organizatörü tnaC sırası ve kodlama sırası downstream yazıya (ok) için kullanılır T7 RNA polimeraz tarafından kabul edilmektedir. RNA polimeraz rpoBC terminatör dizileri (rpoBC &quot;t&quot;) sonra, DNA parçasının 3&#39;-sonuna ulaştığında Transkripsiyon sonlandırıldı. RpoBC terminatör kök döngü yapısı, in vitro çeviri reaksiyonlarda kullanılan hücre ücretsiz özleri 3&#39;-5 &#39;exoribonuclease aktivite mevcut mRNA korur. Izole [(biyo) UMP] mRNA&#39;ların in vitro çeviri deneyleri kullanarak durdu, tercüme ribozomlar oluşturmak için kullanılır . TnaC dizisi [(biyo) UMP] mRNA reaksiyon karışımının Release Faktörü yokluğu (RF2) nedeniyle son amino asit dahil edildiğinde duraklarına bir ribozom tarafından tercüme edilir. Ribozom [(biyo) UMP] mRNA kompleksleri mRNA dahil biotin etiketli nükleotidler bağlayan streptavidin manyetik boncuk (SMB) kullanarak toplam reaksiyon karışımından izole edilmiştir. KOBİ&#39;ler bağlı ribozom-[(biyo) UMP] mRNA kompleksleri, bir manyetik alanı (MF) kullanarak toplam reaksiyon karışımı elde edilir. <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 izole komplekslerinin yapısal ve fonksiyonel analizleri. A) in vitro çeviri reaksiyonlar ile yapıldı [(biyo) UMP] mRNA&#39;ların tnaC genin başlangıç ​​kodon bir stop kodon tarafından değiştirildi. Nihai ürünler Şekil 1&#39;de belirtildiği gibi, streptavidin boncuk kullanılarak izole edildi. Reaksiyon ürünleri ve izole moleküller sonra poliakrilamid jeller elektroforezi ile analiz edildi. TnaC-tRNA ve tnaC peptid bantları işaretlenmiştir. B) Toplam RNA fenol çıkarma prosedürleri kullanarak durdu kompleksleri izole edilmiştir. Her izole RNA agaroz jel elektroforezi ile çözüldü. Ribozomal RNA (rRNA) gösterilir. C) tnaC-tRNAs içeren İzole kompleksleri ile (+) ya da inkübe edildi (-) 10 dakika oda sıcaklığında 0.02 mM puromycin (Puro). TnaC peptid [35S]-metionin (A) veya [3H]-prolin (B) kullanarak çeviri sırasında etiketli. <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 antibiyotik sparsomycin veya amino asit olan triptofan bağlı ribozomlar tnaC-tRNA içeren yapısal ve fonksiyonel analizleri. A) tnaC tRNAs içeren İzole kompleksleri ile (+) veya (olmadan inkübe edildi -) sparsomycin (Spar) veya 5 dakika süreyle oda sıcaklığında triptofan (Trp). Daha sonra, karışım RF2 ile karıştırılır ve 37 ° C&#39;de 20 dakika inkübe edildi. B) 23S rRNA metilasyon değişikliklerini analizi ribozom içinde bağlayıcı molekülleri tarafından uyarılan. İzole kompleksleri ile (+) ya da önceden inkübe edildi (-) 2 5 dakika boyunca 37 mM Trp veya Spar ° C Sonra bir alkilleme ajan, dimetil sülfat, eklenir ve karışım ilave bir 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi. Total RNA ekstrakte edildi ve astar uzantısı deneyleri [32P] değiştirilmiş nükleotid downstream 100 nükleotidler aralıklı 23S rRNA nükleotidler tamamlayıcı etiketli oligodeoxynucleotide ile yapıldı. Uzatma testlerinin son ürünleri poliakrilamid jel elektroforezi tarafından çözüldü. Trp veya Spar varlığı ile etkilenen 23S rRNA nükleotidler gösterilir.

<ol>
	<li>Cruz-Vera, L. R., Gong, M., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+produced+by+bound+tryptophan+in+the+ribosome+peptidyl+transferase+center+in+response+to+tnaC,+a+nascent+leader+peptide.">Changes produced by bound tryptophan in the ribosome peptidyl transferase center in response to tnaC, a nascent leader peptide.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 3598-3603 (2006).</li><li>Garza-Ramos, G., Xiong, L., Zhong, P., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+of+macrolide+antibiotics+on+the+ribosome:+new+resistance+mutation+identifies+a+specific+interaction+of+ketolides+with+rRNA.">Binding site of macrolide antibiotics on the ribosome: new resistance mutation identifies a specific interaction of ketolides with rRNA.</a> J. Bacteriol. 183, 6898-6907 (2001).</li><li>Gaynor, M., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrolide+antibiotics:+binding+site,+mechanism+of+action,+resistance.">Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action, resistance.</a> Curr. Top. Med. Chem. 3, 949-961 (2003).</li><li>Polacek, N., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosomal+peptidyl+transferase+center:+structure,+function,+evolution,+inhibition.">The ribosomal peptidyl transferase center: structure, function, evolution, inhibition.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 40, 285-311 (2005).</li><li>Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+functions+of+the+large+ribosomal+subunit,+a+major+antibiotic+target.">Structural insights into the functions of the large ribosomal subunit, a major antibiotic target.</a> Keio J. Med. 57, 1-14 (2008).</li><li>Tenson, T., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+the+ribosome.">Antibiotics and the ribosome.</a> Mol. Microbiol. 59, 1664-1677 (2006).</li><li>Xiong, L., Korkhin, Y., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+of+the+bridged+macrolides+in+the+Escherichia+coli+ribosome.">Binding site of the bridged macrolides in the Escherichia coli ribosome.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 281-288 (2005).</li><li>Child, S. J., Miller, M. K., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+by+an+upstream+open+reading+frame+in+the+HER-2/neu+transcript.">Translational control by an upstream open reading frame in the HER-2/neu transcript.</a> J. Biol. Chem. 274, 24335-24441 (1999).</li><li>Fang, P., Spevak, C. C., Wu, C., Sachs, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nascent+polypeptide+domain+that+can+regulate+translation+elongation.">A nascent polypeptide domain that can regulate translation elongation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 4059-4064 (2004).</li><li>Janzen, D. M., Frolova, L., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+translation+termination+mediated+by+an+interaction+of+eukaryotic+release+factor+1+with+a+nascent+peptidyl-tRNA.">Inhibition of translation termination mediated by an interaction of eukaryotic release factor 1 with a nascent peptidyl-tRNA.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 8562-8570 (2002).</li><li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate.">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li><li>Onouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+peptide-mediated+translation+elongation+arrest+coupled+with+mRNA+degradation+in+the+CGS1+gene+of+Arabidopsis.">Nascent peptide-mediated translation elongation arrest coupled with mRNA degradation in the CGS1 gene of Arabidopsis.</a> Genes Dev. 19, 1799-1810 (2005).</li><li>Raney, A., Law, G. L., Mize, G. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+translation+termination+at+the+upstream+open+reading+frame+in+s-adenosylmethionine+decarboxylase+mRNA.">Regulated translation termination at the upstream open reading frame in s-adenosylmethionine decarboxylase mRNA.</a> J. Biol. Chem. 277, 5988-5994 (2002).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Rajagopal, S., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+ribosome-peptidyl-tRNA+interactions+essential+for+tryptophan+induction+of+tna+operon+expression.">Features of ribosome-peptidyl-tRNA interactions essential for tryptophan induction of tna operon expression.</a> Mol. Cell. 19, 333-343 (2005).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Residues+Asp16+and+Pro24+of+tnaC-tRNAPro+Participate+in+Tryptophan+Induction+of+tna+Operon+Expression.">Conserved Residues Asp16 and Pro24 of tnaC-tRNAPro Participate in Tryptophan Induction of tna Operon Expression.</a> J. Bacteriol. 190, 4791-4797 (2008).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Yang, R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+inhibits+Proteus+vulgaris+tnaC+leader+peptide+elongation,+activating+tna+operon+expression.">Tryptophan inhibits Proteus vulgaris tnaC leader peptide elongation, activating tna operon expression.</a> J Bacteriol. 191, 7001-7006 (2009).</li><li>Cruz-Vera, L. R., New, A., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+features+essential+for+tna+operon+induction:+tryptophan+binding+at+the+peptidyl+transferase+center.">Ribosomal features essential for tna operon induction: tryptophan binding at the peptidyl transferase center.</a> J. Bacteriol. 189, 3140-3146 (2007).</li><li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Kinoshita, Y., Nishigaki, K., Husimi, Y. F. l. u. o. r. e. s. c. e. n. c. e. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=isotope-+or+biotin-labeling+of+the+5+'-end+of+single-stranded+DNA/RNA+using+T4+RNA+ligase.">isotope- or biotin-labeling of the 5 '-end of single-stranded DNA/RNA using T4 RNA ligase.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3747-3748 (1997).</li><li>Nishigaki, K., Taguchi, K., Kinoshita, Y., Aita, T., Husimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-ligation:+an+efficient+method+for+ligating+single-stranded+DNAs+and+RNAs+with+T4+RNA+ligase.">Y-ligation: an efficient method for ligating single-stranded DNAs and RNAs with T4 RNA ligase.</a> Mol Divers. 4, 187-190 (1998).</li></ol>

Bu raporda açıklanan Bu izolasyon prosedürü yeniden üretilebilir niteliktedir. Ne yazık ki, aynı tercüme dizileri üretilen kısa peptidil-tRNAs varlığı uygun kaçınılmalıdır; böyle peptidil-tRNAs toplam izole malzeme (Şekil 2C)% 15-20 oranında karşılık gelebilir. Bu kirleticiler, biotin etiketli mRNA yüksek konsantrasyonlarda kullanılan ya da kullanılan hücre özü, eski ya da birkaç kez tekrar edilmiştir konsantrasyon artırabilir. Bu nedenle, in vitro çeviri reaksiyonlarda bileşenleri kalite ve konsantrasyonunu kontrol etmek için çok önemlidir . Alternatif olarak, ticari yüksek verim sulandırılmış hücre özleri, aynı amaçlar (PURE sistemi) 18 için kullanılabilir mevcuttur . Bu yöntemi kullanarak, biotin-16-UMP rastgele hedef mRNA uzunluğu boyunca kurulmuştur. Üridin yolları içeren bazı Orfs kendi çeviri etkileyen, dizileri nükleotid değiştirilmiş dahil olabilir olasılığı vardır. Biotin-16-UTP/UTP değişken, göreceli konsantrasyonların mRNA sentezi sırasında en etkili çeviri elde etmek için test edilmesi gerekir. MRNA&#39;ların 5&#39;-sonunda, en istikrarlı sonuna hedefleyen, biotin etiketleme alternatif yöntemler kullanılabilir. (I) Biotin, 3&#39;-NH2ATP (3&#39;-amino, 3&#39;-deoksiadenozin trifosfat) ve T4 RNA ligaz 19 mRNA 5&#39;-end eklenebilir . (Ii) 5&#39;-biotin-etiketli oligonükleotid yanı sıra 20 T4 RNA ligaz kullanarak mRNA&#39;nın 5&#39;-sonuna kadar eklenebilir. (Iii) mRNA&#39;nın 5&#39;-sonunda tamamlayıcı dizisine karşılık 3&#39;-ucundaki biotin etiketli oligodeoxynucleotides tercüme kompleksleri da izole etmek için kullanılır olabilir. Bu biotin etiketli oligodeoxynucleotides izolasyon önce SMB bağlı olabilir. Daha sonra onların tamamlayıcı mRNA dizileri ile etkileşime olanak çeviri reaksiyon karışımı ile SMB karışık olabilir biotin etiketli oligodeoxynucleotides bağlı. Izolasyondan sonra melez RNA-DNA bölge ve bölge biotin etiketli oligodeoxynucleotide ve mRNA dizisi arasındaki literatürde - RNAse H kullanarak bozulmuş olabilir, streptavidin boncuk durdu kompleksleri ayıran. Bu alternatif yöntem, kompleksleri, yüksek çözünürlüklü yöntemler kullanılarak geleceğe yönelik yapısal analizlerde istihdam edilmek üzere izin verebilir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tris base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>252859</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>63049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium glutamate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>09688</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7626</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein A sepharose 4B slurry beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P9424</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leupeptin inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L9783</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Taq-DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stratagene</td>
<td>201223</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 Maxiprep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>P1300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin-16-UTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>1388908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ATP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyethylenglycol 8000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>81268</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Folinic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>47612</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>85558</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>tRNA from E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DEPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T5816</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>LAA21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>43815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>magnetic separation stands</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5342</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of translating ribosomes containing peptidyl-trnas for functional and structural analyses

Son zamanlarda, yapısal ve biyokimyasal çalışmalarda birçok ribozom antibiyotikler ile protein sentezi inhibisyonu sırasında ve doğmakta olan polipeptid sentezi sırasında meydana gelen moleküler olayların detaylı var. Bazı antibiyotikler, ve çoğunlukla peptidil-tRNAs formu düzenleyici doğmakta olan polipeptidlerin, peptid bağı oluşumu veya çeviri fesih 1-7 inhibe ederler. Bu inhibitör olaylar ribozom hareketi durdurmak, bir fenomen &quot;translasyon tutuklama&quot; olarak nitelendirdi. Bir antibiyotik ya da olgunlaşmamış bir polipeptid ya indüklenen Çeviri tutuklanması, hücre büyümesi, antibiyotik direnci, protein translokasyon ve hücre metabolizması 8-13 gibi çeşitli hücresel fonksiyonları yer alan genlerin ifade düzenleyen gösterilmiştir. Biz her organizma çeviri ribozom tam rolü, anlamak istiyorsak, antibiyotik ve düzenleyici doğmakta olan polipeptidlerin ribozom fonksiyonu nasıl değiştirdiğini Bilgi esastır. Burada, biz, sadece arındırmak analiz için, bu ribozom belirli bir mRNA&#39;nın çeviri ve belirli bir peptidil-tRNA 14 içeren kullanılan basit bir metodoloji açıklanmaktadır. Bu prosedür, biotin etiketli mRNA bağlı ribozomlar tercüme selektif izolasyon dayanmaktadır. Bu translasyonel kompleksleri streptavidin paramanyetik boncuk (SMB) ve (MF) bir manyetik alan kullanarak, aynı karışımı diğer ribozom ayrılır. Biotin-etiketli mRNA&#39;ların T7 transkripsiyonel rehberleri içeren şablonları PCR oluşturulan DNA parçaları kullanarak run-off transkripsiyon analizleri ile birleşiyor. T7 RNA polimeraz biotin UTP biotin-16-UMP içeriyor; koşullar altında yaklaşık on biotin-16-UMP moleküllerinin% 25 UMP içeriği ile 600 nt mRNA dahil edilmiştir. Bu biotin etiketli mRNA&#39;ların sonra izole ve serbest faktör 2 (RF2) ile yapılan in vitro çeviri deneylerde kullanılan tükenmiş yabani türü veya mutant ribozom içeren Escherichia coli suşlarının elde edilen hücre özleri. Biotin etiketli mRNA dizileri çevirirken Ribozomlar, normalde çeviri fesih gerçekleştirir RF2 protein, olmaması nedeniyle, stop kodon bölgedeki sekteye uğruyor. Yeni sentezlenmiş peptidil-tRNA içeren durdu ribozomlar izole ve SMB ve MF kullanarak çeviri reaksiyonlar kaldırılır. Bu boncuklar sadece biotin içeren mesajlar bağlanır. Izole, translasyonel kompleksleri, vahşi tip ya da mutant ribozomal bileşenleri, veya peptidil-tRNA dizilerinin yanı sıra, antibiyotik veya diğer moleküler faktörler 1,14-16 ribozom etkileşim belirleyen yapısal ve fonksiyonel özelliklerini analiz etmek için kullanılabilir. Bu izole ribozom kompleksleri fonksiyonunu incelemek için, peptidil transferaz deneyleri, antibiyotik puromycin 1 varlığında yapılabilir . Translasyonel komplekslerinin yapısal değişiklikleri incelemek için, iyi kurulmuş prosedürler belirli amino asitleri 14 ve / veya ii) alkilleme koruma deneyleri 1,14,17) i olarak, crosslinking kullanılan olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses at JoVE.com

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Doğmakta olan peptidil-tRNAs içeren ribozomların biyokimyasal analizler için büyük bir engel, aynı örneklerde diğer ribozom varlığı olmuştur analiz edilen spesifik mRNA dizisinin çevirisinde yer almayan ribozomlar. Biz sadece ilgi doğmakta olan peptidil-tRNA içeren ribozomlar arındırmak için basit bir yöntem geliştirdi.

Fonksiyonel ve Yapısal Analizler için Peptidil tRNAs İçeren Çeviri Ribozomlar izolasyonu

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

isolation-translating-ribosomes-containing-peptidyl-trnas-for

Research

JoVE Journal

Biology

19.7K Görüntüleme.  University of Alabama Huntsville. Doğmakta olan peptidil-tRNAs içeren ribozomların biyokimyasal analizler için büyük bir engel, aynı örneklerde diğer ribozom varlığı olmuştur analiz edilen spesifik mRNA dizisinin çevirisinde yer almayan ribozomlar. Biz sadece ilgi doğmakta olan peptidil-tRNA içeren ribozomlar arındırmak için basit bir yöntem geliştirdi.

Video: Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Biyoloji

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Proteomik Analizleri Fare Vitreus ve Retina eviserasyon

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

RNA İçeren Exosomes İzolasyonu ve Karakterizasyonu

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Yüksek Aktif Maya Ribozomlar Kromatografik Arıtma

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.