SNX-BAR'lar insan hastalığında kilit rol oynayan membran remodeling proteinleridir. Yöntemlerimizi kullanarak, lipid bağlanmasını ve membran remodeling kolaylaştırmak için onların kesin biyofiziksel özelliklerini belirleyebilirsiniz. SNB-BAR proteinlerinin maya hücrelerinden arındırılması, yerli homo ve hetero SNX-BAR dimerlerinin elde edilmesine olanak sağlarken, yerli olmayan ifade sistemlerinde sıkça karşılaşılan toksisiteyi ve çözünmezliği en aza indirir.
Yöntemlerimiz tüm maya SNX-BAR'ların lipid özgüllüklerini anlamak veya başka bir organizmadan rekombinant SNX-BAR proteinleri üretmek için kullanılabilir. Ekstrüzyon işlemi sırasında lipozom kaybını önlemek için doğru bir ekstrüder montajı esastır. Başlangıç öğrencileri veya alana yeni başlayanlar için, en kritik adımları görsel olarak gözlemlemek başarı şansınızı büyük ölçüde artıracaktır.
Bir şişe içine maya hücrelerinin büyük bir bez aşılama ile başlayın standart YP orta 50 mililitre içeren kültürün hacmi en az dört kez bir karbon kaynağı olarak% 2 raffinose ve% 0.1 glikoz ile takviye ve 30 derece santigrat shaker bir gecede kültür büyümek. Ertesi sabah, standart YP orta bir litre 50 mililitre ön kültür aşılamak 2%raffinose ve% 0.1 glikoz bir 2.8 litre hacmi sallayarak inkübatör dört ila beş saatlik bir kültür için Fernbach şişesi şaşırttı. 600 nanometredeki optik yoğunluk 0.2'ye ulaştığında, sallanan kuluçka makinesinde bir gecede kültür için hücrelere %2'lik son konsantrasyona galaktoz ekleyin.
Ertesi sabah, santrifüj ile hasat hücreleri ve 50 mililitrekonik tüp içine maya pelet aktarın. Yaklaşık 30 mililitrelik son bir hacim elde etmek ve hücre süspansiyonu dört dereceye kadar soğutulmuş bir homogenizer yüklemek için 15 mililitre saflaştırma tamponundaki peleti yeniden askıya alın. Örnekleri 20-25,000 pound kare inç başına 2-3 mermi ve buz üzerinde yeni bir 50 mililitre konik tüp içine lysate aktarın lyse.
Hemen santrifüj ile hücre lysate temizleyin ve dikkatle yeni bir tüp içine supernatant aktarın. Daha sonra, igG Sepharose boncuk300 mikrolitre saflaştırma tampon üç yeniden süspansiyonlar ile dengeleyin dört derece santigrat dönen iki saatlik kuluçka için temizlenmiş hücre lysate boncuk eklemeden önce. Kuluçka sonunda, boncukları 10 mililitrelik kromatografi sütununa ekleyin ve bağlı olmayan lysate'nin akmasını bekleyin.
Boncukları yıkama başına bir mililitre yıkama tamponuyla 10 kez yıkayın ve bir sonraki hacmi eklemeden önce her yıkamanın tamamen akmasını bekleyin. Son yıkamadan sonra, bir mikrosantrifüj tüp içine boncuk aktarmak için bir pipet ve taze tampon kullanın. Boncukların toplam hacmini taze yıkama tamponuyla 500 mikrolitreye getirin ve boncukları mililitre başına 10 miligramlık iki mikrolitre tev protaz ile lysattan çıkarın.
Ertesi sabah, supernatant tamamen kaldırmak ve% 10 poliakrilamid SDS sayfası ile protein saflığını değerlendirmek için bir 27 gauge iğne kullanın. Daha sonra bradford protein testini kullanarak konsantre proteinleri standart protokollere göre ölçün ve proteini bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın. Lipozomları hazırlamak için, tabloda belirtildiği gibi % 1 fosfatitiklinositol-3-fosfat, %20 ergosterol, %30 fosfatidilserin, fosfatidilkolin karışımını elde etmek için stok lipitleri temiz bir cam kültür tüpüne aktarmak için cam şırıngalar kullanın.
Çözücülere bağlı olarak her bir lipid yeniden askıda kalır, karışım her lipidin eklenmesi yle bulutlu olabilir. Cam tüpün altındaki lipitleri eşit şekilde tedavi etmek için düşük akışlı azot gazını dairesel bir hareketle karışımlara yönlendirerek lipid karışımlarını dikkatlice kurutun. Daha sonra cam kültür tüpünü folyo ile sarın ve bir saat boyunca bir vakumda lipitleri daha da susuz bırakın.
Kuluçka sonunda, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bir girdap üzerinde orta hızda lipidler resuspend önce tamamen 2.5 milipozlar son lipozom konsantrasyonunda lipidler rehydrate için her şişe için bağlayıcı tampon 400 mikrolitre ekleyin. Lipidler yeniden askıya alındıkça tampon bulutlu hale gelmelidir. Bir mikrosantrifüj tüpü ne resuspended lipozomlar aktarın ve sıvı nitrojen tüpleri dondurma kardından 37 derece santigrat su banyosunda 7-8 kez çözülme.
Kimyasal bir duman kaputunda, şırınga başına üç kez kloroform tam hacimli iki mililitrelik cam şırınga temizleyin ve her şırıngaultrasaf su iki cilt ve bağlayıcı tampon iki hacim ile her şırınga dengeleyin. Üreticinin tavsiyelerine göre bir mini ekstrüder monte edin. Daha sonra iki adet filtre desteğini bir 200 nanometre lik membrana bağlama tamponunda batırın.
Mini ekstrüzyonu tamamen hava geçirmez olacak şekilde monte etmek önemlidir. Sızıntıları kontrol etmenin iyi bir yolu da arabelleği cihazdan geçirmektir. Filtre destekler için membran sandviç ve mini ekstrüder içine membran yerleştirin.
Bir mililitre şırınga denk bir kullanarak, mini ekstrüder aracılığıyla lipozom karışımıhacmine benzer bağlayıcı tampon hacmi geçmek ve mikrocentrifuge tüp ters lipozom karışımı damla diğer şırınga kullanarak kendi toplama için tüp kapağı içine lipozomların son toplamak için. Sonra 200 nanometre membran 19 ila 21 kez ile lipozomlar ekstrüzyon ve yeni bir mikrosantrifüj tüp içine ekstrüzyon lipozomları toplamak. SNX-BAR lipozom bağlama ve tubulation tahlillerini yapmadan önce, saflaştırılmış proteini ultrasantrifüj ile önceden temizleyin ve süpernatant'ı peleti bozmadan yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Daha sonra, saflaştırılmış SNX4-ATG20 dört mikromolar ve 30 santigrat derece 30 dakikalık kuluçka için 20 mikrolitre toplam reaksiyon hacmi lipozomlar 2.5 milipozlar kuluçka. Lipozom tubulation görselleştirmek ve ölçmek için, kuluçka sonunda, hemen bir karbon kaplı bakır örgü ızgara ve negatif leke üzerine% 1 uranyl asetat ile örnekleri nokta. Sonra 200 kilovolt bir iletim elektron mikroskobu üzerinde örnekleri analiz edin.
Lipozom bağlanması ve sedimantasyon için, reaksiyonun 20 mikrolitresini polikarbonat santrifüj tüpüne aktarın ve numuneyi ultra santrifüjde uyumlu bir yönlendirici ile döndürün. Santrifüj sonunda, dikkatle yeni bir mikrosantrifüj tüp supernatant aktarın ve SDS sayfa örnek tampon 40 mikrolitre pelet resuspend. Pelet süspansiyonu yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve supernatant'a 20 mikrolitre numune tamponu ekleyin.
Daha sonra %10 poliakrilamid SDS sayfa jeline eşdeğer numune hacimleri yükleyin ve lipozomlara bağlı SNX-BAR'ları görselleştirmek için Coomassie boyama yapın. SNX-BAR ekspresyonunun doğru indüksiyonu olup olmadığını kontrol etmek için, SNX-RER'lerin protein düzeyleri Coomassie lekesi ile tespit edilemeyebileceğinden, tandem afinite saflaştırma etiketine karşı batıda bir leke kullanılabilir. SNX-BAR heterodimer arındırılmasından sonra, iki SNX-BAR bantları bire bir stokiyometrik oranda görünmeli ve hiçbir kirletici bantları çok az olmalıdır.
Bu temsili analizde, SNX-BAR heterodimerleri ifade edildi, saflaştırılmış ve sentetik lipozomlara bağlı olarak gösterilmiştir. MVP1 homodimers oluşan ve beklendiği gibi bakteri ifade edildi unutmayın. SNX-BAR değişen lipozom bileşimlerine bağlanma, örneğin fosfatidilserinin lipozom bağlama üzerindeki etkilerini değerlendirmek için densitometri ile ölçülebilir.
Elektron mikroskobu görüntülemesi, genellikle 14 ila 26 nanometre arasında çapa sahip olan çoğu tübülile snx4-ATG20 lipozom tübüllerinin ölçülmesine olanak sağlar. Saflaştırılmış SNX-BAR'ların, tam montajların membran remodeling'i nasıl etkileyebileceğini anlamak için lipozomlarda kargo yakalama kompleksleri ile yeniden oluşturulabileceğini unutmayın. Saflaştırılmış SNX-BAR dimerlerinin farklı kombinasyonlarının farklı lipidlerden oluşan sentetik lipozomlarla bağlanması karşılaştırılırken, SNX-BAR proteinlerinin farklı lipid bağlama tercihlerine sahip olduğu saptandı.
Kloroform kullanırken her zaman bir başlıkta çalışın ve keskin liği veya cam malzemeyi kullanırken uygun PPE'yi taktığından emin olun.
