Bu araştırma hibe sayısı FO 315/4-1 ve DFG SFB 688 altında Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG tarafından desteklenmiştir.

1. Beyin mikrodamar İzolasyonu <ol><li> Her hazırlanması için iki cinsiyetten beş-on yenidoğan farelerin (3-5 günlük) kullanın. </li><li> Lokal IACUC / veteriner önerilerine uygun olarak, bir fare Euthanize, hemen beyin kaldırmak ve aşağıdaki çözeltisi içeren bir Petri kabı içine devri: 15 mM Hepes (pH 7.4), 153 mM NaCI, 5.6 mM KCI, 2.3 mM CaCI2 x 2 2H O, 2,6 mM MgCl2 x 6H 2 O,% 1 (w / v) BSA (bundan sonra tampon A olarak anılacaktır). </li><li> Aksi belirtilmedikçe, tüm izolasyon prosedürler laminer akış başlık altında oda sıcaklığında (RT), (22-24 ° C) sıcaklıkta yapılmalıdır. Tampon içinde, beyincik ve kılcal fragmanlarının giderme sonra, beyin (beyincik ve beyin sapı olmadan beyin) kesin bir steril bir bisturi ile. Doku kadar parçaladı pipet ve aşağı hiçbir kümeleri görünür kadar bir 10 ml pipet kullanarak. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 xg&#39;de 50 ml Falcon tüp ve santrifüj içine süspansiyon aktarın. </li></ol> Not: zarları beyin dokusu yüzeyinde ince, şeffaf bir membran gibi tespit edilebilir. Bunlar dikkatle steril forseps ile temizlenebilir. <ol start="4"><li> Süpernatantı atın. </li><li> 4.5 ml tampon içinde çözülür pelet A% 0.75 1,5 ml (w / v) ile kolajenaz / dispase (Roche) ve 37 dakika 45 ° C su banyosu içinde (bazen sallama) için inkübe edilir. </li><li> Bu arada, kolajen IV (0.1 mg / 50 mM asetik asit içerisinde çözülmüş mi) ile kaplama dört kuyu ile 12 oyuklu plakalar hazırlanır. 1 saat boyunca bağlı kalmanıza olanak sağlar. </li><li> 15 ml buz gibi soğuk tampon A süspanse iyice pelet ilavesi ile sindirim durdurun. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 x g süspansiyon santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı atın. </li><li> Miyelin kaldırmak için, 4 ° C&#39;de 20 dakika süre ile 1000 x g 10 ml% 25 (w / v) BSA (Sigma, saflık&gt;% 98) ve santrifüj eklemek % 25 BSA, 1 x PBS (PAA Laboratories) içinde çözüldü ve 0.2 um f süzülmesi gerekmektedirilter). </li><li> Süpernatant dikkatlice atın, 10 ml Tampon A pelet çözülür ve yeni bir Falcon tüp transfer. </li><li> RT az 5 dakika boyunca 250 xg&#39;de süspansiyon santrifüjleyin. Elde edilen pelet, endotel hücreleri içerir. </li><li> PBS ile iki kez IV kollajen kaplı 12-plaka yıkayın. </li><li> Iki kuyular, her bir kuyucuğa 2 ml içine 4 ml büyüme ortamı (DMEM% 10 FCS, 50U/ml penisilin / streptomisin,% 1 L-glutamin içeren) ve plaka, hücre süspansiyonu içinde pellet yeniden süspanse edin. 37. az 45 dakika için 4 ug / ml ile inkübe bir nihai konsantrasyon ° bir hücre kültürü kuluçka makinesi içinde C puromisin ekleyin. Bu adım, hızla yapışması hücrelerin çıkarılmasını sağlar Not:. Puromisin 24 saat boyunca ilave edilir. Sadece beyin EC diğer hücre türleri için puromisin 14 toksiktir, metabolize olabilir. </li><li> Iki taze kuyular (bu kuyulardan AK fraksiyonu içeren) içine adım 1.14 dışı yapıştırılmış hücreleri içeren 2 ml orta aktarın. Ste gelen yapıştırılır hücreleri ile kuyu doldurunp 2 ml taze orta (bu kuyulardan diğer hücre türleri, örneğin fibroblastlar, astrositler içerir ve paralel büyüdü ve morfolojisinin karşılaştırmalar için de kullanılabilir) ile 1.14. </li><li> Ertesi gün orta değiştirin. </li></ol> 2. Beyin mikrovasküler endotel hücrelerinde ölümsüzleştiren <ol><li> GP + E-86 Neo (GPENeo) 15, fibroblastlar, salgılayan,% 10 ısı ile aktifliği giderilmiş FCS, 50U/ml penisilin / streptomisin, ve 2 mg / ml G418 (ihtiva eden DMEM ortamı içinde Polyoma orta T onkogen ile bir replikasyon-eksikliği virüs yetiştirmek . jelatin kaplı şişeler içinde PAA Laboratories) Not: Polyoma orta T onkogen transfeksiyondan 4-6 hafta kültüre endotel hücrelerinin morfolojisi olan bir tek tabaka, homojen olmayan bir yol açan-ECS EC üzerinde bir büyüme avantajı neden olur. GPENeo piyasada mevcut değildir ve (özgün yayınlar için 4,16 bakınız) paylaşılan ortak malzeme olarak elde edilebilir. </li><li> Için virüs içeren bir ortamda kullanmak<html> ölümsüzlük, 24 saat boyunca G418 serbest ortamda GPENeo hücreleri yetiştirmek. </li><li> GPEneo süpernatan, 10 ml çıkarın ve 8 ug / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona Polybrene (hexadimethrine bromür) (Sigma) eklenir, hücre parçaları ortadan kaldırmak için filtre aracılığıyla steril 0.45 mikron. </li><li> Bölüm 1 &#39;de hazırlanan EC kültürlerden büyüme ortamı çıkarın ve kuyulara GPEneo süpernatan / Polybrene karışım 2 ml ekleyin. Bir taze GPEneo Polybrene / süpernatant karışımının kullanılması ile bir sonraki gün tekrarlayın Not:. Polybrene viral partiküller) ile enfeksiyon kolaylaştırmak için hücre duvarı içinde gözenekler yapmak için kullanılır. </li><li> GPEneo süpernatant / Polybrene karışım ertesi gün çıkarın, PBS ile iki kere yıkayın hücrelerini ve her 3 günde bir değiştirilmesi büyüme ortamında hücreleri korumak. Izdiham üzerine, kollajen IV kaplı plakalar üzerinde hücrelerinin 01:02 bölün. </li><li> Tipik olarak, istikrarlı serebral endotel (cEND) hücre hatları 4-5 hafta sonra alınmalıdır. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Beyin mikrovasküler endotel hücrelerinde yetiştirilmesi <ol><li> 10 ml önceden ısıtılmış ortam ile 15 ml Falcon-su banyosu içinde ve transfer cryoaliquot gelen hücreleri çözülme. </li><li> RT az 5 dakika boyunca 250 xg&#39;de süspansiyon santrifüjleyin. </li><li> Ortamı çıkarın (kaplama için hücre yoğunluğu en az 1x 10 4 hücre / ml olmalıdır) önceden ısıtılmış büyüme ortamı ile kollajen IV kaplamalı T 25 cm 2 hücre kültürü şişesi içinde pelet aktarın. </li><li> Ertesi gün orta değiştirin ve hücrelerin birleştiği ulaştıktan sonra (genellikle 5 gün sonra) hücreleri bölme. </li></ol> 4. CEND-hücrelerinin Yarma (Not: Yarma sadece haftada bir kez Yapılmalıdır, 1:4 daha yüksek Yarma kaçının). <ol><li> , Orta kaldır PBS ile hücreleri yıkayın. </li><li> 37 inkübe sıcak tripsin-EDTA çözeltisi (PAA Laboratories) (T 75 cm 2 balon), 3 ml ekleyin ° C ve hücre tabakası (genellikle 5 ila 15 dakika içinde) lana kadar bekleyin. </li><li> 5 ml o eklemef büyüme, orta ve aşağı yukarı pipetle, ve IV kaplı şişesi yeni kollajen transfer. </li></ol> 5. CEND-hücrelerinin dondurulması <ol><li> Adım 4&#39;te tarif edildiği gibi hücre süspansiyonu elde edilir </li><li> RT az 5 dakika boyunca 250 xg&#39;de süspansiyon santrifüjleyin. </li><li> 6 ml dondurma ortamına (% 95 büyüme ortamı,% 5 DMSO) içinde hücre peleti (1 T 75 cm2 şişeye elde edildi) yeniden süspanse edin. </li><li> . One kriyo-kısım T 25 cm 2 balon üzerine numaralı seribaşı olabilir: Dört 1.5 ml&#39;lik kriyo-alikotları Not içine hücre süspansiyonu bölün. </li><li> Sıvı azot buharında sıcaklık altında kriyo-alikotları saklayın. </li></ol> 450 ml DMEM,% 10 FCS, 10 ml L-glutamin,% 2 MEM-Kit,% 2 NEAA, 10 ml sodyum piruvat, 50 U / ml penisilin / streptomisin: büyüme ortamı cEND 6. Temsilcisi Sonuçlar CEND ve cerebEND hücrelerin endotel a immunostainings ile karakterize edildind BBB transendothelial elektriksel direnci (Teer) ve geçirgenlik ölçümleri ile yanı sıra markers. CEND ve cerebEND izdiham büyüme inhibisyonu sergilenen sıkışık uzamış hücre mono tabakaları ile beyin EC primer kültürlerinde, benzer bir morfoloji vardı. Hücreleri gibi immunofloresan (Şekil 3) 4,5 ile gösterildiği gibi hücre-hücre birleşme lokalize Claudin-5, occludin ve VE-cadherin proteinlerin kadar, algılanabilir bir seviyeleri ifade edilmiştir. Serum azaltılmış ortamda kültüre cEND hücreleri Teer bir artışa (Ωcm 2 150 dan% 2 serum varlığında 500 Ωcm 2 ila% 10 serum varlığında) hidrokortizon ilave potansiyalize edildi (800 Ωcm yol açmıştır 2) veya insülin (1.000 Ωcm 2) 4. 21 gün için serum azaltılmış bir ortamda kültürlenen cEND tek katmanlarını olan 900 Ωcm 2 (Şekil 4) Teer. Teer bir montaj kullanılarak ölçüldüiçeren akım geçen ve gerilim ölçme elektrotları (Dünya Hassas Aletler). Karşılaştırma için, birincil mikrovasküler beyin EC Ωcm 2 ve piyasada satılan bir fare hücre hattı bEnd.3 Abbot 2005 ve Toth ve ark görmek son değerlendirme için 100-140 Ωcm 2 (of Teer değerleri vardı 200-600 arasında Teer değerleri rapor edilmiştir ark., 2011 17,18). Buna ek olarak, 4 saat boyunca bu gibi şarjlı olmayan moleküler kütleleri 4, 10, 70 ve 500 kDa FITC-dekstran, veya% 2 FCS türev ortam içinde cEND bir tek tabaka boyunca fluoresein (300 Da) gibi makromoleküller, ve geçiş azalmıştır % 10 FCS içeren büyüme ortamında tutulan kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında: paracellular akı FITC-dekstran 10 ve 70 kDa için% 26, floresein kontrol hücrelerin% 30 düşürüldü ve akı FITC için kontrol hücrelerin% 4,5 &#39;e düşmüştür -dextrtan 500 kDa. Değerleri Teer benzer şekilde, geçirgenlik gluc varlığında kültüre hücrelerinde düşük olduğu görüldüocorticoids (GC) 4. Daha sonraki çalışmalarda, biz glukokortikoid hedef gen, occludin, Claudin-5 ve beyin damar endoteli 4,7,9 bölgesindeki VE-cadherin belirlenmiştir. GC tedavi, bu proteinlerin ekspresyonunda bir artışa ve hücre iskeleti ile VE-cadherin yeniden düzenlenmesine yol açtı. Sıkı kavşak proteinlerin occludin ve Claudin-5 doğrudan GC-aracılı yönetmelik kendi promotor bölgelerinde 4,7,19 GC yanıt elemanları aracılığıyla görünür. Ayrıca, Claudin-5 vasküler endotel 10 bir roman östrojen hedef olarak tespit edilmiştir. Endotel disfonksiyonu altında yatan pek çok farklı hastalıklar. Oksijen / glikoz yoksunluğu (OGD) koşullar altında cEND kültüre. OGD GC ve proteazom inhibitörü bortezomib 12 ile kombine tedavi sonrası tekrar oluşturulabilmektedir BBB fonksiyonunun bozulmasına yol açtı. OGD koşullarda glukoz alımını güçlü bir artışa yol açmıştır ve glikoz Taşıma ifadesindemk801, NMDA-reseptörü 13 bir rekabetçi olmayan inhibitör ilavesiyle zayıflatılmış olabilir cerebEND içinde ters. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> Şekil 1. Beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cEND) izolasyon bir hafta sonra. Işık mikroskopisi resim morfolojisi 6x (A) ve 15x (B) büyütme altında alınmıştır. Endotel hücreleri ada oluşan koloniler görebilir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> Şekil 2. Izolasyon ve ölümsüzlük sonra beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cEND) Morfoloji bir ay. Işık mikroskobu fotoğrafları 15x büyütme altında alınmıştır. Bir birleşik, homojen endotel hücre monolayer görülebilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> Şekil 3,. Ölümsüzleştirdi beyin microvascular endotel hücreleri ekspres Claudin-5, occludin ve VE-kaderin. CEND hücreleri kollajen IV kaplı lamelleri yetişen ve Claudin-5 karşı antikorlar (A), occludin (B) ve VE-kaderin (C) ile boyandı. Görüntüler 40x büyütme altında bir Zeiss Axioscop2 mikroskop kullanılarak alınmıştır. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> Şekil 4. CEND monolayer. CEND arasında transendothelial elektriksel direncinin ölçülmesi (Teer) IV kollajen kaplı transwell filtreler (gözenek boyutu 0,4 mikron) üzerinde yetiştirilmiştir. Izdiham ulaştıktan sonra, hücreler,% 2 FCS ihtiva eden ortam içinde muhafaza edildi. Teer akım geçen ve gerilim ölçme elektrotları içeren bir derleme kullanarak 7, 14 ve 21 gün sonra ölçüldü.

<ol>
	<li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier.">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp (Wars). 71, 113 (2011).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+hydrocortisone+and+TNFalpha+on+tight+junction+proteins+in+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier.">Differential effects of hydrocortisone and TNFalpha on tight junction proteins in an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> J. Physiol. 586, 1937 (2008).</li><li>Weksler, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB. J. 19, 1872 (2005).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system.">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475 (2005).</li><li>Silwedel, C., Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibility+of+cerebral+and+cerebellar+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+to+loss+of+barrier+properties+in+response+to+inflammatory+stimuli.">Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli.</a> J. Neuroimmunol. 179, 37 (2006).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+mouse+microvascular+endothelial+barrier+permeability+are+brain+specific.">Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific.</a> J. Physiol. 573 (Pt 2), 413 (2006).</li><li>Burek, M., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+the+murine+claudin-5+promoter.">Cloning and characterization of the murine claudin-5 promoter.</a> Mol. Cell Endocrinol. 298, 19 (2009).</li><li>Forster, C., Kahles, T., Kietz, S., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+induces+the+expression+of+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+in+the+murine+cerebral+vascular+endothelial+cell+line+cEND.">Dexamethasone induces the expression of metalloproteinase inhibitor TIMP-1 in the murine cerebral vascular endothelial cell line cEND.</a> J. Physiol. 580 (Pt.3), 937 (2007).</li><li>Blecharz, K. G., Drenckhahn, D., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+VE-cadherin+expression+and+cause+cytoskeletal+rearrangements+in+murine+brain+endothelial+cEND+cells.">Glucocorticoids increase VE-cadherin expression and cause cytoskeletal rearrangements in murine brain endothelial cEND cells.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 1139 (2008).</li><li>Burek, M., Arias-Loza, P. A., Roewer, N., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-5+as+a+novel+estrogen+target+in+vascular+endothelium.">Claudin-5 as a novel estrogen target in vascular endothelium.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 298 (2010).</li><li>Blecharz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+endothelial+barrier+function+in+the+murine+brain+endothelial+cell+line+cEND+incubated+with+sera+from+patients+with+multiple+sclerosis.">Glucocorticoid effects on endothelial barrier function in the murine brain endothelial cell line cEND incubated with sera from patients with multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 16, 293 (2010).</li><li>Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome.">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081 (2011).</li><li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+NMDA-receptor+antagonist+MK801+during+oxygen/glucose+deprivation+moderately+attenuates+the+upregulation+of+glucose+uptake+after+subsequent+reoxygenation+in+brain+endothelial+cells.">Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells.</a> Neurosci. Lett. 506, 44 (2012).</li><li>Perriere, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties.">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279 (2005).</li><li>Golenhofen, N., Ness, W., Wawrousek, E. F., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+induction+of+the+stress+protein+alpha-B-crystallin+in+vascular+endothelial+cells.">Expression and induction of the stress protein alpha-B-crystallin in vascular endothelial cells.</a> Histochem Cell Biol. 117, 203 (2002).</li><li>Risau, W., Engelhardt, B., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+function+of+the+blood-brain+barrier:+incomplete+presentation+of+protein+(auto-)antigens+by+rat+brain+microvascular+endothelium+in+vitro.">Immune function of the blood-brain barrier: incomplete presentation of protein (auto-)antigens by rat brain microvascular endothelium in vitro.</a> J. Cell Biol. 110, 1757 (1990).</li><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CNS+barriers:+evolution,+differentiation,+and+modulation.">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cell Mol. Neurobiol. 25, 5 (2005).</li><li>Toth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patented+in+vitro+blood-brain+barrier+models+in+CNS+drug+discovery.">Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery.</a> Recent Pat. CNS Drug Discov. 6, 107 (2011).</li><li>Harke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+regulate+the+human+occludin+gene+through+a+single+imperfect+palindromic+glucocorticoid+response+element.">Glucocorticoids regulate the human occludin gene through a single imperfect palindromic glucocorticoid response element.</a> Mol. Cell Endocrinol. 295, 39 (2008).</li><li>Kiefer, F., Courtneidge, S. A., Wagner, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+properties+of+the+middle+T+antigens+of+polyomaviruses.">Oncogenic properties of the middle T antigens of polyomaviruses.</a> Adv. Cancer Res. 64, 125 (1994).</li><li>Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+transformation+by+polyomavirus+middle+T+antigen+in+mice+lacking+Src-related+kinases.">Endothelial cell transformation by polyomavirus middle T antigen in mice lacking Src-related kinases.</a> Curr. Biol. 4, 100 (1994).</li><li>Ong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ShcA+and+Grb2+mediate+polyoma+middle+T+antigen-induced+endothelial+transformation+and+Gab1+tyrosine+phosphorylation.">ShcA and Grb2 mediate polyoma middle T antigen-induced endothelial transformation and Gab1 tyrosine phosphorylation.</a> EMBO J. 20, 6327 (2001).</li><li>O'Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells.">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> J. Immunol. 144, 521 (1990).</li><li>Roux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gamma-glutamyl+transpeptidase+and+alkaline+phosphatase+activities+in+immortalized+rat+brain+microvessel+endothelial+cells.">Regulation of gamma-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells.</a> J. Cell Physiol. 159, 101 (1994).</li><li>Montesano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behavior+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene.">Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435 (1990).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315 (2010).</li><li>Skaper, S. D., Conn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Neurosciences. 2, 1303 (1990).</li><li>Ishii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin,+an+endothelial+anticoagulant+protein,+is+absent+from+the+human+brain.">Thrombomodulin, an endothelial anticoagulant protein, is absent from the human brain.</a> Blood. 67, 362 (1986).</li><li>Minagar, A., Alexander, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis.">Blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 9, 540 (2003).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada tarif edilen prosedür vasküler endotelyum fonksiyon olarak belirli değişiklikler incelemek için çeşitli fare suşlarının yanı sıra farklı knock-out fare suşları AK haplarına reçetesiz mikrovasküler izolasyonu için de kullanılabilir. Ölümsüzleşme için bir yöntem olarak, mürin polyomavirus, Polyoma orta T antijen onkoprotein ile dönüşüm kullanılır. Bu, in vivo ve in vitro 20,21,22 hızla olgunlaşmamış endotel hücreleri dönüştürür. Literatürde tanımlanan EC arasında ölümsüzleşme diğer yöntemler, örneğin SV40 büyük Simian Virüs Vacuolating T antijen 40 23, adenovirüs E1 gen ürün 24 ya da insan telomeraz 3&#39;ün katalitik alt birimi aşırı ekspresyonu ile ölümsüzleşme içerir. PymT ile ölümsüzleşme kısa bir süre içinde neonatal fareden homojen bir AT kültürü elde olanak mürin olgunlaşmamış EC için spesifiktir. Ölümsüzleşme hücreleri ve inci özelliklerini değiştirirölümsüzleştirilmiş hücre hatları ile elde edilen sonuçlar e birincil hücreler ile birlikte ya da fareler, in vivo deneyler ile ya da karşılaştırılması gerekmektedir. PymT ölümsüzleştirdi AT ürokinaz tipi plazminojen aktivatörü artan üretiminden kaynaklanan fibrinolitik aktivite yüksek düzeyde ifade açıklanan ve plazminojen aktivatör inhibitörleri 25 üretimi azalmıştır. PymT Doğrudan karşılaştırma vitro BBB modellerinde hem de T hücre adezyonu çalışmalarında 26 için uygun olduğunu ortaya ilköğretim bEND5 hücre hattı, AK haplarına reçetesiz ölümsüzleştirdi. Tarif edilen prosedüre göre tespit hücre hatları hücreler yaşlanma sırasında bu özellikleri kaybederse, bbb ve EC kavşak proteinlerin yüksek ekspresyonu ile bariyer özelliklerini korumak için düşük geçiş sayısını da kullanılabilir. Böylece bariyer özellikleri kaybından sonra, yeni bir hücre çizgisinin hazırlanması dikkate alınmalıdır. Hücre kaplama yoğunluğu bu hücre proliferasyonu için kritik olduğu gibi, EC için yüksek olmalıdır. Bu da ölümsüzleştirilmiş EC bakımı gibi izolasyon prosedürü sırasında dikkate alınmalıdır. Her yeni hücre hattı olan bariyer özellikleri ve diğer hücre türleri ile olası kirleticiler için test edilmelidir. AK monolayers oligodendrosit, astrositler ve perisitlere 4,27 ile kontaminasyon dışlamak için primer antikor olarak anti-galactocerebroside, anti-glial fibriler asidik protein ve anti-düz kas antijeni ile lekeli olabilir. Meningal damar tarafından kontaminasyona ekarte etmek için, trombomodülin ifadesi beynin 28 hariç tüm vasküler yataklarda ifade edildiği, test edilebilir. İlginçtir, beynin farklı bölgelerinde izole ölümsüzleştirdi mikrovasküler endotel hücre hatları pro-inflamatuar uyaranlara kendi bariyer özellikleri ve duyarlılıkları farklıdır. Bir örnek olarak, beyin cEND ve serebellar cerebEND hücre çizgileri 4,5 söz edilebilir. CerebEND karşılaştırıldığında gösterdi, başlıca bileşenler sıkı birleşim Claudin-1 ve occludin daha düşük seviyelerde ifade cEND için. Bununla birlikte, Claudin-3 ve -12 seviyeleri cerebEND daha yüksek bulunmuştur. CerebEND hücrelerin bariyer fonksiyonunun cEND hücrelerinin bariyer özellikleri 5 mi daha TNFa iltihaplı aracı ile tedavi altında, çok daha fazla acı. Inflamatuar uyaranlara Yükseköğretim serebellar açığı, multipl skleroz hastalarında ve ensefalomiyelit 29 otoimmün onun hayvan modelinde deneysel in vivo olarak görülebilir. Bu ilginç bulgu beyin içine hedefleme gelecek ilaç geliştirilmesi için, üretim ve beynin farklı bölgelerinde için in vitro model içinde bireysel karakterize gerektiğini göstermektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Sığır serum albümini (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> Saflık&gt;% 98 </td></tr><tr><td> kollajen IV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5533 </td><td> 50 mM asetik asit içerisinde 50 ug / ml </td></tr><tr><td> Kollajenaz / dispase </td><td> Roche </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetil sülfoksit (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Fötal Buzağı Serumu (FCS) </td><td> PAA Laboratuvarlar </td><td> A15110-1333 </td><td> nihai konsantrasyon% 10 ısı ile inaktive edilmiş (30 dakika, 56 ° C) </td></tr&gt; <tr><td> L-glutamin </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> Depolama: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> MEM Vitamin </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> Depolama: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Na-piruvat </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> Neomisin (G418) </td><td> PAA Laboratuvarlar </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> Sigara esansiyel amino asitler (NEA) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> 4 at Depolama ° C </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> Depolama: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Fosfat salin (PBS) tamponlu </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene (hexadimethrine bromür) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 107689 </td><td> PBS içinde 0.8 mg / ml, -20 ° C&#39;de saklama </td></tr><tr><td> Puromisin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin / EDTA </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> % 0.05, PBS içinde% 0.02 EDTA </td></tr></tbody></table>

generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model

Epitel ve endotel hücreleri (EC) dış ve iç ortamdan dokusunun korunmasına paracellular bariyerler inşa ediyoruz. AK oluşan kan-beyin bariyeri (KBB), astrosit sonu ayaklar, perisitten ve bazal membran beyin parankimi korunması ve homeostazı sorumludur. Vitro BBB modellerinde BBB yapısı ve fonksiyonunu araştırmaya ortak araçlardır Hücresel düzeyde. Vitro BBB modelleri farklı önemli bir kısmı bugüne kadar farklı laboratuarlarda araştırma için kurulmuştur. Genellikle, hücrelerin, inek, domuz, sıçan veya fare beyin dokusu (Wilhelm ve diğerleri tarafından gözden ayrıntılı olarak tartışılmıştır. 1) &#39;den elde edilmiştir. İnsan doku örnekleri laboratuarlarda veya şirketler 2,3 kısıtlı sayıda kullanılabilir. Primer hücre hazırlıklar zaman alıcıdır ve AK kültürlerin partiden partiye farklılık da, kurulması AK lin ölümsüzleştirdies bilimsel ilgi odağıdır. Burada, yenidoğan fare beyin bir ölümsüzleştirdi beyin mikrovasküler AK hattı kurulması için bir yöntem mevcut. Biz reaktifler ve çözümler kullanılan prosedürü adım adım listesi açıklanmaktadır. Bizim laboratuvar tarafından kurulan yöntemi dört ila beş hafta içinde homojen ölümsüzleştirdi endotelyal hücre hattının izolasyonu sağlar. Beyin mikrovasküler endotel hücre hatları cEND 4 olarak adlandırılan (serebral korteks) ve 5 (serebellar korteks) cerebEND, Förster laboratuvarda bu prosedüre göre izole edildi ve etkili BBB farklı fizyolojik ve patolojik süreçlerin açıklanması için kullanılmıştır. CEND ve cerebEND kullanarak biz bu hücrelerin glukokortikoid 4,6-9 yanıt ve gibi TNF 5,8 gibi pro-infammatory mediatörlerin yanı östrojen tedavisi 10 olduğunu göstermiştir. Ayrıca, biz birden sc patoloji inceledikyi amaçladık 11 ve AT-düzeyde hipoksi 12,13. CEND ve cerebEND hatları lenfositler veya kanser hücreleri ile AK farklı uyaranlara veya etkileşim EC ve BBB, hücresel cevaplarının yapısı ve işlevi incelemek için iyi bir araç olarak kabul edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model at JoVE.com

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Bu yöntem, fare beyin mikrovasküler endotel hücreleri izole etmek ve ölümsüzleştirmek açıklamaktadır. Biz beyin dokusu, sindirim adımları, tohumlama ve hücre ölümsüzlük ve homojenizasyon başlayarak adım adım protokol açıklar. Genellikle, homojen, ölümsüzleştirdi mikrovasküler endotel hücre hattı elde etmek için yaklaşık beş hafta sürer.

Bir olarak ölümsüzleştirdi murin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Hattı Üretimi<em&gt; In Vitro</em&gt; Kan Beyin Bariyeri Modeli

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

generation-an-immortalized-murine-brain-microvascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

18.7K Görüntüleme.  University of Wurzburg. Bu yöntem, fare beyin mikrovasküler endotel hücreleri izole etmek ve ölümsüzleştirmek açıklamaktadır. Biz beyin dokusu, sindirim adımları, tohumlama ve hücre ölümsüzlük ve homojenizasyon başlayarak adım adım protokol açıklar. Genellikle, homojen, ölümsüzleştirdi mikrovasküler endotel hücre hattı elde etmek için yaklaşık beş hafta sürer.

Video: Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Nörobilim

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

İlköğretim Kemirgen Beyin mikrovasküler endotel hücreleri İzolasyonu

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Mikro Elektrot Diziler 3D Engineered Nöronal Kültürler Arayüz: Yenilikçi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deneysel Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Kan - beyin bariyerini bozulma iskemik inme, bir fare modeli Vivo içinde değerlendirilmesi

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

Sıçanlarda Akut İnme Sonrası Beyin İyileşmesini Değerlendiren Bir Preklinik Model

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

İn vitro Model Olarak Tüm Yenidoğan Koklear Eksplantları

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

Hücre Bariyeri Bütünlüğünü Değerlendirmek için Transendotelyal Direnç Ölçümü

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

Yazar Spotlight: Hücre Bariyeri Bütünlüğünü Değerlendirmek için TEER Algılama Uygulamaları 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

bEnd.3 Transendotelyal Elektriksel Direnç Tespiti Yoluyla Vasküler Endotel Hücrelerinde Bariyer Fonksiyonel Bütünlük Kaydı

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...