Bu çalışma, Ulusal Sağlık Hibe GM 69.829 Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir.

1. Agonist konsantrasyon-yanıt eğrileri ölçümü: kurucu aktivite <ol><li> Göreceli agonist K b değerleri tahmini (RA i) için, en az iki agonist konsantrasyon-yanıt eğrileri bir dizi gereklidir. Herhangi bir GPCR fonksiyonel yanıtı in vitro tayininde agonist konsantrasyonu kontrollü ve tek tip reseptör aracılık yanıt olabilir ölçülebilir. Uygun hücre tabanlı testlerin cAMP 4,7 ölçüm ve rekombinant bir reseptör ifade inositolphosphate birikimi 8,9 hücre hattı içerir. Bütün doku testlerin örnekleri, düz kas 10 veya M 2 muskarinik reseptör ve sol atrium 11 alan uyarılmış sıçan daralma β 1-reseptör-aracılı değişiklikler kasılması ölçümü içerir . </li><li> Agonistlerin analizi için çok etkili bir agonist dahil olmak üzere bir dizi seçin(Örneğin, endojen ligand). Verilen bir deneyde, her agonist için tam konsantrasyon-yanıt eğrileri ölçer. Agonistlerin tek bir deneyde tahlil tamamlamak için çok büyükse, alt gruplar, her biri tek bir deney için yönetilebilir bir sayıda agonistlerin oluşan agonistleri bölün. Her alt grup için (bkz. Şekil 3) ile birlikte bu alt grup diğer agonistlerin çok etkili agonist konsantrasyon-yanıt eğrisi ölçmek. 6 kez, yaklaşık verilerin değişkenliği bağlı olarak her 3 alt grup için deneyi tekrarlayın. </li><li> Her konsantrasyon-yanıt eğrisi için, agonist (bazal yanıt) yokluğunda tepki ölçmek ve artan agonist konsantrasyonları varlığı. Space düzgün bir günlük ölçekli yaklaşık her 0.3 üzerinde agonist konsantrasyonları - 0.7 günlük 10 adet, yanıtların yelpazesini kapsayan ve maksimal yanıt (E max) (bkz. Şekil 3) tanımlama. Experim içinhücre dizileri üzerine veliler, her ölçüm üç nüsha halinde yapılır. </li><li> Her agonist konsantrasyonu ölçülen bazal yanıt çıkarın. Şekil 3&#39;te çizilen tepkiler bu şekilde hesaplandı. </li></ol> 2. Agonist konsantrasyon-yanıt eğrileri ön analizi: kurucu aktivite <ol><li> Prizma Veri Tablosu konsantrasyon-yanıt deneyler (örneğin, Şekil 5) veri girin. Tüm günlük agonist konsantrasyonları en büyük D max değeri görünür agonist yanıtı ölçümleri sütun A girilir ve diğer agonist bitişik harfli sütun girilen X etiketli sütununun altında girilir. Konsantrasyon-yanıt eğrileri çoğalt ölçümler belirli bir harfli sütunun alt sütunlar halinde girilir. </li><li> Çizilen verileri hangi grafik sayfasını seçin ve doğrusal olmayan regresyon analizi ile kullanarak verileri analizdenklemi başlıklı, log (agonist) karşı tepki - Değişken eğim (dört parametre). &quot;Alt&quot; parametresi sıfıra Koru&#39;yu ve regresyon analizi gerçekleştirmek. &quot;Top&quot; (E max) kopyalayın ve ilk parametre tahminlerinin hesaplanmasında kullanılmak üzere bir Excel&#39;e EC 50 parametreleri giriş yapın. Diğer agonistlerin &quot;test agonistleri&quot; olarak belirlenmiş ise, en büyük D max tahmin agonisti, &quot;standart agonist&quot; olarak belirlenmiş . </li><li> Standart agonist (-log EC 50 &#39;) negatif günlük EC 50 değeri olarak atıl günlük τK ilk tahmini (LOGR1) hesaplayın. Günlük RA her test agonist i değeri (LOGRA) ilk tahmini günlük olarak hesaplayın {(En * EC 50 &#39;) / (Top&#39; * EC 50)} parametreleri standart agonist bir kesme işareti ile belirtilir, . Günlük afinite con hesaplayınilgili EC 50 değerleri negatif günlük olarak test agonistlerin kopolimerlesme sabitleri (LOGK5 LOGK2). </li></ol> 3. Doğrusal olmayan regresyon analizi kullanılarak agonist Rai değerleri tahmini: yok kurucu aktivite <ol><li> 2.1 &#39;de yukarıda açıklandığı gibi Prism bir veri Tablo içine veri girin. A sütunundaki standart agonist için veri girildiğinden emin olun. </li><li> Toplam beş agonistlerin ilgili davanın görüldüğü gibi, kullanıcı tanımlı bir denklem girin birkaç satırlık Prizma, &quot;RAI log&quot; <ul><li> &lt;A&gt; P = LOGK1 </li><li> &lt;A&gt; Q = LOGR </li><li> &lt;~ A&gt; Q = LOGR + LOGRA </li><li> &lt;B&gt; P = LOGK2 </li><li> &lt;C&gt; P = LOGK3 </li><li> &lt;D&gt; P = LOGK4 </li><li> &lt;E&gt; P = LOGK5 </li><li> Y = MSYS / (1 + {[(1 +10 ^ (X + P)) / (10 ^ (X + S))] ^ M}) </li></ul></li><li> Ilk parametre tahminleri aşağıdaki gibi girin: Standart agonist günlük afinite sabiti (LOGK1) için 0, keyfi olarak düşük bir değer girin. Ilk tahmin girinLOGR ve afinite sabitleri (LOGK2 - LOGK5) test agonistleri ve günlük Rai değerleri (LOGRA). Ilk tahmin transdüser eğim faktörü (M) 1.0 bir değer atayın. Ilk tahmin sistemi maksimal yanıt (MSYS) standart agonist (En) E max eşdeğer bir değer atayın. </li><li> LOGR1, MSYS ve M, tüm veri kümeleri için paylaşılan değer; LOGK5 ve LOGRA, hiçbir sınırlama LOGK2 LOGK1 sürekli, 0 kısıtlı: aşağıdaki parametre kısıtlamaları uygulayın. </li><li> Doğrusal olmayan regresyon analizi başlatın. Sonuçları atıl günlük K verim ve test agonistlerin günlük RA i değerleri. Standart tam agonist agonist ise, günlük K hem atıl ve günlük RA i değerleri doğru. Sonra en etkili agonist (standart agonist), K aslında bir kısmi agonist ise atıl daha etkili ag değerlerionists abartmış olabilir. Bununla birlikte, günlük RA tahminleri i hala bu durumda doğru olan. </li><li> Regresyon yakınsama değilse, deneyci ilk parametre tahminleri tarafından tanımlanan teorik egri isteyebilirsiniz. Veri noktaları ve teorik eğriler arasında büyük sapmalar varsa, ilk parametre tahminlerinin hesaplanmasına kontrol edin. Bir veya daha fazla agonistler D max standart agonist eşdeğer değerleri varsa, atıl regresyon için 0 değerleri bir çözüm üzerinde birleşmemiz log K sınırlamak için gerekli olabilir. </li></ol> 4. Agonist konsantrasyon-yanıt eğrileri ölçümü, hücre tabanlı testlerin kurucu reseptör aktivitesi gösteren <ol><li> M -1, in vitro tayinlerde, hücre tabanlı sergi kurucu reseptör aktivitesinin kullanılır mutlak birimleri agonist K b değerleri tahmini için. Anayasaltive reseptör aktivitesinin ilgi reseptör ifade kaynaklanan bazal seviyesinden tepki artış olarak tanımlanır. </li><li> Agonistleri seçin ve bölüm 1.2 &#39;de yukarıda açıklandığı gibi deney tasarımı. </li><li> Her konsantrasyon-yanıt eğrisi için, agonist olmayan transfekte hücrelerin yokluğunda (bazal yanıt) ve reseptör ilgi (bazal yanıt + kurucu yanıt) ile transfekte hücreleri tepki ölçer. Bölüm 1.3 &#39;de yukarıda açıklandığı gibi farklı agonistlerin farklı konsantrasyonlarda huzurunda yanıt ölçün. </li><li> Kurucu reseptör aktivitesini ve ölçülen tepki eksi reseptör ile transfekte hücrelerinde bazal yanıt olarak her agonist konsantrasyonu yanıt hesaplayın. Şekil 6 çok düşük kurucu aktivite sergileyen bir sinyal yolağı için bu şekilde hesaplanan çeşitli agonistlere tepkiler gösterir. </li></ol> 5. Ön birkurucu faaliyet gösteren agonist konsantrasyon-yanıt eğrileri alysis <ol><li> Bölüm 3.1 &#39;de açıklandığı gibi, aynı zamanda -20 günlük agonist konsantrasyonuna tekabül eden uygun harfli sütun kurucu reseptör aktivitesinin neden tepki girerken Prizma bir veri Tablo verileri (örneğin, Şekil 6) girin. Büyük bir negatif logaritması yaklaşık bir agonist konsantrasyonu sıfır girilir. </li><li> Bölüm 2.2 &#39;de yukarıda açıklanan, ancak &quot;Alt&quot; parametresi o kadar kısıtlı olarak veri analiz &quot;tüm veri kümeleri için paylaşılan&quot; &quot;Top&quot; (E maks), paylaşılan &quot;Alt&quot; Kopyala ve Excel&#39;e ilk parametre tahminlerinin hesaplanmasında kullanılmak için bir log EC50 parametreleri. </li><li> Ilk parametre tahminleri aşağıdaki gibi hesaplayın: Daha önce 3 açıklandığı gibi standart agonist (LOGK1) veya herhangi bir tam testi agonist sürekli günlük yakınlığı ayrı deneylerde tespit edilmelidir </sup&gt; Günlük ilk tahmini hesaplayın K atıl günlük {(Top&#39; Top) / (EC 50 (Top&#39; Alt))} olarak, her bir kısmi test agonist değeri (yani, bu durumda sadece LOGK2), &quot; Alt &quot;kurucu reseptör aktivasyonu ile neden tepki göstermektedir. Log K b (LOGKb) günlük olarak her agonist için ilk tahmin hesaplayın {Top / (EC 50 Alt)}. Günlük olarak hesaplayın ilk tahmini günlük τ sys (LOGTsys) {/ Alt (Top &#39;- Alt)}. </li></ol> 6. Doğrusal olmayan regresyon analizi kullanılarak kurucu reseptör aktivitesinin sergileyen yanıtlar için agonist Kb değerleri tahmini <ol><li> 3.1 altında yukarıda açıklandığı gibi Prism bir Veri Tablosu verileri girin </li><li> Durum için iki agonistlerin gösterildiği gibi kullanıcı tanımlı bir denklem girin, birkaç satırlık Prizma, &quot;Kb Log&quot; <ul><li> &lt;A&gt; LOGKOBS = LOGK1 </li><li> &lt;B&gt; LOGKOBS = LOGK2 </li><li> A = (10 ^ (X + LOGKOBS)) +1 </li><li> B = 10 ^ (X + LOGTSYS + LOGKB) </li><li> C = (10 ^ (LOGTSYS)) </li><li> Y = MSYS / {1 + [(A / (B + C)) ^ M]} </li></ul></li><li> Ilk parametre tahminleri aşağıdaki gibi girin: Her agonist afinite sabitleri (adım 5.3 kapsamında belirlenen değer girin LOGK1) girin. Atıl Her test agonist tahminler K girin. Agonistlerin Kb tahminleri girin. Τ sys (LOGTsys) tahmini giriş girin. Sırasıyla, transdüser eğimi faktörü (M) ve sistemin maksimum yanıt (MSYS) 1.0 ve Top &#39;(standart agonist E max) değerleri atayın. </li><li> LOGK2 ve LOGKb, hiçbir sınırlama LOGTsys, MSYS ve M, tüm veri kümeleri için paylaşılan değer: Aşağıdaki parametresi kısıtlamaları uygulayın. </li><li> Doğrusal olmayan regresyon analizi başlatın. Sonuçlar, standart agonist günlük K b, günlük K atıl verim </sub&gt; ve günlük K b değerleri kısmi agonistler ve maksimal yanıt sistemi (MSYS), serbest reseptör kompleksi (LOGTsys) τ sys değeri, ve işletme modeli (M) transdüser eğim faktörü. </li><li> Regresyon yakınsama değilse, Madde 3.6 altında yukarıda açıklanan adımları izleyin. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 5 stably M 3 muskarinik reseptör 12 ifade Çin hamsteri over hücrelerinde muskarinik agonist ile indüklenen inozitol hidroliz daha önce yayımlanmış verilere bazı gösterir . Bu testte seçilmiş muskarinik agonistlerin konsantrasyon-yanıt eğrileri ölçüldü. Oxotremorine-M göre, Bölüm 3 kapsamında her agonist K b değeri tahmin Yukarıda ifade anlatıldığı gibi veriler incelendi. Areco Bu günlük RA i tahminleri, karbakol, -0.56 ± 0.063çizgi, -0,60 ± 0,074; pilokarpin, -1.20 ± 0.15 ve McN-A-343, -1,92 ± 0,31. Teorik eğrileri veri (Bölüm 3.2) regresyon denklemi en küçük kareler uyum temsil eder. Sistemin maksimum yanıt (M sys) ve transdüser eğim faktörü (M) ilgili tahminler, 53.9 ± 1.3 ve 1.15 ± 0.09, sırasıyla idi . Günlük K atıl oxotremorine-M dışında agonistlerin değerleri, karbakol, 5.19 ± 0.14; arecoline, 5.49 ± 0.12; pilokarpin, 5.58 ± 0.16 ve McN-A-343, 5.27 ± 0.33. Şekil 6 stably G α15 3 ifade HEK 293 hücrelerinde muskarinik agonist-uyarılmış inozitol hidroliz deneylerin sonuçlarını gösterir. M 3 muskarinik reseptör Geçici ifade bazal inozitol hidroliz, kurucu reseptör activ atfedilen bir artışa neden olmuşturrınız. Bölüm 6 altında açıklandığı gibi oxotremorine-M ve McN A-343 günlük K b değerleri tahmin etmek için veriler analiz edildi. Bu analiz, sırasıyla oxotremorine-M ve McN A-343 için 8.30, log K b değerleri ± 0.59 ve 6.59 ± 0.77 verdi. Teorik eğriler verilere regresyon denklemi en küçük kareler uyum (bkz. Bölüm 6.2) temsil eder. Günlük τ sys, K sys ve M tahminleri -2,29 ± 0.59, 95.8 ± 2.8 ve 0.72 ± 0.08, sırasıyla. K tahmin atıl McN-A-343 değeri 5.35 ± 0.46 idi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig1.jpg" /> Şekil 1. tek bir reseptör aktivitesi ve reseptör nüfusun aktivasyonu ortalama seviyesi arasındaki ilişki Tek reseptör aktivitesi, teorik davranış transitio geçiren tek bir reseptöragonist varlığı arasında ns (Açık) aktif ve inaktif (Kapalı) devletler gösterilmiştir. Aktif ve etkin olmayan devletler için agonist afinite sabitleri sırasıyla, K b) ve (K a belirtilir. Nüfus davranış, bir agonist varlığı etkin ve etkin olmayan devletler arasında rasgele geçişler geçiren birkaç reseptörlerinin teorik davranış. Nüfus gösterilir ortalama, reseptörlerin agonist konsantrasyonu belirli bir varlığı bir popülasyonda ortalama seviyede reseptör aktivasyonu gösterilmiştir. Reseptör nüfusun aktivasyon düzeyini uyarıcı olarak bilinir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig2.jpg" /> Şekil 2 reseptör aktivasyon fonksiyonu ve etkinliği (ε) ve agonist Nüfus ortalama gözlenen yakınlık sabiti (K atıl) arasındaki ilişki, ortalama düzeydereseptör aktivasyonu agonist konsantrasyonları artan gösterilir tarafından ortaya Reseptör aktivasyonu, reseptör aktivasyonu ortalama düzeyde agonist agonist günlük konsantrasyonu çizilir. Yarım maksimum reseptör aktivasyonu için gerekli agonist negatif günlük konsantrasyon agonist (log K atıl) sürekli günlük gözlenen yakınlık eşdeğerdir. Reseptör aktivasyon fonksiyonu maksimum etkinliği (ε) olarak belirtilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig3.jpg" /> Şekil 3, uyarılması için çeşitli insan M 3 muskarinik reseptör ifade Çin hamsteri over hücrelerinde muskarinik agonistlerin [3 H] inositolphosphate birikimi konsantrasyon-yanıt eğrileri örnekleri . Toplam dokuz agonist konsantrasyon-yanıt eğrileri ölçüldü. Deney iki bölüme ayrılabilir. Her bölümü için, standart agonist (oxotremorineM) her zaman ek agonistleri ile birlikte test edilir. Böylece, iki gösterilen tip deneyler a ve b, bir kerede sadece beş agonistleri test olabilir dokuz agonistlerin konsantrasyon-yanıt eğrileri ölçmek için gereklidir . Veri Ehlert ve ark. [12 ]. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig4.jpg" /> Şekil 4 HEK 293 hücreler insan M 2 muskarinik reseptör ve G α15 ifade [3 H] inositolphosphate birikimi çeşitli muskarinik agonistler tarafından uyarılması için konsantrasyon-yanıt eğrileri örnekleri. M 2 reseptör ekspresyonu 30 neden - kurucu reseptör aktivitesinin atfedilen% 35 [3 H] inositolphosphate yanıt. Veri Ehlert ve ark. [12 ]. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig5.jpg" /> Şekil 5. </Çin hamsteri over hücrelerinde strong&gt; Muskarinik agonist aracılı inozitol hidroliz stably insan M 3 muskarinik reseptör dile getirdi. Uyarıcı inozitol hidroliz için seçilen muskarinik agonistlerin konsantrasyon-yanıt eğrileri gösterilmiştir. Üç deneylerden elde edilen ortalama değerler ± SEM gösterilmiştir. Veri Ehlert ve ark. [12 ]. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig6.jpg" /> Şekil 6. Oxotremorine-M ve G α15 ve M 3 muskarinik reseptör ifade HEK 293 hücrelerinde McN-A-343-aracılı inozitol hidroliz. Inozitol hidroliz oxotremorine-M E max göre ifade edilir. Agonist yokluğunda, inozitol hidroliz M 3 reseptör yanıtı yaklaşık% 2 oluşturdu ifade bağladı. Üç deneyler ± SEM yolu gösterilmektedir. Data Ehlert ve ark.. 3.

<ol>
	<li>Stephenson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modification+of+receptor+theory.">A modification of receptor theory.</a> British Journal of Pharmacology. 11, 379-393 (1956).</li><li>Furchgott, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+b-haloalkylamines+in+the+differentiation+of+receptors+and+in+the+determination+of+dissociation+constants+of+receptor-agonist+complexes.">The use of b-haloalkylamines in the differentiation of receptors and in the determination of dissociation constants of receptor-agonist complexes.</a> Advances in Drug Research. 3, 21-55 (1966).</li><li>Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+agonism+and+inverse+agonism+in+functional+assays+with+constitutive+activity:+Estimation+of+orthosteric+ligand+affinity+constants+for+active+and+inactive+receptor+states.">Analysis of agonism and inverse agonism in functional assays with constitutive activity: Estimation of orthosteric ligand affinity constants for active and inactive receptor states.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 33, 671-686 (2011).</li><li>Griffin, M. T., Figueroa, K. W., Liller, S., Ehlert, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+Agonist+Activity+at+G+Protein-Coupled+Receptors:+Analysis+of+M2+Muscarinic+Receptor+Signaling+through+Gi/o,Gs,+and+G15.">Estimation of Agonist Activity at G Protein-Coupled Receptors: Analysis of M2 Muscarinic Receptor Signaling through Gi/o,Gs, and G15.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 321, 1193-1207 (2007).</li><li>Black, J. W., Leff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+models+of+pharmacological+agonism.">Operational models of pharmacological agonism.</a> Proceedings of the Royal Society of LondonSeries B: Biological Sciences. 220, 141-162 (1983).</li><li>Tran, J. A., Chang, A., Matsui, M., Ehlert, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+relative+microscopic+affinity+constants+of+agonists+for+the+active+state+of+the+receptor+in+functional+studies+on+M2+and+M3+muscarinic+receptors.">Estimation of relative microscopic affinity constants of agonists for the active state of the receptor in functional studies on M2 and M3 muscarinic receptors.</a> Mol. Pharmacol. 75, 381-396 (2009).</li><li>Schultz, J., Hamprecht, B., Daly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+adenosine+3':5'-cyclic+monophosphate+in+clonal+glial+cells:+labeling+of+intracellular+adenine+nucleotides+with+radioactive+adenine.">Accumulation of adenosine 3':5'-cyclic monophosphate in clonal glial cells: labeling of intracellular adenine nucleotides with radioactive adenine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1266-1270 (1972).</li><li>Berridge, M. J., Downes, C. P., Hanley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+amplifies+agonist-dependent+phosphatidylinositol+responses+in+brain+and+salivary+glands.">Lithium amplifies agonist-dependent phosphatidylinositol responses in brain and salivary glands.</a> Biochemical Journal. 206, 587-595 (1982).</li><li>Kendall, D. A., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis. , 68-87 (1990).</li><li>Pulido-Rios, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitro+Isolated+Tissue+Functional+Muscarinic+Receptor+Assays.">Vitro Isolated Tissue Functional Muscarinic Receptor Assays.</a> Current Protocols in Pharmacology. 48, 4-15 (2010).</li><li>Kenakin, T., Enna, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2001).</li><li>Ehlert, F. J., Griffin, M. T., Sawyer, G. W., Bailon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=simple+method+for+estimation+of+agonist+activity+at+receptor+subtypes:+comparison+of+native+and+cloned+M3+muscarinic+receptors+in+guinea+pig+ileum+and+transfected+cells.">simple method for estimation of agonist activity at receptor subtypes: comparison of native and cloned M3 muscarinic receptors in guinea pig ileum and transfected cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 289, 981-992 (1999).</li><li>Burstein, E. S., Spalding, T. A., Brann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacology+of+muscarinic+receptor+subtypes+constitutively+activated+by+G+proteins.">Pharmacology of muscarinic receptor subtypes constitutively activated by G proteins.</a> Mol. Pharmacol. 51, 312-319 (1997).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

RA i (göreceli K b değeri) tahmin etmek için yöntem yalnızca agonist konsantrasyon-yanıt eğrileri ölçümü gerektirdiğinden bu eğrileri ölçülen zaman, bizim analiz yapılabilir. Deneysel hazırlanması (örneğin, hücreler veya doku) yanıt gün-için-gün varyasyon büyükse, her konsantrasyon-cevap eğrisi yanıt ölçümleri için standart agonist &quot;En&quot; tahmin göre normalize olması. Her günün deneme. Top bir tahm...

quantifying agonist activity at g protein-coupled receptors

Agonist G-protein bağlı reseptörler (GPCRs) bir nüfusu harekete geçirir, hücre veya doku tepki doruğa sinyal yolağı ortaya çıkarır. Bu süreç, tek bir reseptör, bir nüfus reseptörlerinin veya bir alt-yanıt düzeyinde analiz edilebilir. Burada, tek reseptörler aktif devlet için sabit agonist yakınlığına bir tahmin elde etmek için mansap yanıt nasıl analiz açıklar. Reseptörler quantal anahtarlar gibi davranan, aktif ve inaktif durumlar (Şekil 1) arasında alternatif. Etkin devlet, özel G proteinleri veya diğer sinyalizasyon ortakları ile etkileşime girer. Ligand yokluğunda, inaktif duruma hakimdir. Agonist bağlanma aktif devlet (K b) sabit, yakınlık inaktif duruma (K) için çok daha büyük, çünkü reseptör aktif devlet geçer olasılığını artırır. Toplamıtüm nüfus reseptörlerinin rastgele çıkışlar, zaman içinde reseptör aktivasyonu sabit bir seviyede verir. Yarım maksimum reseptör aktivasyonu eliciting agonist konsantrasyonu karşılıklı gözlenen afinite sabiti (K atıl) eşdeğer olup, aktif devlet agonist-reseptör komplekslerinin fraksiyonu etkinliği (ε) (Şekil 2) olarak tanımlanır. K atıl ve bir agonist 1,2 göreceli etkinliği tahmin etkinleştirmeniz GPCRs downstream yanıtları analiz etmek için yöntemler geliştirilmiştir. Bu raporda, biz başka bir agonist agonist K b değeri tahmin etmek için bu analizi nasıl değiştirileceğini gösterir . Kurucu faaliyet gösteren testlerde, K b M -1 mutlak birimleri nasıl tahmin göstermektedir. Agonist konsantrasyon-yanıt eğrileri 3,4 analiz yöntemi oluşuroperasyonel modeli 5 kullanarak global doğrusal olmayan regresyon. Biz yazılım uygulaması, Prizma (GraphPad Software, Inc, San Diego, CA) kullanılarak bir prosedür tanımlamaktır. K ürün atıl ve etkinliği (τ) ile orantılı bir parametre analizi bir tahmin verir. Başka tarafından bölünmüş bir agonist τK atıl, tahmin K b göreceli bir ölçü (RA i) 6. Kurucu aktivite sergileyen bir reseptör için, ücretsiz reseptör kompleksinin etkinliği (τ sys) ile orantılı bir parametre tahmin etmek mümkündür. Bu durumda, bir agonist K b değeri τK atıl / τ sys 3 eşdeğerdir. Yöntemi reseptör alt tiplerinin bir agonist seçicilik belirlenmesi için ve farklı G proteinleri aracılığıyla agonist-reseptör sinyal ölçülmesi için yararlıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors at JoVE.com

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

Aktif devlet için bir agonist afinite sabiti tahmin etmek için bir yöntem (<em&gt; K<sub&gt; B</sub</em&gt;), G-protein kenetli reseptör açıklanmıştır. Analiz mutlak ya da göreli önlemleri sağlar<em&gt; K<sub&gt; B</sub</em&gt; Kurucu reseptör aktivasyonu ölçülebilir olup olmadığına bağlı. Yöntemi reseptör aktivasyonu çeşitli tepkiler downstream için geçerlidir.

G Protein-Coupled reseptörleri Agonist Aktivitesi miktarının

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

quantifying-agonist-activity-at-g-protein-coupled-receptors

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Görüntüleme.  University of California, Irvine. Aktif devlet için bir agonist afinite sabiti tahmin etmek için bir yöntem ( K B

Video: Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and release from individual presynaptic terminals directly, we designed fluorescent false neurotransmitters as substrates for the synaptic vesicle monoamine transporter. Using these probes to image dopamine release in the striatum, we made several observations pertinent to synaptic plasticity. We found that the fraction of synaptic vesicles releasing neurotransmitter per stimulus was dependent on the stimulus frequency. A kinetically distinct "reserve" synaptic vesicle population was not observed under these experimental conditions. A frequency-dependent heterogeneity of presynaptic terminals was revealed that was dependent in part on D2 dopamine receptors, indicating a mechanism for frequency-dependent coding of presynaptic selection.

Hui Zhang and Niko G. Gubernator contributed equally to this work.

A new means to measure neurotransmission optically using fluorescent dopamine analogs.

Bireysel Presinaptik Terminalleri Dopamin Yayın FFNs ile görüntülendi

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

Biyoloji

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

Işıksal Çözülmüş İki foton Mikroskop kullanarak G Protein Coupled Reseptör Etkileşmeleri in vivo Niceleme

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Gen spesifik ifadesi ile DNA Methylation değişiklikler astrositik transkripsiyonel Aktivite ilişkilendirilmesi<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 and minimum levels of 0.03 ng ml&#8722;1) in circulating blood are essential as variable levels may indicate altered physiology. For example, growth disorders occurring in childhood can be diagnosed by measuring levels of hGH in blood. Also, the misuse of recombinant hGH in sports not only poses an ethical issue it also presents serious health threats to the abuser. One popular strategy for measuring hGH misuse, relies on the detection of the ratio of 22 kDa hGH to total hGH, as non-22 kDa endogenous levels drop after exogenous recombinant hGH (rhGH) administration. Surface plasmon resonance imaging (SPRi) is an analytical tool that allows direct (label-free) monitoring and visualization of biomolecular interactions by recording changes of the refractive index adjacent to the sensor surface in real time. In contrast, the most frequently used colorimetric method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) uses enzyme labeled detection antibodies to indirectly measure analyte concentration after the addition of a substrate that induces a color change. To increase detection sensitivity, amplified SPRi uses a sandwich assay format and near infrared quantum dots (QDs) to increase signal strength. After direct SPRi detection of recombinant rhGH in spiked human serum, the SPRi signal is amplified by the sequential injection of detection antibody coated with near-infrared QDs (Nano-SPRi). In this study, the diagnostic potential of direct and amplified SPRi was assessed for measuring rhGH spiked in human serum and compared directly with the capabilities of a commercially available ELISA kit.

The proposed work assesses the diagnostic potential of direct and amplified surface plasmon resonance imaging (SPRi) assays, particularly for the detection of recombinant human growth hormone in spiked human serum, by comparing SPRi results directly with commercially available enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.

Spri, Nano-Spri ELISA Tahliller Kullanma Serum İnsan Büyüme Hormonu Karşılaştırmalı Analizi

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

Aynı odaklı mikroskopi ile ligand-aktif G protein-eşli reseptör özümseme tespiti

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

Methods Article

G Protein-Coupled reseptörleri Agonist Aktivitesi miktarının