Bu çalışma, Paris Şehir, hiçbir Fransız Ulusal hibe ANR-09-JCJC-0118-1 ve ERC Starting Grant RNAvirusPopDivNVax Proje Tıp ve Sağlık Araştırma hibe fon tarafından desteklenmiştir. 242.719.

<ol>
	<li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+(in)fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin.">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li><li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+site+control+of+an+active+site+fidelity+checkpoint+in+a+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase.">Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).</li><li>Korneeva, V. S., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+the+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase:+fidelity,+replication+speed,+and+initiation+mechanism+determined+by+a+residue+in+the+ribose-binding+pocket.">Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket.</a> J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity.">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice.">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li><li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population.">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li><li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity.">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li><li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin's+antiviral+mechanism+of+action:+lethal+mutagenesis.">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li><li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures.">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li><li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus.">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li><li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ribavirin+antiviral+efficacy+via+nucleoside+transporter-mediated+drug+resistance.">Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance.</a> J Virol. 83, 4538-4547 (2009).</li><li>Levi, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fidelity+variants+of+RNA+dependent+RNA+polymerases+uncover+an+indirect,+mutagenic+activity+of+amiloride+compounds.">Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds.</a> PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).</li><li>Sierra, S., D&#225;vila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis:+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity.">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li><li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+(LCMV).">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li><li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin:+implications+for+error+catastrophe.">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li></ol>

Hücre hattı seçimi. RNA mutajenler olarak baz analogları etkinliği farklı hücre tipleri tarafından 11 bağıl alımı ile ilişkilidir. Normal virüs geçişi için kullanılan hücre hattı alımı ya da çok hassas (yüksek hücre toksisite) mutajen dirençli bulunduğu kanıtlanırsa, bu gereksinimleri karşılar ve hala viral replikasyon için izin veren başka bir hücre hattı kullanmak için gerekli olabilir. Mutajen direnç varyantı izole sonra, karakterizasyonu kalan orijinal, tercih edilen bir hücre hattı yapılabilir. Deneyimlerimize göre, HeLa hücrelerinde kolaylıkla mutajen kadar sürebilir; BHK hücreleri mutajen alımı refrakter 10 kat daha yüksek konsantrasyonlarda ve Vero hücreleri gerektirir. Mutajen fazla bir tür kullanılır mutajen. Seçimi mutajen tedavi, başarı olasılığını sadakat varyantları izole etmeye çalışan artar. Yanlışlıkla çoğaltma sırasında genomların dahil farklı yapısı, Temel analog mutajenler mutasyonların sonraki çoğaltma döngüsü içinde belirli bir alt grubunda ağırlıklı olarak sonuçlara sebep: ribavirin tedavisi GtoA ve CtoU geçiş mutasyonlar 12 yanadır; 5-azacytidine benzer bir önyargı vardır, CtoG ve GtoC transversions 13 Ayrıca; 5-fluorourasil tercihen Atog ve UtoC geçişler (14) neden olur. Alternatif olarak, daha yüksek konsantrasyonlarda Mg 2 + veya Mn 2 + 12 yukarıda açıklanan önyargısız RNA virüsleri genel mutasyon sıklığını artırmak için orta takviye olabilir. Virüs kodon dizileri bağlı olarak, ve bir vefa varyant üretmek için gerekli kodon değişiklikleri, bu şartlar bazı diğerleri üzerinde bu varyantın ortaya çıkması tercih edecektir. Kodon yerinde gerekli Atog geçiş ağırlıklı olarak bu ribavirin tarafından oluşturulan mutasyonlar denk çünkü yüksek sadakat poliovirus G64S ve Coxsackie virüsü A372V için, ribavirin tedavisi en kolay varyantları için seçilir. İçişleri Bakanlığı vs nüfus büyüklüğü viroloji, doku kültürü enfeksiyon için protokoller, arızalı müdahale parçacıklar (düşük İçişleri Bakanlığı) (yüksek İçişleri Bakanlığı) birikmesi veya virüsler arasında rekombinasyon teşvik etmek, enfeksiyon (İçişleri Bakanlığı) çokluğu özellikle dikkat örnek. Pasajlanması seri üzerinde ortaya çıkması olayları seçmek için, virüs nüfus büyüklüğü dikkate almak da önemlidir. Dirençli mutant başlangıçta düşük frekans var, her geçişte ortaya çıkan bu değişik kaybetmemek için bir sonraki (10 5 -10 6 virüsler, gibi) bir geçit gibi büyük bir nüfus büyüklüğü mümkün olduğunca aktarmak en iyisidir. Ölçekleme kadar iyi veya balonun büyüklüğü (enfekte olan hücreleri sayısı), İçişleri Bakanlığı olarak bu endişe ise artışını en aza indirmek için yardımcı olabilir. Öte yandan, deneyler, mutajen bir virüs duyarlılığı test olduğu için, düşük İçişleri Bakanlığı enfeksiyonu ile daha yüksek bir fitness genomların Deneyde ortaya çıkan çoğaltma döngülerinin sayısını artırmak ve mutagenized genomların kurtarma önlemek için yapılır ko-enfekte olan hücreleri tamamlama. Çoğaltma ilk turda döl genomları üzerinde oluşturulan mutasyonlar hemen tespit edilemez çünkü bu önemlidir. Bu mutagenized RNA&#39;lar çoğu hala virion içine paketlenmiş olacak. Bu enfeksiyon sonraki turda iptal çoğaltma döngüsü bu genomlarındaki ölümcül mutasyonlar sonucu, ve virüs titresi azalma olacağını. Bu ölümcül mutagenez önemli bir etkisi gözlenen mutasyonların birikimi birkaç tur için önce izin için gerekli olabilir. Son olarak, mutajen varlığı geçiş serisi üzerinde virüs titreleri nesli kadar düşmesi devam ederse, daha sonra araştırmacı, mutajen (çok düşük konsantrasyonda başlayarak) giderek artan miktarlarda virüs Pasajlanması denemelisiniz. İzolasyon ve RNA mutajen dayanıklı nüfus RNA mutajen dirençli klon nesil. RNA mutajenler her genom birden fazla rastlantısal mutasyonlar tanıtmak, ancak direnç için seçim direnci mutasyon sadece zenginleştirmek (ve düzeltmek için konsensüs dizisi) . Bu mutasyon belirlemek için, sırası mutajen dayanıklı nüfus (nüfusun uzlaşma) ve bireysel virüsler değil. Bu nedenle, mutajen tarafından oluşturulan tek, rastlantısal mutasyonlar sırayla tespit değildir, sadece seçimi aşağıdaki fikir birliği değişiklikler sonucu bulundu mutasyonlar. Deneyimlerimiz bize, sadece bir ya da iki Böyle bir fikir birliğine dizisi değişiklikleri belirlemek. Mutajen dayanıklı nüfus elde edilir ve direnci mutasyon tespit edildikten sonra, bu varyant daha saf bir stok oluşturmak için gereklidir. Yukarıda, bir plaket arıtma prosedürü nitelendirdi. Alternatif olarak, faiz virüs kolayca tanımlanabilir plaklar vermezse, istediğiniz şekli purif olabilirseyreltme sınırlayarak IED. Bu yaklaşım, aslında bir virüs stokunun% 50 daha az kuyu enfekte olduğu gibi seyreltilmiş 96-kuyu biçiminde TCID 50 . Bu seyreltme yukarıdaki gibi aynı yaklaşımı kullanarak, 10 özel türevleri kadar tecrit ve dizileri teyit alınır. Belirtildiği gibi, en iyi durumlarda, bulaşıcı bir virüs suşu cDNA klonu kullanılabilir. Varyant izolasyonu böylece gerekli olmayacaktır. Deneyimlerimize göre, sadakat varyantları tek bir amino asit değiştirmelerin sonucudur ve böylece Quikchange (Agilent) gibi basit, ticarileştirilmiş mutagenez kitleri kullanılarak oluşturulabilir. İkinci seçenek yakından ilgili bir zorlanma cDNA klonu kullanmak. Ancak, ilgili suşu kullanıldığı takdirde, biz yakından ilişkili iki virüsler aynı netlikte değiştiren mutasyon mutlaka aynı etkiye sahip olmayacaktır, çünkü bu yaklaşım ve virüs izolasyonu (örneğin plak arıtma) hem kullanarak öneririz. Sadakat ve RNA mutajen dirençli varyantları çoğaltma Seçim vahşi tip meslektaşları 4,12,15 benzer büyüme özellikleri ile hem daha yüksek ve daha düşük bir sadakat varyantları izolasyonu sonuçlandı . Şu anda, polimeraz aktivitesi oranları ve sadakat arasındaki bağlantı tam olarak anlaşılmış değildir. Düşük sadakat türevleri, daha hızlı işleme 1-3,12 eğiliminde iken, in vitro saflaştırılmış RNA polimeraz kullanarak biyokimyasal çalışmalar, yüksek sadakat varyantları yavaş işleme oranlarına sahip olduğunu göstermiştir . Doku kültürü, bu farklılıklar, hız sınırlayıcı adım, bu kaynakların kullanılabilirliğini ziyade içsel polimeraz aktivitesi kinetiği düşündürmektedir, genellikle belli değildir. Sadakat varyant vahşi tip önemli ölçüde farklı değildir kinetiği çoğaltır, daha sonra kendi mutasyon frekanslarının bir karşılaştırma doğrudan yapılabilir. Çoğaltma kinetiği çok önemli bir değişiklik varsa, daha sonra veri çoğaltma döngüleri aynı sayıda geçirmiş virüsler karşılaştırarak örneğin kinetik farklılıklar hesaba normalize edilmelidir. Bizim tecrübelerimize göre bir adım büyüme kinetiği yabani türü ve yüksek sadakat varyantları arasında anlamlı bir fark gözlendi rağmen, (içinde yüksek sadakat türevleri sürekli vahşi tip göre (1 günlüğüne içinde) yüksek titrede gözlenen ama onlar biraz daha az RNA yapmak aynı büyüklük sırası), ayrıca ürettikleri genomların daha az mutasyonlar içeren ve daha bulaşıcı, böylece olduğunu düşündürmektedir. Örnek hazırlama ve sıralama bu protokoller tüm adımlar için, biyolojik ilgili mutasyonlar ayırt edilemez yılından bu yana yüksek sadakat, redaksiyon enzimleri ek mutasyonlar tanıtarak sınırlamak için PCR ve RT-PCR için kullanılan zorunludur. Karşılaştırılan virüs popülasyonları yeterli başlangıç ​​materyal olduğundan emin olmak için de önemlidir (geçit geçmişi, doku kültür ortamı, sıcaklık, RNA ekstraksiyon yöntemi, RT-PCR protokolleri, vb) aynı şartlarda hazırlanmış olması kritik RT-PCR ile güçlü bir grup oluşturulur böyle RNA ekstraksiyonu aldı. 1 / 100 dilüsyon RNA örnek bir örnek yeterli sayıda temsil yanlılığı önlemek için (aynı genomunun tekrar tekrar yükseltme) RNA molekülleri içerdiğini belirten saptanabilir RT-PCR bant vermelidir. Mutasyon sıklığı bir dağıtım olduğundan, bir benzer değerlere nüfus büyüklüğü ne olursa olsun söz konusu önyargı meydana değildir sağlanan elde edilebilir olacağı beklenebilir. Şekil 6&#39;da görüldüğü gibi, bir virüs stokunun 10 5 kat seyreltme ebeveyn stok önemli ölçüde farklı bir mutasyon sıklığı verir. TopoTA klonlama için en uygun koşulları bulununcaya kadar, sıralama önce koloni PCR ile mavi / beyaz tarama sonra ekler varlığını doğrulamak. Mutasyon gürültü (RT-PCR ve sıralama tarafından tanıtılan mutasyonların) için bir kontrol olarak (in vitro transkripsiyonu RNA virüs genomuna ait bir plazmid taşıyan aynı viral dizisi ve / veya klon ve sırası RT-PCR ürünleri PCR ürünü klonu in vitro transkripsiyon enzimler farklı farkında) farklı hata oranlarına sahip ve gerçek arka plan hata yordamı yararlı bilgi vermeyebilir. Bazı virüs dizileri, bakteri için zehirli olabilir, bu yüzden bu mutasyon sıklığı viral genom dizilimini bölgeye karar vermeden önce doğrulamak için önemlidir. TopoTA elde dizileri analiz, her klon sadece bir ekleme / sıralama içermesi gerektiğini unutmayın. Karışık bir nüfus düşündüren bir çift tepe görülürse, bu iki komşu bakteri kolonilerinin olduğunu mümkündür. Mutasyon son derece olası bakteri kültürü plazmid amplifikasyon sırasında olduğunu, bakteri çoğaltma düşük mutasyon frekansları verilen rağmen, aynı zamanda mümkündür. Plak ppopülasyonları urified, bir çift tepe yeni bir mutasyon satın almak ya da plak gelişimi sırasında bir mutasyon dönüyor üst üste plaklar ya da bir virüs temsil edebilir. Tutarlı olun ve saymak veya bu mutasyonlar saymak karar. Son olarak, burada kullanılan mutasyon frekanslar göreli değerleri olduğunu unutmayın. Onlar sadece, aynı koşul altında yetiştirilen virüs popülasyonları karşılaştırarak geçerli ve aynı bölge üzerinde sıralı! Bunlar mutasyon oranı, ya da bir bütün olarak genom mutasyon sıklığı mutlak değer olarak alınmamalıdır. Ancak, şartlar kontrol edilir, onlar mutasyon dağıtım ve frekans farklılıkları tekrarlanabilir, kantitatif karşılaştırmalar izin veren.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Ribavirin </td><td> Sigma </td><td> R9644-10mg </td><td></td></tr><tr><td> 5-fluorourasil </td><td> Sigma </td><td> F6627-1G </td><td></td></tr><tr><td> 5-azacytidine </td><td> Sigma </td><td> A2385-100mg </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1028 = On Olunca-100ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td> Tripan mavi </td><td> Sigma </td><td> T8154-20ml </td><td></td></tr><tr><td> TopoTA klonlama kiti </td><td> Invitrogen </td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> Quikchange mutasyon kiti </td><td> Agilent </td><td> 200516 </td><td> CDNA bulaşıcı bir klon varsa </td></tr><tr><td> 96-iyi miniprep kiti </td><td> Macherey&#39;nin-NAGEL </td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene, Sequencher </td><td> DNAstar, Gen Kodları Corporation&#39;ın </td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td> Veya diğer hizalama yazılımı </td></tr></tbody></table>

isolation of fidelity variants of rna viruses and characterization of virus mutation frequency

RNA virüsleri RNA bağımlı RNA polimeraz genomların çoğaltmak için kullanın. Bu enzimlerin özünde yüksek hata oranı virüs adaptasyon ve evrim kolaylaştıran aşırı nüfus çeşitliliğinin nesil için büyük bir katkıda bulunuyor. Giderek artan kanıtlar, içsel bir hata oranları ve RNA virüsleri ortaya çıkan mutasyon frekansları, viral polimeraz ince amino asit değişiklikleri modüle olabileceğini göstermektedir. Biyokimyasal testleri dahil kantitatif ölçmek sadakat izin veren bazı viral RNA polimeraz için mevcut olmasına rağmen, biz burada sadakat değiştirerek mutasyonları tespit biyokimyasal yaklaşımlar kadar doğru olduğunu kanıtlamıştır RNA virüslerinin mutasyon frekansları ölçmek için basit bir yöntem tarif. Bu yaklaşım, en biyoloji laboratuarları yapılabilir geleneksel virolojik ve sıralama teknikleri kullanır. Bir dizi farklı virüsler ile tecrübemize dayanarak, sadakat varyantları tecrit ve istatistiksel olarak anlamlı veri üreten olasılığını artırmak için optimize edilmesi gereken önemli adımları belirledik. Sadakat değiştiren mutasyonlar izolasyonu ve karakterizasyonu polimeraz yapısı ve fonksiyonu 1-3 yeni anlayışlar sağlayabilir. Ayrıca, bu sadakat varyantları virüs adaptasyon ve evrim mekanizmaları 4-7 karakterize faydalı bir araç olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency at JoVE.com

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Bu makale, RNA virüsleri ve doku kültürü aslına Değişiklikleri onaylamak için mutasyon sıklığı verileri kullanmak RNA polimeraz sadakat varyantları izole ve karakterize etmek için gerekli adımları açıklamaktadır.

Virüs mutasyon Frekans RNA Virüsler ve Karakterizasyonu Fidelity Varyantlar izolasyonu

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

isolation-fidelity-variants-rna-viruses-characterization-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

29.5K Görüntüleme.  Institut Pasteur. Bu makale, RNA virüsleri ve doku kültürü aslına Değişiklikleri onaylamak için mutasyon sıklığı verileri kullanmak RNA polimeraz sadakat varyantları izole ve karakterize etmek için gerekli adımları açıklamaktadır.

Video: Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Anti-tümör özelliklere sahip izole edilmesi ve nötrofil Karakterizasyonu

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Yeni Bir Dünyadan Rekombinant Virüsün Kurtarılması ve Karakterizasyonu Zika Virüsü Bulaşıcı Klon

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

Grip virüsü monoklonal antikorları nötralize kaçış türevleri üretimi

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in diameter. MPs are a newly evolving, important part of cell-to-cell communication and signaling machinery. Because of their size and the nature of their release, until recently MP existence was overlooked. However, with improved technology and analytical methods their function in health and disease is now emerging. The protocols presented here are aimed at isolating and characterizing PMN-MPs by flow cytometry and immunoblotting. Moreover, several implementation examples are given. These protocols for MP isolation are fast, low-cost, and do not require the use of expensive kits. Furthermore, they allow for the labeling of MPs following isolation, as well as pre-labeling of source cells prior to MP release, using a membrane-specific fluorescent dye for visualization and analysis by flow cytometry. These methods, however, have several limitations including purity of PMNs and MPs and the need for sophisticated analytical instrumentation. A high-end flow cytometer is needed to reliably analyze MPs and minimize false positive reads due to noise or auto-fluorescence. The described protocols can be used to isolate and define MP biogenesis, and characterize their markers and variation in composition under different stimulating conditions. Size heterogeneity can be exploited to investigate whether the content of membrane particles versus exosomes is different, and whether they fulfill different roles in tissue homeostasis. Finally, following isolation and characterization of MPs, their function in cellular responses and various disease models (including, PMN-associated inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Diseases or Acute Lung Injury) can be explored.

New protocols are described here to isolate and characterize microparticles derived from human and mouse neutrophils. These protocols utilize ultracentrifugation, flow cytometry, and immunoblotting techniques to analyze microparticle content, and they can be used to study the role of microparticles derived from various cell types in cellular function.

Yalıtım ve nötrofil kaynaklı Microparticles karakterizasyonu için fonksiyonel çalışmalar

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

Yalıtım ve yetişkin Schistosoma japonicum üzerinden ekstraselüler veziküller karakterizasyonu

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...