Bu çalışma Sağlık Araştırma Kanada Enstitüsü (CIHR) (MOP-97.774) ve Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Kurumu (: 480.619 NSERC, hibe nr) tarafından finanse edildi. KS KRESCENT Yeni Araştırmacı Ödülü (Kanada, Kanada Nefroloji Derneği ve Sağlık Araştırması Kanada Enstitüsü Böbrek Vakfı ortak bir ödül) Araştırma ve Yenilik Ontario Bakanlığı Erken Araştırmacı Ödülü&#39;nü almıştır. FW Li Ka Shing burs tarafından desteklenmektedir.

1. E. Dönüşüm pGEX-RhoA (G17A) Construct ile coli <ol><li> 100 ml dH 2 O da 2.5 g LB ve 1,5 g Agar eriterek LB-Agar hazırlayın Otoklav ve bir kural olarak, şişeyi rahatlıkla tutulabilir zaman bir tahmini 50-55 ° C, serin. </li><li> DH 2 O 50 mg / ml eriterek ampisilin (Amp) stok hazırlayın Şırınga filtre ve kullanılmayan alikotları dondurma. 1.1 LB-Agar Amp stoğu 100 ul (nihai konsantrasyon 50 ug / ml) eklenir. Karıştırın ve 10 cm bakteriyel yemekleri (15-20 ml / çanak) boşaltılıp girdap. Katılaşmaya (15-30 dak.) Ve 2-3 hafta boyunca 4 de ters kullanılmayan tabak ° C saklamak için izin verin. </li><li> E. dönüştürmek için Coli, hızlı bir şekilde, bir buz banyosu içinde DH5α yetkin bir hücre porsiyonunun çözünmesi. 25-50 ng / ml &#39;ye seyreltilerek pGEXRhoA (G17A) DNA&#39;nın 1 ul ekleyin. 30 dakika buz üzerinde karıştırmak ve inkübe için tüp hafifçe vurun. 45 saniye ile 2 dakika için geri buz üzerinde yer için 42 ° C de ısı şok. Ekle 900 &amp; mu; L SOC orta ve çalkalanarak 37 ° C&#39;de bir saat boyunca büyür. </li><li> Boynu bükük steril Pasteur pipeti kullanarak LB-Agar-Amp plaka üzerinde dönüştürülmüş bakteri 50-100 ul yayıldı. 5 dakika 37 ° C inkübatör içinde plaka sağ tarafı yukarı inkübe edin ve sonra ters ve geceleme büyür. </li><li> Tek bir koloni GST-etiketli protein (adım 2.1) hazırlanması için plakadan alınacak. Gelecekte kullanmak için, şal ve plakları yaklaşık 3 hafta boyunca 4 ° C de ters. Buna ek olarak, bakteriyel stokları çalkalama ile 37 ° C de bir gece 2 ml steril LB-Amp büyüyen bireysel koloniler daha uzun süreli depolama için hazırlanabilir. -80 Azından 1:1 oranında ve dondurucuda steril% 80 gliserol ile bir alikotu karıştırın ° C. </li></ol> 2. GST-RhoA (G17A) Boncuk hazırlanması <ol><li> 1 L dH 2 0 ile 25 g LB ekleyerek ve otoklavlayarak LB hazırlayın. Soğuyunca stoktan 50 ml LB (50 mg / ml son konsantrasyon) için 50 ul Amp ekleyin. Iyi izole col ile inoküledönüştürülmüş bakteri ony ve ajitasyon ile 37 ° C&#39;de gece boyunca büyür. Tam yoğunluk (OD 600&gt; 1.0) az 450 ml LB-Amp ile sulandırmak ve 37 ek bir 30 dakika Büyüyünce ° C </li><li> 10 ml dH 2 O içinde 0.238 g eriterek İzopropil BD-thiogalactopyranoside (IPTG) bir 100 mM stok solüsyonu hazırlayın -20 ° C&#39;de alikotları Mağaza 500 ml&#39;lik kültür (100 uM&#39;lik bir son konsantrasyon) ile IPTG 500 ul 100 mM ekleyerek Rho protein Bakteriler üretmek için indüklemek. 22-24 sıcaklık azaltın ° C ~ 16 saat saat boyunca büyür. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle 3600 g&#39;de kültürü Spin Gerekirse, 500 ml kültürü santrifüj için 50 ml&#39;lik tüplere ayrılabilir. -80 En az 1 saat (ya da tercihan bir gece boyunca) için donma pelet (ler) i ° C. </li><li> 20 mM HEPES (0.95 g) / pH 7.5 ihtiva eden 200 ml lizis tamponu hazırlamak; 150 mM NaCl (1,75 g), 5 mM MgCl2 (0,203 g),% 1 TX-100 (2 ml) eklenmiştir. 1M DTT (10 ml dH 2 O içinde 1.542 g stok çözeltileri hazırlayın) Ve 100 mM PMSF (0,174 g/10 mL EtOH). Lizis tamponu + hazırlamak için, 1 mM DTT (stok 10 ul) ve 1 mM PMSF (stok 100 ul) ve bir Komple Mini Proteaz İnhibitör tablet ile 10 ml&#39;ye tamamlayacak. </li><li> Buz üzerinde çalışarak, 10 ml lizis tamponu eklemek + adım 2.3 &#39;peletlerine. Nazik vortekslendi, pipetleme iyice süspanse edin. Köpük kaçının. % 50 darbe ile 4 ayarı 1 dakika için buz üzerinde sonikasyon. 4 ° C&#39;de 15 dakika süreyle 15.000-20.000 g&#39;de sonike lizat dönerler ve steril bir kapatılmış 15 ml tüpüne açıklık sonikasyon (süpernatan) kaldırın. </li><li> Yavaşça 15 ml tüp içine% 75 bulamaç ve transfer 335 ul içeren orijinal tüp karıştırarak Glutatyon Sepharose hazırlayın. Boncuk Pipeti için geniş bir delik ucu kullanın. 10 ml soğuk PBS ekleyin ve 4, 5 dakika boyunca 500 g dönmeye ° C. , Süpernatant atın boncuk 1 ml lizis tamponu + eklemek ve önceki yıkama gibi dönerler. % 50 bulamaç yapmak için süpernatan ve eklenti lizis tamponu + atın. </li><li> Equil 250 ul ekleAdım 2.5 den süpernatan için boncuk bulamaç ibrated. 45 dakika boyunca 4 ° C&#39;de dönerler. </li><li> 20 mM HEPES (2.38 g) ihtiva eden 500 ml HBS / pH 7.5 ve 2 dH O., 150 mM NaCl (4.38 g) hazırlanmak 1M MgCl2 (10 ml dH 2 O 0,952 g) ve 1 M DTT (10 ml dH 2 O 1,542 g) bir stok çözelti hazırlamak. HBS + hazırlamak için, 100 ml takviye sadece 5 mM MgCl2 (stoktan 50 ul) ve 1 mM DTT (stoktan 100 ul) ile kullanmadan önce. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 g&#39;de adım 2.7 den boncuklar Spin 10 ml lizis tamponu + 2x süpernatan ve yıkama boncuk atın ve 10 ml HBS + ile 2x. Nihai yıkamadan sonra, HBS olarak boncuklar + BD BaculoGold proteaz inhibitörü (BD 50x BaculoGold / ml, 20 ul) ile desteklenmiş resuspending bir 50% bulamaç. </li><li> Β-merkaptoetanol içeren 2x Laemmli numune tamponu ile son boncuk hazırlık 10 ul sulandırınız. Bovine Serum Albumin (BSA) standartlarına olun. 2 mg / ml stok (1 BSA 0.02 g kullanın0 ml dH 2 O). DH 2 O ve 10 ul Laemmli (son 10 mikrogram) 5 ul stoku 5 ul; ve 7.5 ul dH 2 O ve 10 ul Laemmli 2.5 ul stoku 10 ul Laemmli (son 20 mikrogram) ile stok 10 ul Mix (5 ug final). Tüm örnekler (5 dakika) kaynatın. Boncuk örnek Spin ve% 10&#39;luk SDS-poliakrilamid jel BSA standartları ve molekül ağırlığı işaretleri ile süpernatant çalıştırın. </li><li> Ve destain çözeltisi (500 ml dH 2 O, 400 ml metanol ve 100 ml asetik asit) (10 ml asetik asit, 40 ml metanol ve 50 ml dH 2 O 0.1 g) Comassie mavi boya hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın. 20-30 dakika jel leke, boya kaldırın (birden çok kez tekrar kullanılabilir) ve iki kez destain çözümü ile durulayın. Bantlar net bir şekilde görülebiliyor kadar birkaç saat hafif sarsıntı ile destain devam edin. </li><li> Referans (Şekil 2) olarak BSA kullanılarak standart boncuklar akuple GST-RhoA (G17A) konsantrasyonunu tahmin. Aliquo1.5 ml mikro santrifüj tüplerine ~ 10-15 mikrogram protein içeren boncuk t eşit hacimde. Deposunda boncuklar 4 ° C sıcaklıkta bir gün içinde kullanıma. -80 ° C&#39;de donarken HBS C birkaç gün içinde kullanıma 3:1 oranında + / gliserol. </li></ol> 3. Nükleotid-free RhoA (G17A) Boncuk ile GEF Pulldown Testi <ol><li> Birleştiği 10 cm yemekleri hücreleri büyümek. Serum en az 3 saat boyunca mahrum ve gerektiği gibi davranın. </li><li> Lizis tamponu hazırlayın + adım 2.4 gibi. 700 ul / çanak artı hataları pipetleme sağlamak için bazı ekstra miktarı kadar lizis tamponu hazırlayın. Kullanmadan önce proteaz inhibitörleri ekleyin. </li><li> Buz üzerinde çalışarak, yemeklerin kültür ortamı çıkarın ve buz gibi soğuk HBS ile yıkayın. Bütün HBS çıkarın ve her yemek için 700 ul lizis tamponu + ekleyin. Tüm alanlarını kapsayacak girdap plakalar, kazıyorum ve numaralı 1.5 ml tüpler içine lizatları toplamak. 4 az 1 dakika ° C için 15,000 g Spin Süpernatant deneyi için kullanılacaktır. </li><li> Cep numarası tüm eşdeğer iseyemekleri test ediliyor, bir protein testi yapıyor atlarsanız, ve 3.5 adıma taşıyabilirsiniz. Aksi takdirde Bio-Rad hızlı protein metodu kullanarak her süpernatan protein konsantrasyonu ölçmek ve hacim ve konsantrasyon için supernatant eşitlemek. Toplam protein miktarı (LLC-PK1 hücrelerinde için tipik olarak 1-1,5 mg protein) kullanılır hücre tipleri bağlıdır. </li><li> Laemmli numune tamponu, kaynatın azaltarak 30 ul 2x her süpernatan ve karıştırın 30 ul çıkarın ve adım 3.7 için bir kenara koyun. Adım 2.12 GST-RhoA (G17A) boncuk hacimde kalan süpernatantlar ekleyin. 4 ° C&#39;de 45 dakika süreyle döndürmek </li><li> 4 ° C&#39;de 10 saniye süreyle 6800 g boncuk Spin Süpernatant atın ve yıkama arasında aynı şekilde iplik, lizis tamponu ile 3x boncuklar yıkayın. Tamamen bir 30 G iğne ile donatılmış bir 1 cc şırınga kullanarak nihai yıkama kaldırmak ve Laemmli örnek arabelleğini azaltarak 20 ul 2x ekleyin. 5 dakika kaynatın. Pelet boncuk Spin ve ya hemen süpernatant çalıştırın (tercihen) veya saklayabilirsinizt -80 ° C daha sonra analiz için. </li><li> Eğer okuyan GEF boyutu için uygun bir yüzdesi SDS-poliakrilamid jel üzerinde, 20 ul toplam hücre lizatları ve çöken protein numunelerin hepsi çalıştırın. Batı spesifik bir antikor kullanarak blotting ile seçtiğiniz GEF algıla. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Kısım 1 ve protokolün 2 SDS-PAGE ile (Şekil 1 protokolünün anahat bkz) tarafından GSH-Sepharose boncuklar ve test akuple GST-RhoA (G17A) hazırlanması açıklanmaktadır. Tipik bir Coomassie lekeli jel Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Elüsyonlanan protein ile numune yaklaşık 50 kDa (Şekil 2, şeritli 6) tek bir şerit içermelidir. Protein konsantrasyonu BSA referans örnekleri kullanılarak tahmin edilebilir. Şekil 2, örnek olarak, RhoA (G17A) konsantrasyonu 15 ul μg/10 olduğu tahmin edilmektedir. Böylece, 10 ul / tüp alikotları hazırlandı. Tipik verim<html> Elimizde 10 ml bakteriyel lizis 15-20 mikrogram proteindir. Protokol Bölüm 3 afinite yağış assay (Şekil 1 genel bakış) açıklar. Değişim faktörü GEF-H1 aktivasyonu tespit başarılı GEF tahlil Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. RhoA (G17A) proteini GEF-H1 bazal aktivite olduğunu düşündüren, kontrolü (işlenmemiş) hücre lizatları bazı GEF-H1 ele geçirdi. Miktarı ise TNF-α GEF-H1 5,7 aktive olduğu görüşüyle ​​tutarlı inflamatuvar sitokin TNF-α (TNF-α) ile tedavi edilen hücrelerde artış, hızlandırdı. Önemlisi, toplam hücre lizatları tedavi GEF-H1 seviyelerini değiştirebilir olmadığını düşündüren, kontrol ve tedavi örnek GEF-H1 benzer miktarlarda göstermek ve analizinde kullanılan girdi eşittir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> Şekil 1. Protokol bakış. ove_content &quot;&gt; <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> Şekil 2. Boncuk hazırlık protokolü Temsilcisi sonucu. Başarılı GST-RhoA (G17A) boncuk hazırlanması ile bir Coomassie lekeli jel gösterilmiştir. Boncuk örnek ve BSA protein standartları% 10 akrilamid jel kullanılarak SDS-PAGE ile ayrıldı. Boncuklar test etmek için, GST-RhoA (G17A) ihtiva eden nihai bulamaç boncuk 10 ul 5 dakika boyunca Laemmli numune tamponu ve kaynatılmış azaltılması ile 01:01 seyreltilir. Boncuklar kısaca eğrilmiş ve süpernatan jel üzerinde yüklendi. Aşağıdaki örnekler yüklendi: Hat 1: moleküler ağırlık belirteci (MW) (FroggaBio BLUeye protein merdiven prestained); Lanes 2-4: 5, 10 ve 20 mikrogram (BSA) Bovine Serum Albumin; Lane 5 boş; Lane 6: 10 taze hazırlanmış RhoA (G17A) boncuk ul. Ayırma işlemi tamamlandıktan sonra, jel Coomassie Blue kullanılarak lekelenmektedir ve daha sonra proteinler ortaya çıkarmak için destained edilir. GST-RhoA (G17A) proteini moleküler ağırlığı yaklaşık olarak 50<html> 48 kDa marker seviyesi civarında kDa ve çalışır. Bu özel örnekte GST-Rho protein konsantrasyonu 15 ul μg/10 bulamaç olduğu tahmin edilmektedir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> GEF-H1 TNF-α-indüklenen aktivasyonu gösteren Şekil 3. Temsilcisi GEF aktivasyon testi. Konfluent LLC-PK1 hücrelerinde 5 dakika için 10 ng / ml TNF-α ile muamele edildi. Tedavi sonrası hücreleri parçalanır edildi ve aktif gefs GST-RhoA (G17A) bağlı boncuklar kullanılarak çekilen. Çöken proteinler (üst leke) ve total hücre lizatı örnekleri (alt leke) olarak GEF-H1 varlığı Batılı bir anti-GEF-H1 antikor (Hücre Sinyalizasyonu) ile kurutma ile tespit edildi. Başarılı bir sonuç gösteren, eşdeğer girişlerine göre arıtılmamış hücreleri karşı TNF-α-tedavi edilen çöken GEF-H1 artan miktarda unutmayın. 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; Şekil 4. Bir &quot;kötü sonuç&quot;. GEF açılan assay burada gösterildiği boncuklar tarafından yakalanan bazı GEF-H1 sonuçlanmıştır rağmen, miktarda kumandadan çöktürüldü ve TNF-α-tedavi edilen hücreler aynıdır. Böylece, TNF-α, bu durumda GEF-H1 bir Know aktivatörü aktivasyon neden olmadı. Bu özel deney sonraki sorun giderme kullanılan TNF-α yeterince taze ve muhtemelen bozuk olmadığını ileri sürdü.

<ol>
	<li>Jaffe, A. B., Hall, A. R. h. o. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases:+biochemistry+and+biology.">GTPases: biochemistry and biology.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269 (2005).</li><li>Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF+means+go:+turning+on+RHO+GTPases+with+guanine+nucleotide-exchange+factors.">GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167-180 (2005).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li><li>Garcia-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+activated+GAPs+and+GEFs+in+cell+lysates.">Analysis of activated GAPs and GEFs in cell lysates.</a> Methods Enzymol. 406, 425-437 (2006).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF-H1+Mediates+Tumor+Necrosis+Factor-{alpha}-induced+Rho+Activation+and+Myosin+Phosphorylation:+role+in+the+regulation+of+tubular+paracellular+permeability.">GEF-H1 Mediates Tumor Necrosis Factor-{alpha}-induced Rho Activation and Myosin Phosphorylation: role in the regulation of tubular paracellular permeability.</a> J. Biol. Chem. 284, 11454-11466 (2009).</li><li>Waheed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal+regulated+kinase+and+GEF-H1+mediate+depolarization-induced+Rho+activation+and+paracellular+permeability+increase.">Extracellular signal regulated kinase and GEF-H1 mediate depolarization-induced Rho activation and paracellular permeability increase.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. , (2010).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+mediates+tumor+necrosis+factor-alpha-induced+activation+of+the+ERK/GEF-H1/RhoA+pathway+in+tubular+epithelium.">The epidermal growth factor receptor mediates tumor necrosis factor-alpha-induced activation of the ERK/GEF-H1/RhoA pathway in tubular epithelium.</a> J. Biol. Chem. 286, 9268-9279 (2011).</li><li>Garcia-Mata, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+a+GEF+by+its+tail.">Catching a GEF by its tail.</a> Trends Cell Biol. 17, 36-43 (2007).</li><li>Dubash, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+RhoA+localizes+to+the+nucleus+and+is+activated+by+Net1+and+DNA+damage+signals.">The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals.</a> PLoS One. 6, e17380-e17380 (2011).</li><li>Guilluy, G., Dubash, A. D., Garc&#237;a-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RhoA+and+Rho+GEF+activity+in+whole+cells+and+the+cell+nucleus.">Analysis of RhoA and Rho GEF activity in whole cells and the cell nucleus.</a> Nature Protocols. , (2011).</li><li>Guilluy, C., Swaminathan, V., Garcia-Mata, R., O'Brien, E. T., Superfine, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins.">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nature Cell Biology. 13, 722-727 (2011).</li><li>Dubash, A. D., Wennerberg, K., Garcia-Mata, R., Menold, M. M., Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Lsc/p115+RhoGEF+and+LARG+in+regulating+RhoA+activity+downstream+of+adhesion+to+fibronectin.">A novel role for Lsc/p115 RhoGEF and LARG in regulating RhoA activity downstream of adhesion to fibronectin.</a> J. Cell Sci. 120, 3989-3998 (2007).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada anlatılan yöntem hücrelerinde gefs aktif havuz takip edebilir gefs için kullanılabilir radyoaktif olmayan aktivasyon tahlil oluşturmaktadır. Aşağıdaki deney, küçük GTPases aktivasyon gibi Rac ve Cdc42 karşı gefs için kullanılan çöktürme deneyleri ile benzerdir. Bu testler, farklı GST-etiketlenmiş proteinleri kullanmak ve burada açıklanan birinden ufak farklar vardır, ancak bazik adımları aynıdır. Dolayısıyla, bu protokol kolayca diğer küçük GTPaz ve GEF aktivasyon deneyleri için adapte edilebilir. Sunulan GEF deneyi son zamanlarda nükleer kesirler 9,10 başvurusu için güncellenmiştir. Daha fazla değişiklik ile, diğer Subselüler bölümlerinde GEF aktivasyon testi de mümkün olabilir. Biz epitel hücre hatları 5,6,7 yılında gefs aktivasyonunu incelemek için sunulan yöntemini kullanın. Bazı iyileştirme sayesinde, bu tahlilde herhangi bir hücre hattından gefs tespit etmek için yeterli olmalıdır. Zaman adaptiBelirli bir hücre türüne ng, test edilecek GEF için optimum hücre sayısı, lizis tamponu hacmi ve algılama yöntemi (Western blot için iyi bir antikor önemli edilir) bulabilirsiniz. Testin ilk kurulum için bu ilgi GEF etkinleştirmek için bilinen bir uyarıcı kullanımı önerilir. Bilinmeyen bir uyaran kullanırken, her zaman tahlil çalıştığını doğrulamak için, pozitif kontrol kullanın. Bu testte Western blot ile bilinen gefs aktivasyonu tespit etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu bilinmeyen gefs tanımlamak için de uygundur. Bunun için, kontrol ve teşvik örneklerinden yakalanan gefs bir Coomassie lekeli jel üzerinde analiz edilmelidir. Sadece uyarılan örnekleri görünür Gruplar aktive gefs içerebilir ve kütle spektrometresi (örneğin 5) tanınmanız için gönderilebilir. Son olarak, uyarıcı bir not. Testi aktif gefs render posttranslasyonel değişiklikler hücre parçalama sonra korunmuş olduğu varsayımına dayanmaktadır. Nitekim, bu açıkça cagefs bir dizi se, ve kuruluşlar, çünkü bu tahlilde GEF-H1, p115RhoGEF ve XPLN (örn. 5,11,12,13) ​​dahil olmak üzere farklı gefs, aktivasyonu tespit etmek için çeşitli gruplar tarafından kullanılmaktadır. Etkin devlet korunması ancak tüm gefs durumunda olay değildir ve bu nedenle bu testte tüm gefs için işe yaramaz olduğunu düşünülebilir. Ayrıca, çok sayıda gefs birden fazla küçük GTPases doğru aktivitesinin olduğu, not edilmelidir. Bu nedenle, belirli bir GEF, incelendiğinde, bu RhoA, Rac1 ve Cdc42 inceleyerek diğer küçük GTPases gibi fonksiyonel çalışmalar için GEF çöktürme deneyleri ile bu tahlilde tamamlamak üzere tavsiye edilir. Protokol Kritik adımlar: Dönüştürülmüş bakteri kolonileri Amp, iyi üremeyi ve verim tarafından yeterli seçimini sağlamak için taze, düzgün hazırlanmış plakalar aldı edilmelidir. Diğer kaynaklardan alınan yetkin hücreleri için bir dönüşüm koşullarına göre değişebilir ve danışılmalıdır. </p&gt; Protein hazırlanması protokolü (adım 2.3 &#39;) ve deney (adım 3.2) her adım ° C&#39;ye soğutulmuş çözeltiler ve santrifüj ile 4 yapılmalıdır. Bakteriyel lizis (adım 2.5) homojen bir süspansiyon elde etmek için tam ve eksiksiz olmalıdır. Bakteriler, vorteks parçalama ve 4 ° C&#39;de muhafaza ederken bu, dönüşümlü olarak lizat pipet ve sonikasyon protein denatüre önlemek için buz üzerinde yapılır temin zaman. Sonikatör farklı bir model kullanılarak ise, koşulları ayarlanabilir gerekebilir. Boncuklar ile sonikasyon inkübasyonu her zaman yeterli bağlayıcı sağlamak için bir rotator üzerine 4 ° C de yapılmalı ve bakım zamanlaması tutarlı olmasına dikkat edilmelidir. GST-Rho mutant bakteri ifade zaman biraz kararsız, bu yüzden hemen veya birkaç gün içinde hazır boncuk kullanmak en iyisidir. Yağış assay (Bölüm 3), zaman ve sıcaklık duyarlı biraktif GEFS kolayca hücre lizatı kayıp olabilir, bu nedenle adımları en kısa sürede yapılmalıdır. Aşağıdaki bölümde, bazı sorun giderme ipuçları içermektedir. No veya nihai boncuk hazırlanmasında mutant Rho proteininin çok düşük bir miktarda: Bu verimsiz bir indüksiyon, bakteri yeterli parçalanma veya hazırlama işlemi veya depolama sırasında protein kaybına neden olabilir. Bu olasılıkların bazı gidermek için, bakteri örnekleri indüksiyondan önce ve sonra analiz edilebilir. Protein taze çizikli plakadan veya yeniden dönüştürülmüş yetkili hücrelerinden bir koloni kullanarak işlemi tekrarlayın kötü indüksiyon varsa. Farklı IPTG konsantrasyonları ve indüksiyon kez de test edilmelidir. Lizis lizis tamponu içinde tuz ve deterjan konsantrasyonları değişen (yani proteini yerine süpernatan pelet içinde kalır) yetersiz ise denenebilir. Alternatif sonikasyon süreleri veayarları düşünülmelidir ve sonication önce ve sonra numuneler erimesinin etkinliğini belirlemek için mikroskop ile kontrol edilebilir. Hayır GST-protein boncuklar üzerinde mevcut olmasına rağmen, GEF çöktürülür: Bu yağış tahlil sırasında teknik sorunlar nedeniyle, ya da uygulanan teşvik kullanarak okudu GEF aktivasyon gerçek yokluğu olabilir. Her zaman tahlil çalıştığını doğrulamak için pozitif kontrol olarak bilinen bir uyarıcı kullanın. Birkaç gün içinde hazır boncuk kullanın. Çöktürme assay tüm koşullarda çalışılan GEF saptanamaz miktarda yakalar durumunda, GEF bulunur ve assay (adım 3.3) için kullanılacak olan santrifüjlemeden sonra üstte yüzen madde içindeki kadar, algılanabilir olduğunu doğrulamak. Tüm tamponları ve proteaz inhibitörleri taze ve mümkün olduğunca hızlı buz tüm adımları uygulayın emin olun. Giriş protein (2 tabak / örnekten lizatları kullanarak gibi) miktarını artırın. Yağış tahlil bazal çökelme gösteriyorsaLütfen GEF kalmış, ama hiçbir fark kontrolü ve uyarılan örnekleri (Şekil 4) arasında görülür, uygulanan teşvik bilinen diğer etkileri (diğer sinyal yollarının aktivasyonu tespit ederek örneğin) kullanarak çalıştı doğrulayarak gidermeye başlamak. Tedavi şartları ve / ya da konsantrasyonları değişen düşünün. Lütfen uyaran olasılıkla süreleri ve konsantrasyonları tahmin Rho veya diğer sinyal aktive nasıl edebiyat raporlama verilerine güvenin. GEF aktivasyon iyi tespit Rho aktivasyon öncesinde bir zaman noktasında iyi tespit olabileceği gibi tedavi süresi optimize ederken, hem kısa hem de uzun zaman noktalarını kullanın. Son olarak, aynı uyaran kanal adedi sebep olduğu hücre duyarlılığında bir değişiklik nedeniyle aktivasyonunun bir değişken derecesi, konfluent hücresi, vs sonuçlanabilir

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> pGEX-RhoA (G17A) </td><td> Addgene </td><td> Yakında hazır olacak </td><td> Dr Keith Burridge (North Carolina Üniversitesi) (ref 3) laboratuvarı oluşturuldu </td></tr><tr><td> DH5α </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> Mağaza -80 ° C </td></tr><tr><td> SOC orta </td><td> BioShop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> BioShop </td><td> LBL407.1 </td><td> Steril tutun </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> BioShop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td> Ampisilin </td><td> BioShop </td><td> AMP201.25 </td><td> -20 ° C&#39;de Mağaza stok </td></tr><tr><td> Agar </td><td> BioShop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (Isopropil BD-thiogalacto-pyranoside) </td><td> Calbio-kimya </td><td> 420322 </td><td> -20 ° C&#39;de deposunda stok solüsyonu </td></tr><tr><td> Glutatyon Sepharose boncuk </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> SIGMA </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> SIGMA </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> SIGMA </td><td> M-9272 </td><td> Hemen önce kullanın ekle </td></tr><tr><td> TX-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td> Hemen önce kullanın ekle </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> SIGMA </td><td> P-7626 </td><td> Hemen önce kullanın ekle </td></tr><tr><td> Proteaz İnhibitör 50x </td><td> BD Baculo-Altın </td><td> 51-21426Z </td><td> Hemen önce kullanın ekle </td></tr><tr&gt; <td> Komple Mini, EDTA serbest 10x </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td> Hemen önce kullanın ekle </td></tr><tr><td> Laemmli Örnek Tampon 2x </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> SIGMA </td><td> M7154 </td><td> Hemen önce kullanın ekle </td></tr><tr><td> Coomassie Brillant Blue </td><td> Bio-Rad </td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td> Asetik asit </td><td> Caledon </td><td> 1000-1 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Caledon </td><td> 6701-7 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Rad Protein Testi </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> BLUeye merdiveni </td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Reaktifler kullanılır. <table border="1"><tbody><tr><td> Ekipman Adı </td><td> Şirket </td&gt; <td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> RC-5B santrifüj </td><td> Sorvall </td><td> SS-34 Rotor </td><td> 4 az kullanın ° C </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Sorvall-Thermo Scientific </td><td> ST-16R </td><td> 4 az kullanın ° C </td></tr><tr><td> Mikro santrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> 4 az kullanın ° C </td></tr><tr><td> Bakteriyel çalkalayıcı </td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG, CH-1403 Bottmingen </td><td> 37 ° C&#39;de 22 ya da kullanmak ° C </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td> Branson </td><td> Sonifier-450 </td><td> RT de kullanın </td></tr><tr><td> Rotator </td><td> Glas-Col </td><td> 099A CR4012 </td><td> 4 az kullanın ° C </td></tr></tbody></table> Kullanılan Tablo 2. Özel ekipmanları.

affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates

Küçük GTPases ve Rho ailesinin Proteinler hücre iskeletinin merkezi düzenleyiciler, ve hücre göçü, gen ekspresyonu, hücre döngüsü sürecinde ve hücre yapışması 1 gibi hücresel süreçleri büyük bir çeşitlilik, kontrol. Rho proteinleri GSYİH bağlı devlet GTP bağlı ve inaktif aktif olan moleküler anahtarları vardır. Onların aktivasyon Guanin nükleotid Değişim Faktörü (GEF) bir protein ailesi tarafından aracılık edilir. Rho-GEFS özgüllük 2 örtüşen, büyük bir aile oluşturur. Pek çok gelişme belirli sinyalleri aktive gefs belirleme yapılmış olmasına rağmen, bu proteinlerin yol özgü düzenlenmesi ile ilgili kalan birçok soru hala vardır. Rho-gefs sayısı 70 aşar, ve her bir hücre, birden fazla GEF proteini ifade eder. Ayrıca, bu proteinlerin birçok Rho sadece etkinleştirmek, ancak ailenin diğer üyeleri, düzenleyici ağların karmaşıklığı daha fazla katkıda bulunacak. Önemlisi, keşfetmeknasıl gefs düzenlenir farklı stimuli ile aktif hale hücrelerinin tek tek gefs aktif havuz izlemek için bir yöntemi gerektirmektedir. Burada bir yakınlık yağış testi kullanılarak kullanılabilir aktif Rho özgü gefs değerlendirmek ve ölçmek için kullanılan bir yöntem için bir adım-adım protokol sağlar. Bu tahlil Burridge laboratuar 3,4 birkaç yıl önce geliştirilen ve böbrek tübüler hücre hatları 5,6,7 kullanmıştır. Testi aktif gefs için yüksek afiniteli bir &quot;nükleotid özgür&quot; mutant RhoA yararlanır. Mutasyon (G17A) GSYİH veya GTP ve bu devletin GEF bağlı ara durumda taklit bağlamak için protein yapamaz hale getirir. Bu mutan protein A GST-etiketli versiyonu ifade ve E. arındırılan coli, glutatyon Sepharose boncuk bağlı ve tedavi edilmezse ve uyarılmış hücre lizatları aktif gefs çöktürmek için kullanılır. En GEFS inhibitör bağlamaları gelen posttranslasyonel değişiklikler veya yayın, onların aktif devlet aracılığıyla aktive olarakHücre lizatlarının muhafaza edilir, ve bunlar bu tahlilde 8 ile tespit edilebilir. Yakalanan proteinler Western blot kullanarak spesifik antikorların saptanması ile bilinen gefs için probed, ya da belirli uyaranlarla aktive bilinmeyen gefs tanımlamak için kütle spektrometresi ile analiz edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates at JoVE.com

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

Burada anlatılan yöntem aktive gefs için yüksek afinitesi olan bir mutantı RhoA GST füzyon proteini yararlanarak kültürlenmiş hücrelerde RhoA spesifik GDP / GTP Değişim Faktörleri (gefs) aktivasyonu takip etmek için bir ölçüm açıklanmaktadır. GEFS Western blot ve dansitometreyi miktarı tespit hücre lizatları, çöktürülmesi ile elde edilir.

Epitel Hücre lizatları bir GST-etiketli Mutant Rho Protein (GST-RhoA (G17A)) Kullanarak Active Rho-gefs ve Affinity Yağış

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

affinity-precipitation-active-rho-gefs-using-gst-tagged-mutant-rho

Research

JoVE Journal

Biology

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

16.5K Görüntüleme.  St. Michael's Hospital. Burada anlatılan yöntem aktive gefs için yüksek afinitesi olan bir mutantı RhoA GST füzyon proteini yararlanarak kültürlenmiş hücrelerde RhoA spesifik GDP / GTP Değişim Faktörleri (gefs) aktivasyonu takip etmek için bir ölçüm açıklanmaktadır. GEFS Western blot ve dansitometreyi miktarı tespit hücre lizatları, çöktürülmesi ile elde edilir.

Video: Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Biyoloji

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Helios Gen Tabancası kullanarak Soğan Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Hücresel lizatları Multiprotein Kompleksleri Analizi Mavi Native Poliakrilamid Jel Elektroforez (BN-PAGE)

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Yüksek Aktif Maya Ribozomlar Kromatografik Arıtma

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Transgenik Kemirgen Deneyi sayısallaştırabilmek Erkek Germ Hücre Mutant Frekans

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...