Bu yöntemler C.elegans stres yanıtlarını karakterize etmek ve genetik veya farmakolojik pertürbations koruyucu hücresel yolların aktivasyonunu etkileyip etkilemediğini belirlemek için kullanılabilir. Bu yöntemler, gen nakavtı gibi yüzlerce tedirginliğin hem moleküler hem de fizyolojik düzeyde hızlı ve yüksek iş elde etme testine olanak sağlar. Tamanın düzgün yapıldığından emin olmak için pozitif ve negatif denetimler ekleyin.
Sağlıklı, iyi beslenmiş hayvanları uygun aşamaya senkronize edin ve deney için taze tabaklar kullanın. Solucanların mikromanipülasyonunun bir kazma ile görselleştirilmesi, yeni kullanıcıların solucanların nasıl dizilmiş ve canlılık açısından değerlendirilebileceğini anlamalarına yardımcı olabilir. Prosedürleri gösteren Phil Frankino, Holly Gildea ve Melissa Metcalf, laboratuvarımızda yüksek lisans öğrencileri olacak.
Endoplazmik retikulum aktivasyonu için ısı şok proteini dört organizatörü altında GFP ifade hayvanları kullanmak için protein yanıtı ortaya çıktı, L4 aşamasına kadar 20 derece santigrat senkronize muhabir hayvanlar büyümek ve M9 orta kullanarak plaka solucanları yıkayın ve bir tüp içine transfer. Solucanları santrifüj le topladıktan sonra, Kontrol hayvan tüplerinde M9'daki ilgi ilacının mililitresi başına 25 nanogram veya M9'da meçtil sülfoksit ile M9'u değiştirin. Daha sonra solucanları 20 santigrat derecede 3-4 saat döner bir platforma yerleştirin.
Kuluçka sonunda, sadece 15 mililitre M9 ile tedavi çözeltisi değiştirmeden önce yerleşmek için solucanlar santrifüj. İki yıkamadan sonra, hayvanları uygun şekilde NGM plakalarına veya NGM RNA girişim plakalarına aktarın ve solucanların bir gecede 20 santigrat derecede iyileşmesini bekleyin. Solucanlar iyileştiğinde, bakteri içermeyen standart bir NGM plakasına 100 milimolar sodyum azitin 5 ila 10 mikrolitresini ekleyin ve bir parçalama mikroskobunun altına bir tabak solucan yerleştirin.
10-20 hayvanı tabaktan sodyum azit noktasına aktarın. Hayvanlar tuz çözeltisi indikten kısa bir süre sonra hareket ele geçirmelidir. Sodyum azit buharlaştıktan sonra, tüm hayvanlar için ön ve arka yanlarla istenilen görüntüleme düzeninde hayvanları hizalayın ve hemen bir stereo mikroskop altında hayvan plakayerleştirin.
Stereo mikroskop görüntüleme yazılımını başlatın ve satın almalar sekmesi altında, yeni bir proje açmak için projeleri ve klasörü açın' ı tıklatın. Klasörü yeniden adlandırmak için sağ tıklatın ve yeniden adlandır'ı seçin. Solucan örneğini mikroskop hedefinin altına yerleştirin ve floresan ağartmayı en aza indirmek için solucanların doğru odak noktasını bulmak için Brightfield ayarını kullanın.
Örneğin merkezi, yumurta çizgisinin açıkça görülebilen ve bulanık olmadığı nokta olacaktır. Piksellerin doygun olmadığından emin olmak ve sinyalin algılama sınırının üzerinde olduğundan emin olmak için pozlama süresini ayarlayın. Pozlama süresini, yakınlaştırmayı, netleştirme ve Brightfield kondansatörlerini uygun ayarlara ayarladıktan sonra, görüntü elde etmek için görüntü yakalama düğmesini tıklatın.
Bileşik geniş alan mikroskobu kullanarak görüntüleme için, anapara kontrol işlem plakasını bileşik geniş alan mikroskop aşamasına yerleştirin ve kontrol programını başlatmak için dokunmatik yüzeyi kullanın. Yeni bir albüm ve dosya adı oluşturun ve plakayı objektif lensin altına yerleştirin. Sinyalin görünür olmasına ancak doymamış olması için pozlama süresini ve floresan yoğunluğunu ayarlamak için taban çizgisi kontrol ve pozitif kontrol plakalarını kullanın.
Ardından Brightfield ve GFP FITC görüntülerini kaydedin. Büyük parçacık akış sitometrisi ile muhabirin indüksiyonölçmek için, ilk sitometre lazerler açın ve sitometre yazılımı açın. Yazılım penceresindelazerleri açmak için başlat'ı tıklatın ve argon lazer kontrol açılır penceresinde lazer başlatmak için çalıştır'ı tıklatın.
Lazer yaklaşık 12 miliwatt'a ulaştığında ve 488 ışık kaynağı seviyesi 12 civarına ulaştığında, yapılanı tıklatın ve dört basınç değerini kontrol edin. Değerler orijinal kurulumda gözlenendeğerlere benziyorsa, basınç Tamam kutusunu işaretleyin. Daha sonra, akış hücresi aracılığıyla kılıf ve örnek akışını engelleyen hiçbir hava kabarcıkları veya enkaz olduğundan emin olmak için, birkaç kez temiz tıklatın.
Sonra akışı yeniden başlatmak için sıralama ve kılıf kapatın. Akış hızını kontrol etmek için, 60 saniye boyunca kılıf toplayın. 60 saniye boyunca 15 mililitrelik bir tüp içine kılıf toplayın.
Akış hızı dakikada 9 ila 10 mililitre olmalıdır. Örnekleri çalıştırmak için, lazer fotoçarpıtıcı gücünü sinyalin algılama sınırının üzerinde, ancak doygunluk sınırından yüksek olmayan bir seviyeye ayarlayın. Kabarcıklar, enkaz, yumurta ve diğer istenmeyen küçük parçacıklar hariç ve yetişkinler gibi ilgi sadece hayvanları dahil etmek için boyut gating gerçekleştirin.
Tarama parametreleri ayarlandığında, hazırlanan solucanları bir bardağa ekleyin ve satın almak'a tıklayın. Bu akış sitometre hava almak ve dedektör içinde kabarcıklar oluşturmak neden olur gibi tüm sıvı makineye alınmadığından emin olmak için izleyin. Örnek düşük ve/veya yeterli hayvan toplandığında, durdurma'yı tıklatın.
Yalnızca boyut kısıtlamalarına dayalı olarak kapılı verileri depolamak için kurulum, veri depolama, yalnızca geçitli ve verileri kaydetmek için geçitli depolamayı tıklatın. Daha sonra toplama kabını deiyonize suyla durulayın ve bir sonraki numuneyle analizi tekrarlamadan önce vakumla yıkamayı üç kez çıkarın. Mitokondriyal ve oksidatif stres hassasiyetini ölçmek için, M9'da 50 ila 75 mikrolitre Paraquat ekleyin, düz bir alt 96 kuyunun durumu başına 8 ila 10 kuyu ekleyin ve Paraquat'ın her kuyuya her bir kuyuya 8 ila 10 solucan aktarın.
Her iki saatte bir, canlı hayvanların dayak veya iyi başına ölü hayvan sayısının puanlama sağlamak için viraj neden olarak yavaşça plaka dokunun. Hayvanların sıcaklık hassasiyetini ölçmek için, solucanları 20 santigrat derecede 3-4 gün kuluçkaya yatırın ve toplam dört ila altı tabak için her bir koşul başına 10 ila 15 hayvanı kaplamadan önce. Sonra 34 veya 37 derece santigrat santigrat kantimetre içine plakaları yerleştirin ve sadece gösterildiği gibi her iki saatte bir solucan hayatta kalma puan.
HSP-4 muhabiri stres yokluğunda minimal bazal izlenime sahiptir ancak hayvanlar tunicamycin ilacını kullanarak endoplazmik retikulum stresine maruz kaldığında sağlam bir GFP ifadesi sergiler. Bu farklılıklar da büyük bir parçacık akış sitometresi kullanılarak ölçülebilir. Ayrıca, transgenin endoplazmik retikulum stresi altında indüksiyonu, RNA müdahalesi ile XBP-1'in yıkılması ile tamamen bastırılabilir.
Benzer tahliller mitokondriyal stresi, oksidatif stresi ve ısı stresini ölçmek için yapılabilir. Strese tüm hayvan fizyolojik tepkiler de birkaç hayatta kalma tahlilleri kullanılarak ölçülebilir. Örneğin, Tunicamycin maruz iyelik endoplazmik retikulum stres duyarlılığını ölçmek için kullanılır.
XBP-1 geninin yıkılması Tunicamisin duyarlılığında önemli bir artışa yol açabedilir. Ayrıca, kimyasal ajan Paraquat maruz oksidatif ve mitokondriyal stres hassasiyetini ölçmek için kullanılır. DAF-2 geninin yıkılması Paraquat'a karşı direncinde önemli bir artışa yol açabıla sonuçlanır.
Termotolerans yüksek sıcaklıklarda hayvanların hayatta kalma belirlenmesi ile ölçülebilir ve bir hayatta kalma eğrisi olarak çizilebilir. Bu tahliller en az dört ila altı kez yapılmalıdır ve termotolerans diğer stres tahlillerine göre inanılmaz derecede yüksek bir değişkenlik gösterdiğinden, tüm kopyalar birbirine karşı çizilmelidir. Hayvanları görüntülerken, sinyalin üzerinde veya altında bir şey olmayacak parametrelerin ayarlanması ve deney boyunca aynı parametrelerin kullanılmasını sağlamak önemlidir.
Burada açıklanan görüntüleme protokolleri genom genişliğinde ekranlar da dahil olmak üzere büyük ölçekli tarama için uygun olup, hem araştırmacı hem de doğrulayıcı çalışmalar için mükemmeldir ve daha sonra açıklanan fizyolojik tahlillerle takip edilebilir.
