MKW bir tarafından desteklenen ise WPS Ulusal Sağlık Enstitüleri (CA129359), Cure Vakfı (BCTR0706967), Savunma Bakanlığı (BC084561) ve Seidman Kanser Merkezi için Susan G. Komen, hibe tarafından kısmen desteklenmiştir Amerikan Kanser Derneği (PF-09-120-01) den burs. Bu iş için ek destek Görüntüleme Araştırma Vaka Merkezi, Olgu Kapsamlı Kanser Merkezi (P30 CA43703) ve Kistik Fibrozis Merkezi (P30 DK027651) tarafından sağlandı.

1. CMV-Driven Renilla Lusiferaz Kararlı Anlatım <ol><li> Istikrarlı bir klonal nüfus Transfeksiyon ve seçimi bu Renilla lusiferaz muhabir ifade için tercih edilen yöntemdir. Bu yaklaşım, ek ikincil muhabiri yapıları (örn., ateşböceği lusiferaz veya floresan proteinleri) müteakip açıklanması sonrasında, daha tutarlı ve düzgün Renilla lusiferaz ifadesi verir. </li><li> Bu tür pcDNA3.1-rutubet ya da başka bir plasmid barındıran bir seçilebilir işaretleyici olarak ifade vektörü Renilla lusiferaz kodlama ile ilgi habis hücreleri transfekte. </li><li> Transfeksiyon takiben sonradan bireysel ve pasaj izole bireysel koloniler, üzerindeki izolasyonu kolaylaştırmak için gün-to-hafta birkaç için optimize edilmiş bir antibiyotik konsantrasyonu altında transfektanları yerleştirin. </li><li> Renilla ifade ölçüde izlemek için ≥ 10 bireysel Renilla lusiferaz ifade koloniler seçin. </li><liRenilla lusiferaz yüksek miktarda eksprese&gt; Kolonileri sonradan işlevsel tabi onların ebeveyn meslektaşları (i) patofizyolojik özellikleri korunur emin olmak için analiz, ve (ii) Renilla ifade değerleri sapma ya da zaman içinde değişmez. Bu adımlar klonal varyantları / sapkınlar yalıtma ve eğitim kaçınmak ve genom içine Renilla yapısının uygun entegrasyon doğrulamak için kesinlikle gereklidir. </li><li> Bir kararlı transfectant izole edilir ve doğrulandıktan sonra, bir selektif basınç kaldırmak ve Renilla lusiferaz ifadesi, in vitro ve in vivo hem de uzun uzunluklar üzerinde sabit kalır emin olun. </li></ol> 2. İfade, Seçim ve indüklenebilir Promoter-Driven Firefly Lusiferaz Fonksiyonel Doğrulama <ol><li> (Örneğin, pur, seçilebilir bir işaretleyici barındıran bir plazmid pGL4-lusiferaz raportör içine ilgi promotörü Subclonekararlı Renilla ifadesi (örneğin, higromisin) için seçmek için kullanılan farklı olduğu omycin). </li><li> Adım I de olduğu gibi habis hücrelerin transfekte, ve daha sonra ateş böceği lusiferaz-salgılayan hücrelerin bir kararlı poliklonal nüfus için seçmek. Bir rapor gen genom içine entegre konumu, ifade ve düzenleme üzerinde hatalı etkisi oluşturabilmek Çünkü, güçlü, (i) muhabiri gen ekspresyonu sağlamak için klonal popülasyonları aksine ateşböceği lusiferaz-salgılayan hücrelerin poliklonal popülasyonlar için seçmeniz önerilir daha doğru ebeveyn hücrelerde endojen gen yansıtır ve (ii) gen ekspresyonu üzerindeki etkileri entegrasyonu heterojen hücre popülasyonu arasında ortalama ve azalır. </li><li> Stabil Renilla ve ateş böceği luciferases her ikisi de ifade etmek için tasarlanan malign hücreler toplu olarak ikili biyolüminesens raportör hücre veya DBR hücreler olarak ifade edilir. </li><li> Geleneksel kullanımı &lt;em&gt; in vitro hücre tabanlı lusiferaz muhabiri gen deneylerinde, DBR hücreleri ateşböceği lusiferaz ifade düzenleyen doğrulamak, olumlu veya olumsuz, geçici bu vektörler ile transfekte ebeveyn hücrelerinde gözlenen ile uyumlu bir şekilde. Aynı şekilde, Renilla arasında CMV güdümlü ifadesi çeşitli hücre stimülasyonu veya tedavi koşulları tarafından düzenlenir olmadığını doğrulayın. </li><li> 24-kuyucuğu, bu yüzden kültür DBR ve ebeveyn hücreler yapmak için, ve CMV-Renilla orijinal ve promotor-böceği ile sonradan geçici ko-transfekte ebeveyn hücreler DBR hücreleri oluşturmak için kullanılır oluşturur. </li><li> Daha sonra, DBR ve faiz organizatörü düzenleyen ve daha sonra ateş böceği ve Promega Çift Lusiferaz Assay Kit kullanarak Renilla lüminesans ölçmek için bilinen risk faktörleri ya da farmakolojik ajanlar ile transfekte ebeveyn hücreler tedavi. </li></ol> 3. 4T1 Primer Meme Tümörleri Kurulması <ol><li> Metastatik meme karsinomu 4T1 hücreleri kieksikliği adventisyal kemirgen patojenlere bulundu yeniden stabil bir CMV-güdümlü Renilla lusiferaz (pcDNA3.1-CMV-Renilla lusiferaz-rutubet) ve SBE-güdümlü ateşböceği lusiferaz (pGL4.2-SBE-ateşböceği lusiferaz-puro) olarak ifade geliştirilmişti Yukarıda açıklandığı gibi. Öncelikle akciğer içinde kendiliğinden metastaz oluşumu, bu meme kanseri hücrelerinin sonuç Ortotopik melezleşmesi. </li><li> 4T1 hücreleri, geleneksel 2 boyutlu doku kültürü sistemlerinde bunların yayılması sırasında izdiham ulaşmak için izin verilmemelidir, ve onların in vivo aşılama önceki gün pasajlanmağa edilmelidir. </li><li> 4T1 hücreleri tripsinizasyonla ile ayrılamaz, büyüme ortamı içinde iyice yıkandı ve 2x10-5 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon ile PBS içinde seyreltilmiş ve hemen buz üzerinde saklanır gerekir. </li><li> Erkek Balb / c farelerinin (4-6 haftalık) izofluran ve% 1 izofluran bir dozda anestezi altında tutulan% 3 arasında bir indüksiyon dozu ile anestetize olmalıdır. Ile silmeli enjeksiyon yerinde hazırlayın% 70 izopropil alkol. Bir forseps kullanarak, hafifçe kavrayın ve 4. inguinal meme pedi çıkarın. Dikkatlice, 27,5 iğne konik tarafı yukarı yerleştirin ve karın boşluğuna iğne itmeyin özel bakımı, doğrudan meme altındaki meme yağ yastığı içine enjekte edilir. Bezi bırakın ve yavaşça meme yağ yastığı içine hücre süspansiyonu (1x10 4 hücreleri) 50 ul enjekte. </li></ol> 4. İlk Çift Luminescent Görüntüleme <ol><li> Hemen memenin yağlı pedine üzerine 4T1 hücreleri engrafting ve sonra fareler henüz anestezi iken, yanal kuyruk damarı içine RediJect Coelenterazine 100 ul enjekte edilir. Bu hayvan tarafından tolere satıcı ve en iyi tarafından önerilen optimum substrat konsantrasyonu. </li><li> Hemen IVIS-200 görüntüleme sistemi içinde izofluran burun konisi içine fare koyun ve 0.5-1 dakikalık parlak görüntü elde. Enjeksiyon ve görüntü elde etme arasındaki Verimlilik sinyali olarak, çok önemlidirRenilla lusiferaz için precipitously düşer ~ 30 saniye enjeksiyon sonrası. Onun kafesine geri fare yerleştirin ve herhangi bir kalıntı Renilla lusiferaz sinyal harcanmış olduğunu ve fare tam anestezi kurtarıldı sağlar ≥ 1 saat için kurtarmak için izin verir. </li><li> IP enjeksiyon yoluyla 150 mg / D-luciferase potasyum tuzu kg Yönet ve 5 dakika bekleyin. Bu, test hayvanları içine enjeksiyondan sonra 5-15 dakika boyunca sabit bir lüminesan sinyali sağlar D-lusiferin, en uygun konsantrasyon. Isoflourane kullanılarak fare anestezisi ve IVIS-200 yerine, özgün Renilla edinimi için göreli bir çok benzer bir konumda konumlandırmak için hayvan bakımı. Bu firefly sinyalin genel yoğunluk ilgi promotör aktivitesi bağlıdır, ve gibi, görselleştirme ateşböceği lusiferaz aktivitesini uzun edinme süreleri gerektirebilir. </li><li> &quot;Fotonlar&quot; moduna IVIS Yaşayan Image yazılımı kullanarak, valu oluşturmakRenilla ve bazal bağıl ışıma oranları (RLR) kurmak için bir araç olarak ateşböceği devralmalar hem es. </li></ol> 5. Boyuna Luminescent Görüntüleme <ol><li> 4T1 hücreleri son derece agresif, 1x10 4 hücre şekilde aşılama genellikle 1 hafta içinde palpabl tümör oluşumuna yol açar, ve 4-5 hafta içinde hayvan ölümcül için. 4T1 tümörleri haftada 4 içsel bir eğilim ülser var. Ülsere tümör büyümesi ve bakımı ayrı IACUC onaylanması gerekebilir. Burada gösterilen 4T1 tümör çalışmaları Case Western Reserve Üniversitesi&#39;nde IACUC tarafından onaylanmıştır. </li><li> Yukarıda tarif edildiği gibi, genel olarak farelerde tümör büyümesini ve metastazı kontrol etmek, hem de D-lusiferin ile olduğu gibi tümör gelişiminin çeşitli aşamalarında özel sinyalleme yolunun izlenmesi için RediJect Coelenterazine ile haftalık enjekte edilmelidir. Renilla lusiferaz sinyal tamamen alımı öncesinde buharlaşıncaya sağlamak için her zaman özenfirefly lusiferaz sinyal. </li><li> 4T1 tümörleri geliştirmek ve ilerleme olarak, Renilla lusiferaz devralmalar primer tümörün büyümesi normalleştirmek ve izlemek için bir araç olarak tümör hücre inokülasyon sırasında ölçülen başlangıç ​​Renilla değerleri normalize edilmelidir. Daha da önemlisi, zamanla RLR değerlerini hesaplama tümör büyümesi ve ilerlemesi göreli bireysel sinyalizasyon sistemlerin zamansal düzenleme kuracak. </li><li> Aşikar pulmoner metastaz meme yağ yastığı üzerine 4T1 hücre uyumunu takip eden 3-4 hafta içinde belirgin hale gelir. Primer tümör için hesaplanan sonuçlarla karşı pulmoner RLR değerleri karşılaştırarak tümör büyümesi ve metastaz oranla bireysel sinyalizasyon sistemlerin mekansal düzenlemesi kurar. </li></ol> 6. Tek Hayvan İki Benzersiz Hücre Tipleri Çift Bioluminescent Görüntüleme <ol><li> Yukarıda açıklandığı gibi stabil ifade CMV odaklı Renilla lusiferaz için Mühendisi biri meme kanseri hücre hattı. Bu işlemi tekrarlayınİkinci belirgin meme kanseri hücre hattında CMV odaklı ateşböceği lusiferaz kullanarak mühendislik süreci. </li><li> Bu yazıda karışık Renilla lusiferaz ifade onların nonmetastatik ve izogenik ateşböceği lusiferaz eksprese 4T07 meslektaşları 10, 11 ile 4T1 hücreleri. Bu karma meme kanseri hücre popülasyonlarının farklı oranlarda daha sonra yukarıda tarif edildiği gibi memenin yağlı pedine içine enjekte edilir. </li><li> Derhal verilen inoküle hücre karışımı ilk RLRs temsilcisi kurmak böceği ve Renilla lusiferaz görüntüleri hem kazanır. </li><li> Uzunlamasına çift biyolüminesans görüntüleme görselleştirmek ve ana tümör içerisinde hücresel bileşiminde değişiklikler yanı sıra, tümör büyümesi ve ilerlemesi için göreli her meme kanseri türevi zamanmekansal metastaz takip edecektir. </li><li> Alternatif olarak, bireysel meme kanseri hücre popülasyonlarının (sağ ve sol karın meme yağ yastıkları gibi) fare farklı yerlerde inoküle edilebilirsistemik etkileri değerlendirmek için bu iki popülasyonun tümör büyümesi ve metastaz çeşitli aşamalarında birbiri üzerinde sergileyecek. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: Çift bioluminescent görüntüleme büyük bir gücü her görüntü tutarlı ve kontrollü bir önemli ölçüt olarak primer tümörün fonksiyonu türetilmiştir sürekli sinyaller her Renilla ve ateşböceği iktisap genel başarı veya başarısızlık ölçmek için böyle olduğu gerçeği yatıyor. Görüntüleme prosedürü bu yönü Coelenterazine substrat oksidasyonu son derece duyarlıdır Renilla lusiferaz, faaliyetinin satın almalar sırasında özellikle önemli olduğu oto-ışıldama yeteneği ile sonuçlanır. Şekil 1A hemen bağırsak değil, köklü primer tümörün türetilen nonspesifik Işıklı sinyaller olarak tezahür Bu yan etki, bir örnek gösterilmektedir. Genelde, bu nonspesifik Coelenterazine transpir sinyalleriE Aşağıdaki bu Renilla lusiferaz substrat intravenöz enjeksiyonlar başarısız oldu. Ancak, bir kez sağlam primer tümör kaynaklı Renilla sinyalleri (Şekil 1B, sol görüntü) elde edilmiştir, kimin D-luciferase görüntüleme ateşböceği lusiferaz (Şekil 1B, sağ panel), türetilen yolak spesifik sinyal ölçümleri yakalayan devam etmek güvenlidir substrat IP enjeksiyonu üzerine son derece istikrarlı ve arka plan otomatik lüminesans önemsiz düzeylerde üretmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3245/3245fig1.jpg" /> Şekil 1. Renilla ve bağırsak nonspesifik sinyal sonuçlanan Coelenterazine başarısız bir IV enjeksiyon böceği-türetilmiş vivo RLRs yılında hesaplamak için bioluminescent görüntüleri. (A) Bir örnek alınıyor. Çember ve PT primer tümörün yaklaşık konumunu gösterir. (B) bir fare başarılı Renilla edinimi bir 4T1 primer tümör ve p taşıyanulmonary metastaz (sol panel; yağ yastığı engraftman sonra 4wk). İlgili ateşböceği edinimi primer tümörü ve akciğer metastazları hem RLRs hesaplamak için izin verir. Panel B gösterilmiştir fareler (n = 4) hesaplanan (C) primer tümörün grafiksel gösterimi ve pulmoner metastazı RLRs.

<ol>
	<li>Wetterwald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cancer+metastasis+to+bone+marrow:+a+mouse+model+of+minimal+residual+disease.">Optical imaging of cancer metastasis to bone marrow: a mouse model of minimal residual disease.</a> Am. J. Pathol. 160, 1143-1153 (2002).</li><li>Wendt, M. K., Drury, L. J., Vongsa, R. A., Dwinell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+CXCL12+Expression+Induces+Anoikis+in+Colorectal+Carcinoma+Cells.">Constitutive CXCL12 Expression Induces Anoikis in Colorectal Carcinoma Cells.</a> Gastroenterology. 135, 508-508 (2008).</li><li>Wendt, M., Schiemann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+the+focal+adhesion+complex+prevents+oncogenic+TGF-beta+signaling+and+metastasis.">Therapeutic targeting of the focal adhesion complex prevents oncogenic TGF-beta signaling and metastasis.</a> Breast Cancer Research. 11, R68-R68 (2009).</li><li>Korpal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transforming+growth+factor-beta+signaling+dynamics+and+therapeutic+response+in+breast+cancer+bone+metastasis.">Imaging transforming growth factor-beta signaling dynamics and therapeutic response in breast cancer bone metastasis.</a> Nat Med. , (2009).</li><li>Giampieri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+and+reversible+TGFbeta+signalling+switches+breast+cancer+cells+from+cohesive+to+single+cell+motility.">Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility.</a> Nat Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).</li><li>Giampieri, S., Pinner, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+illuminates+transforming+growth+factor+beta+signaling+switches+during+metastasis.">Intravital imaging illuminates transforming growth factor beta signaling switches during metastasis.</a> Cancer Res. 70, 3435-3439 (2010).</li><li>DeNardo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+T+cells+regulate+pulmonary+metastasis+of+mammary+carcinomas+by+enhancing+protumor+properties+of+macrophages.">CD4(+) T cells regulate pulmonary metastasis of mammary carcinomas by enhancing protumor properties of macrophages.</a> Cancer Cell. 16, 91-102 (2009).</li><li>Wyckoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Paracrine+Loop+between+Tumor+Cells+and+Macrophages+Is+Required+for+Tumor+Cell+Migration+in+Mammary+Tumors.">A Paracrine Loop between Tumor Cells and Macrophages Is Required for Tumor Cell Migration in Mammary Tumors.</a> Cancer Res. 64, 7022-7029 (2004).</li><li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+self-seeding+by+circulating+cancer+cells.">Tumor self-seeding by circulating cancer cells.</a> Cell. 139, 1315-1326 (2009).</li><li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor.">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).</li><li>Wendt, M. K., Smith, J. A., Schiemann, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta-induced+epithelial-mesenchymal+transition+facilitates+epidermal+growth+factor-dependent+breast+cancer+progression.">Transforming growth factor-beta-induced epithelial-mesenchymal transition facilitates epidermal growth factor-dependent breast cancer progression.</a> Oncogene. 29, 6485-6498 (2010).</li><li>Hawkins, E., Unch, J., Murhpy, N., Vidugiriene, J., Scurria, M., Klaubert, D., Wood, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+Light,+No+Lysis.">Bright Light, No Lysis.</a> Measuring Renilla Luciferase Luminescence in Living Cells. , (2005).</li><li>Roncali, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+device+for+real-time+bioluminescence+imaging+in+moving+rodents.">New device for real-time bioluminescence imaging in moving rodents.</a> J. Biomed. Opt. 13, 054035-054035 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bioluminescent görüntüleme tekniklerinin mutlak güç Burada agresif 4T1 meme kanseri hücrelerinin kullanımı dahil karmaşık uzunlamasına çalışmalar, tümör büyümesi ve metastaz ölçmek için kendi yeteneği yatıyor. Bu işlemler hem lusiferaz muhabiri yapıları stabil entegrasyonu dayandıklarından bu teknikleri kolaylıkla adapte ve tümör latans ve metastatik yetenekleri değişen diğer kanser hücre hatları tercüme edilebilir. Burada gösterilen sonuçlar benzer şekilde, yavaş primer tümörleri ve onların nihai metastaz gelişmekte olan belirli RLRs hesaplanmasında gecikme sürelerine bakılmaksızın tümörlerin metastatik ilerlemesi esnasında sızmak belirli sinyal olayların gerçek zamanlı zamanmekansal tanımlama sağlar. Spesifik promotor düzenleyici olayların belirlenmesi üzerine, bunun tüketim primer tümör ve metastatik lezyonların standart immunohistokimyasal icrasında ve differentia hem önemlidirl gen ekspresyonunu analiz endojen genin ve / veya protein benzer düzenleme doğrulamak için. Teknik olarak ikili bioluminescent analizlerin birincil sorun Renilla lusiferaz sinyalleri nispeten kısa süre içinde yatıyor, konuşma. Bu nedenle, bu görüntüleme tekniği kuyruk damarından enjeksiyon işleminin önemli bir iyileştirme, aynı zamanda ayrı ayrı enjekte edilen hayvanların hemen görüntüleme, zaman görüntüleme ateş böceği lusiferaz için alıcı ve biraz verimsiz göreceli olan bir işlem gerektirir. Son zamanlarda, Promega oksidasyon siteleri molekülü hızla de-esterifiye hangi noktada hücreler içine bu molekülün kazandığı girinceye kadar esterleşme tarafından engellenen bir ikinci nesil lusiferaz substratı temsil &quot;Viviren,&quot; tanıtıldı. Topluca, bu roman substrat etkili Renilla bağlı oto-lüminesans 12 akuple otomatik ışıldama ve nonspesifik modifikasyonu ve / veya bozulması düşürür. Bunu yaparken, bu yeni renillBir lusiferaz substratı parlak ışıltılı sinyalleri üretir, ancak &quot;Viviren&quot; edinimi ve kullanımı ile bağlantılı aşırı maliyetler çift bioluminescent analizlerde bu substrat genel yararını değerlendirmek için gerekli görece az sayıda çalışma hazırladık. Son olarak, herhangi bioluminescent testin duyarlılığı ayrı aydınlatma üniteleri edinme edimsel CCD kamera üzerine eleştirel bağlıdır. Bu teknolojiler geliştirmek Nitekim, biz karmaşık ışık aracılı bioluminescent reaksiyonlar görselleştirmek için yeteneğimizi serbest hareket eden hayvanlar 13 verimli sızmak olabilir gelecekte bir noktada öngörüyoruz.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> pGL4.2-Puro [luc2 / Puro] Vektör </td><td> Promega </td><td> E6751 </td></tr><tr><td> Glomax Mult-idection sistemi </td><td> Promega </td><td></td></tr><tr><td> IVIS 200 serisi </td><td> Kaliper Yaşam Bilimleri </td><td></td></tr><tr><td> Çift lusiferaz muhabiri Assay sistemi </td><td> Promega </td><td> E1960 </td></tr><tr><td> Rediject coelenterazine-h </td><td> Kaliper Yaşam Bilimleri </td><td> 760506 </td></tr><tr><td> D-luciferase K-Tuz </td><td> Kaliper Yaşam Bilimleri </td><td> 122796 </td></tr></tbody></table>

in vivo dual substrate bioluminescent imaging

Nasıl ve ne zaman metastatik sitelere kurulan primer tümörlerden meme kanseri hücrelerinin Transit vivo bioluminescent görüntüleme teknolojileri 1-3 gelişiyle bu yana olağanüstü bir oranda artmıştır anlayışımız. Nitekim, araştırmacılar meme kanseri metastazı araştırmak nasıl devrim yarattı belirli tahlil zamanlarda hayvanların bireysel gruplara feda aksine çalışmanın tamamlanması için hayvanların tek bir kohort uzunlamasına tümör büyümesini bulmak ve ölçmek için yeteneği. Ne yazık ki, mevcut metodoloji meme kanseri hücrelerinin (i), primer tümörler içinde gelişmeye (ii) gövde boyunca yaymak, ve (iii) bir bölgelerinde proliferatif program yeniden başlatmak gibi hücre sinyalizasyon sistemi içinde sızmak kritik değişikliklerin gerçek-zaman değerlendirme önlemek metastatik lezyon. Ancak, bioluminescent görüntüleme son gelişmeler artık mümkün aynı anda belirli spatiotempor ölçmek için yapmakal çift alt tabaka ışıldama reaksiyon kullanımı ile tümör gelişimi ve metastaz ilerleme bir fonksiyonu olarak gen ekspresyonu değiştirir. Bunu yapmak için, araştırmacılar daha önce in vitro hücre onların yaygın kullanımını kolaylaştırmıştır dışlayan yüzeylerde tepki ikisi de ateş böceği (Photinus pyralis) ve deniz pansy (Renilla reniformis), izole iki ışık üreten lusiferaz enzimler için yararlanmak tabanlı raportör gen deneyleri 4. Burada ikinci Işıklı reaksiyon tümör farklı aşamalarında belirli sinyalizasyon sistemlerinin etkinleştirme durumunu görselleştirmek için bir araç olarak hizmet ederken bir lüminesans reaksiyon özellikle büyüklüğü ve gelişmekte olan bir tümörün yerini işaretler böyle bu iki enzim vivo programında göstermek ve metastaz gelişimi. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, iki kat vardır. Öncelikle, biz ikili bioluminescent muhabiri hücre hattı inşa etmek için gerekli adımları anlatacağızs, hem metastatik kaskadı spesifik adımlar boyunca gen ekspresyonunun düzenlenmesi zamanmekansal görselleştirme kullanımını kolaylaştırmak için gerekli olanlar gibi. Meme kanseri metastazı 4T1 modeli kullanarak, primer tümörün 4-6 ölçülen karşılaştırmalı olarak bir sentetik Smad Bağlama Elemanı (SBE) in vivo aktivite promotor pulmoner metastazı dramatik azalma olduğunu göstermektedir. Son zamanlarda meme kanseri metastazı olan fibroblastlar meydana gelen ve bağışıklık hücreleri 7-9 infiltre dahil primer tümör mikro ve reaktif stroma içinde değişiklikler ile düzenlenir gösterilmiştir. Böylece, ikinci hedefi ise meme kanseri büyüme ve metastaz sırasında tek bir hayvan içinde barındıran benzersiz iki hücre popülasyonlarının büyüme ve yerelleştirme izlenmesinde ikili bioluminescent tekniklerin yararlılığını ortaya olacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging at JoVE.com

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Bu yazıda onların büyüme ve metastaz sırasında metastatik meme kanseri hücrelerinde ifade böceği ve Renilla lusiferaz enzimler hem bioluminescent reaksiyonları, inşa görselleştirmek ve ölçmek için yöntemler tarif<em&gt; In vivo</em&gt;.

Vivo Çift Yüzey Bioluminescent Imaging&#39;de

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

in-vivo-dual-substrate-bioluminescent-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

15.4K Görüntüleme.  Case Western Reserve University. Bu yazıda onların büyüme ve metastaz sırasında metastatik meme kanseri hücrelerinde ifade böceği ve Renilla lusiferaz enzimler hem bioluminescent reaksiyonları, inşa görselleştirmek ve ölçmek için yöntemler tarif In vivo.

Video: In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are administered specifically to the liver to induce a localised liver tumour, via mobilisation of the spleen and splitting into two, leaving intact the vascular pedicle for each half of the spleen. Lewis lung carcinoma cells that constitutively express the firefly luciferase gene (luc1) are inoculated into one hemi-spleen which is then resected 10 minutes later. The other hemi-spleen is left intact and returned to the abdomen. Liver tumour growth can be monitored by bioluminescence imaging using the IVIS whole body imaging system. Quantitative imaging of tumour growth using IVIS provides precise quantitation of viable tumour cells. Tumour cell death and necrosis due to drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This mouse model allows for investigating the mechanisms underlying metastatic tumour-cell survival and growth and can be used for the evaluation of therapeutics of liver metastasis. 

This article describes a procedure for the induction of orthotopic bioluminescent liver tumours in mice, and subsequent analysis of tumour growth confined to the liver using live whole body luminescence imaging.

Murin Bioluminescent Karaciğer Tümör Modeli

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

Tıp

Dual-mode Imaging of Cutaneous Tissue Oxygenation and Vascular Function

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health disorders such as chronic wounds. We report the development of a dual-mode imaging system for non-invasive and non-contact imaging of cutaneous tissue oxygenation and vascular function. The imaging system integrated an infrared camera, a CCD camera, a liquid crystal tunable filter and a high intensity fiber light source. A Labview interface was programmed for equipment control, synchronization, image acquisition, processing, and visualization. Multispectral images captured by the CCD camera were used to reconstruct the tissue oxygenation map. Dynamic thermographic images captured by the infrared camera were used to reconstruct the vascular function map. Cutaneous tissue oxygenation and vascular function images were co-registered through fiduciary markers. The performance characteristics of the dual-mode image system were tested in humans.

A dual-mode imaging system was developed for non-contact assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function.

Kutanöz Doku oksijenasyon ve Damar Fonksiyon dual-mode Görüntüleme

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health ...

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

Müteakip 3D ile İntrakranial İmplantasyonu In Vivo Murin Gliomlar Bioluminescent Görüntüleme

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Stereotaktik intrakranial implantasyon ve<em&gt; In vivo</emGlioblastoma Multiforme bir Mouse Model Sistemde Tümör Xenografts arasında&gt; Bioluminescent Görüntüleme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

Flüoresans Konfokal videomikroskopi kullanılarak tümör Angiogenesis İn vivo

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

Pankreas Kanseri İlerleme Bioluminescent Ortotopik Model

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

Hücre Takip için vivo 19 F MRG

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the pathophysiological role of neuroplasticity in GI disorders remains unknown. Novel experimental models which allow simulation and modulation of GI neuroplasticity may enable enhanced appreciation of the contribution of neuroplasticity in particular GI diseases such as pancreatic cancer (PCa) and chronic pancreatitis (CP). Here, we present a protocol for simulation of pancreatic neuroplasticity under in vitro conditions using newborn rat dorsal root ganglia (DRG) and myenteric plexus (MP) neurons. This dual-neuron approach not only permits monitoring of both organ-intrinsic and -extrinsic neuroplasticity, but also represents a valuable tool to assess neuronal and glial morphology and electrophysiology. Moreover, it allows functional modulation of supplied microenvironmental contents for studying their impact on neuroplasticity. Once established, the present neuroplasticity assay bears the potential of being applicable to the study of neuroplasticity in any GI organ.

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuronal plasticity is an increasingly recognized, but insufficiently understood feature of the gastrointestinal (GI) tract. Here, in the example of human pancreatic disorders, we present an in vitro neuroplasticity assay for the study of neuronal plasticity in the GI tract at both morphological and functional level.

Pankreas Nöroplastisite benzetme:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-nöron Plastisitesi Deneyi

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Ardışık<em&gt; In vivo</em&gt; Kırık Onarım sırasında Osteojenik Kök / Progenitör Hücrelerinin Görüntüleme

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an increased risk of vascular morbidity.&#160;Yet, albeit&#160;the mounting clinical evidence, there is a paucity of clear studies of vascular toxicity and therefore the etiology of a heterogeneous group of vascular/cardiovascular disorders remains to be elucidated. Moreover, the mechanism that may underlie vascular toxicity can completely differ from the principles of chemotherapy-induced cardiotoxicity, which is related to direct myocyte injury. We have established a real-time, in vivo molecular imaging platform&#160;to evaluate&#160;the potential&#160;acute&#160;vascular toxicity of anti-cancer therapies.
We have set up a platform of in vivo, high-resolution molecular imaging&#160;in mice,&#160;suitable for visualizing vasculature within confined organs and reference blood vessels within the same individuals whereas each individual serve as its own control. Blood vessel walls were impaired after doxorubicin administration, representing a unique mechanism of vascular toxicity that may be the early event in end-organ injury. Herein, the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging is described, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

We herein describe the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Kemoterapi kaynaklı Vasküler Toksisite - Gerçek zamanlı<em&gt; In vivo</em&gt; Gemi Düşüklüğü Görüntüleme

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...