Die Autoren bedanken sich folgende Finanzierungsquellen: P01CA040035 (FE / JAS) und VA Career Development Award (JAS).

Ein. Zelle Wartung <ol><li> Viele Knochen metastasierenden Subklone von MDA-MB-231 existieren, haben variable Neigung zum Knochen Besiedlung und das Wachstum. Für unsere Experimente verwenden wir ein Klon aus der GFP-markierten MDA-MB-231 bei UTHSCA 2 entwickelt abgeleitet. Diese besondere Sub-Klon wird sichtbar osteolytische Knochenläsionen bei ca. 3 Wochen nach der Impfung zu bilden, mit dem Opfer bei 4 Wochen. </li><li> Pflegen Zellen in DMEM mit 10% FBS und 0,1 mg / ml Penicillin-Streptomycin bei 37 ° C in 5-8% CO 2 7. </li><li> Durchgang Zellen bei 80-90% Konfluenz und Re-Platte bei einer 1:10-Verdünnung (dieser variiert je nach Zelltyp und der Größe Platte. Für MDA-MB-231-Zellen in einer T-75 dieses ca. 6x10 5 ist), die etwa alle 72 Stunden. </li><li> MDA-MB-231-Zellen aufrechtzuerhalten einen allgemein fibroblastische Erscheinungsbild mit zahlreichen Pseudopodien. Eine Rundung ist bezeichnend für Überbelegung oder andere unerwünschte Stress und sollte, da dies vermieden werdenmöglicherweise metastatischen Potential in vivo beeinflussen. </li><li> Idealerweise sollten die Zellen in Kultur gehalten werden nur kurz vor der Inokulation (wir empfehlen weniger als 1 Wo. oder bis genügend Zellen für das Experiment) und ein neues Röhrchen sollten aufgetaut wenn Rundung oder Veränderungen in Zellwachstumsrate auftreten. </li></ol> 2. Cell Preparation <ol><li> Trypsinieren Zellen bei 80-90% Konfluenz mit 0,15% Trypsin / EDTA (Gibco verdünnen 0,5% Trypsin EDTA 1:2 in PBS). Diese Konzentration ermöglicht eine schnelle Ablösung (&lt;2 min) und reduziert Verklumpung der Zellen. </li><li> Umgehend entfernen Zellen aus Platte mit 10 ml eiskaltem DMEM mit 10% FBS, Pipette in 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 200 xg für 5 min. </li><li> Pellet in einem 50 ml konischen Röhrchen in 25 ml eiskaltem PBS (ohne Ca und Mg) und zählen. </li><li> Zentrifuge erneut Pellets und resuspendieren bei 10 6 Zellen pro ml (intrakardiale) oder 250.000 Zellen/10 ul (intratibial) in eiskaltem PBS. Die Temperaturtur von PBS ist wichtig, um zu verhindern Verklumpung der Zellen und anschließender Embolie nach Injektion. Die Zellsuspension auf Eis bleiben während der Durchführung Injektionen und lebensfähig sein wird und bleiben für 30 min un-verklumpt. Während die genaue Anzahl der Platten erforderlich vom Ermittler Ermittler variieren, verwenden wir grundsätzlich 1 T-75 für zwischen 8-10 Mäusen. </li></ol> 3. Intrakardiale Impfung <ol><li> 4-6 Wochen alte weibliche (Foxn nu-/ -: Harlan) Mäuse werden für diese Experimente verwendet, obwohl andere immungeschwächten Mäusen (RAG1-/ -, RAG2-/ -, SCID, XID, usw.) können auch verwendet mit menschlichen Krebszelle Experimente. </li><li> Die nackten Mäusen sollte fed Teklad 2920x Ernährung 5-10 Tage vor der Injektion Mortalität von der Injektion zu verringern, um und reduzieren Hintergrundfluoreszenz in bildgebenden Verfahren (seit das Essen ist Luzerne frei). </li><li> Bei der Verwendung von Mäusen außer nu / nu, entfernen Haare durch Rasieren oder mit Nair (in unserer Erfahrung Nair besser funktioniert) auf ventralen Bauch area vor Beginn Prozedur. </li><li> Anesthetize Maus in einer isolierten Kammer mit einem Isofluran Verdampfer (2,5% Iso: 2-3 L / min O 2) oder anderen bevorzugten Anästhesie (nach unserer Erfahrung Isofluran ist die beste für intrakardiale Impfungen toleriert). </li><li> Bewegen einer Maus zu einem Zeitpunkt zu dem Nasenkonus des Anästhesiegerät in einem Edelstahl belüftete Haube. </li><li> Positionieren Sie jede Maus auf seinem Rücken mit der Brust nach oben. </li><li> Waschen Sie die Brust mit einem 10% Povidon / Jod Tupfer / Lösung von 70% Ethanol, Wiederholung 2 mal. </li><li> Mark Maus Brust zur Injektion (unter Verwendung eines sterilen Marker oder Kennzeichnung leicht zur Seite, um die Injektionsstelle steril). Wir verwenden eine Marke Ort auf halbem Weg zwischen der Brustbeinkerbe und oben Xyphoid Prozess, und leicht nach links (anatomischen) des Brustbeins. Zeichne eine kleine Luftblase in die Spritze zum Raum zwischen dem Kolben und Meniskus (wichtig für das Sehen Herzpulses) eines 300 ul 28 g ½ Insulinspritze erstellen, undauszuarbeiten 100 ul Zellen. </li><li> Halten Nadel aufrecht. Halten Sie die Haut der Maus straff mit der anderen Hand, legen Nadel. </li><li> Erfolgreiche Insertion in linke Herzkammer sollte in einer ausgeprägten hellrot Impulses von Blut in der Spritze führen. In dieser Tiefe, sorgfältig niederdrücken Kolben der Spritze (100 ul Volumen), ohne signifikante Bewegung der Nadel zu vermeiden Punktieren des Herzens oder Verschütten Zellen in die Brusthöhle. </li><li> Nachdem die Zellen injiziert werden, ziehen sich leicht am Stößel, um einen kleinen Betrag von Unterdruck zu reduzieren Abtropfen von Zellen in die Brusthöhle zu erstellen. </li><li> Ziehen Nadel direkt aus Brust wobei sichergestellt, um ein Kippen der Nadel während der Entfernung, die die Auskleidung des Herzens reißen kann und zu Blutungen vermeiden. </li><li> Sanften Druck auf der Brust auf die Injektionsstelle, um Blutungen zu verringern. </li><li> Entfernen Maus vom Nasenkonus und weiterhin leichten Druck für etwa 1 min anzuwenden. </li><li> Bewegen Sie die Maus, um Heizkissen bis zur vollständigen conbewusste. </li><li> Wenn mit der Maus beginnt sich zu drehen oder zu zucken nach der Wiederherstellung, ist die wahrscheinliche Ursache eine Embolie. Injizieren Maus intraperitoneal mit 80 bis 120 mg / kg Ketamin und um den Blutfluss zu erhöhen, während Herzleistung abnehmender Gefäßwiderstand. Dies sollte helfen, die Maus passieren das Gerinnsel. Nachdem dies geschehen ist, ist es am besten Zellpräparationen ändern, da zeigt es, dass die Zellen verklumpen. Wir ändern Zellpräparationen nach ca. 8 Mäuse oder 30 min. </li></ol> 4. Intratibial <ol><li> Injizieren Maus mit Buprenex (0,1 mg / kg) oder ähnlichen analgetischen zugelassenen unmittelbar vor Prozedur. </li><li> Anesthetize Maus mit Isofluran, dann Nasenkonus bewegen und Aufrechterhaltung einer Narkose. </li><li> Reinigen beider Schenkel mit 10% Povidon / Iod Tupfer / Lösung, gefolgt von Ethanol, 2 mal wiederholt. Enthaarung Beine (mit Nair oder ähnliches Produkt) vor der Reinigung, wenn fur vorhanden. </li><li> Fassen Außenknöchel, Innenknöchel und untere Hälfte der Tibia mit Zeigefinger und thumb, dann Biegung Schenkel (Kombination von Beugung und laterale Rotation, so dass das Knie sichtbar und zugänglich ist. </li><li> Befeuchten Sie die Haut mit 70% EtOH, um die Sichtbarkeit der zugrunde liegenden Patellarsehne, die sichtbar sein als eigenständige, dicke, weiße Linie erhöhen sollte. Während fest Greifen Knöchel / Bein der Maus einfügen 28g ½ Nadel unter Patella, durch die Mitte der Patellarsehne und in der vorderen Area intercondylaris in der Oberseite des Schienbeins. </li><li> Beim Einsetzen Nadel in Tibia, sorgfältig führen durch Wachstum Platte mit stetigen, festen Druck mit leichten Bohrwirkung. </li><li> Beim Eindringen von tibialen Epiphysenfuge, wird die Nadel stoßen deutlich weniger Widerstand. </li><li> Verwenden Sie einen sanften, seitliche Bewegung der Nadel, um sicherzustellen, Nadel in Tibia und durch das Wachstum Platte. Bewegung wird begrenzt, wenn die Nadel im richtigen Platz im Tibia werden. </li><li> Langsam drücken Stößel 10 ul Zell-Lösung zu injizieren. Wenig bis gar keine Widerstand sollte an dieser Stelle zu spüren. </li><li> SloWLY extrahieren Nadel. </li><li> Nach dem gleichen Verfahren, um nächste Etappe fahren Sie 10 ul PBS injizieren. </li><li> Entfernen Sie mit der Maus aus der Narkose und halten auf Heizkissen bis erholt. </li><li> Überwachen Sie die Maus über die nächsten 24 Stunden und spritzen mit zusätzlichen Buprenex alle 12 Stunden, wenn die Tiere auf Anzeichen von Leiden zeigen, fortzusetzen. </li></ol> 5. Imaging Zeit Course <ol><li> Luciferase Imaging: Gegebenenfalls Luciferase Bildgebung sollte genutzt werden beginnend 7 Tage nach der Inokulation der Tumorzellen (obwohl in den meisten Knochenmetastasen Modelle, erkennbar näher an Tag 14). Maus intraperitoneal mit 150 mg / kg Luciferin, betäubt injiziert und abgebildet 8 min nach der Injektion mit IVIS Ausrüstungen 8. </li><li> GFP Bildgebung: Typischerweise GFP-exprimierenden Tumoren beginnen zu sein um Tag 10-14 nachweisbar intratibial Injektionen und 16-21 für die intrakardiale Experimente mit Maestro bildgebende Geräte (CRi) 9. In Kürze, Mäuse werden mit Isofluran (3%) Und unter Narkose durch eine Bugspitze im Maestro Bildgebung Kammer aufrechterhalten. Für unsere eGFP-exprimierende Zellen verwenden wir den blauen Filter-Set (498 excitation/515 Emission für eGFP) bei 500 ms Belichtungszeit in 10 nm Schritten. </li><li> Faxitron (X-ray): X-Strahlen getroffen werden wöchentlich ab zwischen Tag von 7 bis 14. Läsionen werden in der intrakardialen Modell an Tag 21 sichtbar und eine Woche zuvor in der intratibial Injektionen 3. Unsere Daten für radiografische ex vivo und in vivo wurden unter Verwendung eines Faxitron LX-60 bei 35 kV für 8 Sekunden Belichtung. </li><li> Andere Imaging: Bildgebende Verfahren wird vollständig von der spezifischen Forschungsergebnisse gestützt werden. Zusätzlich zu den oben genannten Methoden können lebendes Tier Bildgebung an 3D-Mikro-Computertomographie (μCT), Mikro-Positron-Emissions-Tomographie (μPET), und andere Modalitäten 10,11 basieren wertvolle Informationen liefern. </li></ol> 6. Maus Sacrifice <ol><li> Jedes Modell verfügt über eine leicht unterschiedliche zeitliche Verlauf. Mit MDA-MB-231 Zellen Mäusen Regel geworden kachektische oder querschnittsgelähmt zwischen 21 und 35 Tagen und in der Regel um den Tag 28 (IT injizierten Mäusen zwischen 21-28 Tage). </li><li> Sobald mehrere Mäuse entwickeln Läsionen, die durch den kortikalen Knochen zu brechen, werden querschnittsgelähmt, oder verlieren zwischen 10-20% des Körpergewichts, opfern alle Mäuse in der Studie mit Ketamin / Xylazin Überdosierung mit Genickbruch (oder andere IACUC anerkannten Methode) beginnen. </li><li> Entfernen Sie Knochen zur weiteren Untersuchung und Shop in gepuffertem 4% Formalin benötigt. </li><li> Mäuse, die mit der Brust Tumoren sind ein Zeichen für eine verpasste Injektion und muss von der Studie ausgeschlossen werden. </li></ol> 7. Ex-vivo-Analyse <ol><li> μCT: Abtasten in 70% EtOH ermöglicht strukturellen und histologischen Parameter auf derselben Knochenprobe gemessen werden. </li><li> Contour und analysieren nach individuellen experimentellen Design und die Ausstattung 10. Unsere Daten wurde mit einem Scanco μCT 40 mit 12 uM Auflösung erhalten. </li><li> Histomorphometry: Process Proben anhand bevorzugter histologischen Methoden und Flecken mit Hämatoxylin / Eosin 7 </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Nach intrakardialen oder intratibial Inokulation der Tumorzellen (Abbildung 1) Mäuse werden wöchentlich überwacht durch Radiographie und Fluoreszenz (oder Lumineszenz). Läsionen in der Regel zu werden, indem x-ray deutlich zwischen Woche 2 und 3, während sie sichtbar sein kann durch Fluoreszenz und Lumineszenz bereits in Woche 2, je nach Modell (Abbildung 2). Die Läsionen sind als dunkle Löcher in den Knochen, und immer deutlicher mit der Zeit (Abb. 3). Läsionen wurden quantifiziert mit Metamorph Analyse von Röntgenaufnahmen und Fluoreszenz quantifiziert wurde mit Maestro (CRi) Imaging-und Analysesoftware. Als Läsionen zu wachsen beginnen, Mäuse werden häufig Kachexie. Sacrifice ist erforderlich, wenn die Mäuse zwischen 10-20% ihres ursprünglichen Körpergewichts verloren haben. Der Zustand der<html> Mäuse können rasch ändern und zu überwachen mehrere Male während des Tages werden. Zwischen 3-4 Wochen Mäusen begann eine oder beide Hinterbeine ziehen und die gesamte Studie wurde geopfert. Die Bilder wurden vor der Tötung genommen. Nach der Anästhesie Überdosierung wurde Blut gesammelt, um Marker des Knochenstoffwechsels oder andere Faktoren zu messen. Nach Genickbruch wurde die Haut von der Maus und Knochen herausgeschnitten entkleidet und gereinigt ex-vivo-Bildgebung (Abb. 3), die Visualisierung von Tumorherde ermöglichen wird mindestens 7 Tage früher als in vivo Bildgebung. Sobald Bildgebung abgeschlossen Knochen wurden in etikettierten Kassetten gegeben und in Formalin Fixierung und weitere histologische Verarbeitung oder μCT Analyse. Histomorphometrie wurde an den Proben durchgeführt, um die Tumorbelastung und BV / TV geben nach μCT auf einer Tibia durchgeführt wurde, um die Menge des Knochenabbaus (Abbildung 4) zu quantifizieren. / 4260/4260fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Die richtige Platzierung der Injektion. Ventral radiologischen Ansicht (A) der erwachsenen Maus Thorax zeigt die richtige Platzierung der Nadel im 4. Interkostalraum und in der linken Herzkammer zur intrakardialen Impfung. Anatomischen Landmarken sind mit horizontalen gestrichelten Linien auf dem Brustbein (dargestellt in weiß). Auf der Maus Haut das Brustbeinkerbe und Xyphoid Prozess als Landmarken dienen, und die Nadel leicht des Brustbeins links eingefügt. Ventralen röntgenologischen Ansicht (B) des Schenkels erwachsenen Maus zeigt richtige Platzierung der Nadel in der proximalen Tibia, ausgerichtet zwischen den Kondylen. Aus einer seitlichen Perspektive die Spitze der Nadel hinter der Tuberositas und tief auf die Epiphysenfuge platziert. Ideale Lage für die Injektion von weißen Kreis angezeigt. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig2.jpg" /> Abbildung 2. Zeitlicher Verlauf von Knochenmetastasen Modelle. Progression von ca.ncer induzierten Knochenerkrankung mit Röntgenstrahlen und GFP + gezeigten Fluoreszenzbilder der Tumoren in vivo aus intratibial Injektionen (A) und intrakardiale Injektionen (B). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig3.jpg" /> Abbildung 3. Zeitverlauf der intrakardialen MDA-MB-231-Modell Obere Reihe:. Ex vivo-Bild zeigt GFP-Fluoreszenz am Tag 0, 14, 21, und 28 nach intrakardiale Injektion von MDA-MB-231. Beachten Sie, dass Tumorherde am Tag 14 nur in ex vivo sind nach Weichgewebe entfernen. Untere Reihe: Ex vivo Röntgenbildern der gleichen Femora Veranschaulichung osteolytische Knochenläsionen. Beachten Sie, dass Knochenabbau normalerweise nicht sichtbar, bis 3 Wochen nach herzchirurgischen Injektion. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig4.jpg" /> Abbildung 4. Quantifizierung der Knochen metastasiertem Progression. GFP + Tumor visualisiert Maestro Bildgebung ex vivo tibiae eines nicht-tumortragenden Maus (A) und einer Maus 4 Wochen nach intrakardiale Injektion eines GFP exprimierenden MDA-MB-231-Subklon (B). Tumorherde korrelieren mit Bereichen Knochenabbau wie durch Faxitron (D) gezeigt, im Vergleich einen Knochen ohne Tumor (C). Knochen strukturellen und mineralischen Daten aus MicroCT Messungen als 3D-Bilder eines gesunden Knochens (E) und einer tumortragenden Knochen (F), wo Bereichen Knochenabbau werden als nichtig Bereich angezeigt gerendert. Weitere Knochen-und Tumor Detail in entsprechenden H &amp; E gefärbten histologischen Schnitten (G &amp; H) gesehen.

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Exp. Metastasis. 20, 135-141 (2003).</li><li>Oyajobi, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+effects+of+macrophage+inflammatory+protein-1alpha+on+osteolysis+and+tumor+burden+in+the+murine+5TGM1+model+of+myeloma+bone+disease.">Dual effects of macrophage inflammatory protein-1alpha on osteolysis and tumor burden in the murine 5TGM1 model of myeloma bone disease.</a> Blood. 102, 311-319 (2003).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Studium der Tumor-induzierten Knochenerkrankungen verlassen sich auf mehreren Tiermodellen von denen die beiden am häufigsten verwendeten sind intrakardialen und intratibial Impfungen. In vielen Fällen intrakardialen ist die beste Option für die Untersuchung Metastasen in Knochen, aber es gibt nicht die volle metastatischen Prozess, und daher Brustfettpolster oder andere orthotopen Injektionen sollten idealerweise auf dieses Ziel verwendet werden. Tumorzellen nicht leicht metastasieren vom primären Standort in den m...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 Brustkrebszellen </td><td> Ursprünglich ATCC-Intern kloniert und ausgewählt </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech Inc </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlas Biological </td><td> F-0050a </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> GIBCO </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> Faxitron </td><td> Faxitron </td><td></td></tr><tr><td> Maestro </td><td> CRi </td><td></td></tr><tr><td> μCT-Scanner </td><td> Scanco </td><td></td></tr><tr><td> Nacktmausmodell </td><td> Harlan </td><td> Fox nu - / - </td></tr><tr><td> Insulinspritzen (300 ul, 28,5 g) </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309300 </td></tr><tr><td> IVIS </td><td> Caliper </td><td></td></tr><tr><td> Bestrahlten Rodent Diet </td><td> Teklad </td><td> 2920x </td></tr></tbody></table>

models of bone metastasis

Knochenmetastasen sind ein gemeinsames Auftreten in mehreren Malignitäten, einschließlich Brust-, Prostata-und Lungenkrebs. Einmal im Knochen festgestellt, sind Tumoren verantwortlich für erhebliche Morbidität und Mortalität 1. Somit besteht ein erheblicher Bedarf, um die molekularen Mechanismen, die die Einrichtung, Wachstums und der Aktivität von Tumoren in Knochen zu verstehen. Mehrere in-vivo-Modellen wurden eingerichtet, um diese Ereignisse zu studieren und jeder hat spezifische Vorteile und Einschränkungen. Das am häufigsten verwendete Modell nutzt intrakardialen Inokulation von Tumorzellen direkt in den arteriellen Blutversorgung athymischen (nackten) BalbC Mäusen. Dieses Verfahren kann auf viele verschiedene Tumortypen (unter anderem PC-3 Prostatakarzinom, Lungenkarzinom, und Maus Brustfettpolster Tumoren) aufgebracht werden, jedoch in diesem Manuskript wir uns auf die Brustkrebsmodell konzentrieren, MDA-MB-231. In diesem Modell nutzen wir eine hoch Knochen selektive Klon, ursprünglich in Dr. Mundy Gruppe in San Antonio 2 abgeleitet, dass hwie seit GFP-Expression transfiziert worden und durch unsere Gruppe 3 erneut geklont. Dieser Klon ist ein Knochen metastasierenden Variante mit einer hohen Rate von osteotropism und sehr kleine Metastasen in Lunge, Leber oder Nebennieren. Während intrakardiale Injektionen werden am häufigsten für Studien von Knochenmetastasen 2, in bestimmten Fällen verwendet intratibial 4 oder Brustfettpolster Injektionen sind besser geeignet. Intrakardiale Injektionen durchgeführt werden typischerweise bei der Verwendung von humanen Tumorzellen mit dem Ziel der Überwachung der späteren Stufen der Metastasenbildung, insbesondere die Fähigkeit der Krebszellen im Knochen zu verhaften, überleben, proliferieren und etablieren Tumoren, die in Krebs-induzierten Knochenerkrankung entwickeln. Intratibial Injektionen werden durchgeführt, wenn die sich auf die Beziehung von Krebszellen und Knochen nach ein Tumor an Knochen, die in etwa korreliert mit etablierten Knochenmetastasen metastasiert. Keines dieser Modelle rekapituliert frühen Schritte in der metastatischen Prozess vor Embolien und Eintragvon Tumorzellen in den Kreislauf. Wenn die Überwachung primäre Tumorwachstum oder Metastasen von primären Standort zu Knochen, dann Brustfettpolster Impfungen sind in der Regel bevorzugten, aber nur sehr wenige Tumorzelllinien konsequent den Knochen metastasieren vom primären Standort mit 4T1 Knochen bevorzugte Klone, eine Maus-Mamma- Karzinom, die Ausnahme 5,6. Dieses Manuskript Details Impfung Verfahren und Highlights wichtige Schritte in post Inokulation Analysen. Insbesondere umfasst es Zellkultur, Tumorzellinokulation Verfahren zur intrakardialen und intratibial Impfungen sowie kurze Informationen über wöchentliche Überwachung durch Röntgen, Fluoreszenz und histomorphometrische Analysen.

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Models of Bone Metastasis

Tiermodelle werden häufig genutzt, um Krebs Metastasen in Knochen zu untersuchen. In diesem Protokoll werden wir zwei gängige Methoden der Tumorinokulation für Knochenmetastasen Studien beschreiben und beschreiben Sie kurz einige Analysen genutzt werden, um zu überwachen und zu quantifizieren diese Modelle.

Models von Knochenmetastasen

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Research

JoVE Journal

Medicine

41.9K Aufrufe.  Vanderbilt University. Tiermodelle werden häufig genutzt, um Krebs Metastasen in Knochen zu untersuchen. In diesem Protokoll werden wir zwei gängige Methoden der Tumorinokulation für Knochenmetastasen Studien beschreiben und beschreiben Sie kurz einige Analysen genutzt werden, um zu überwachen und zu quantifizieren diese Modelle.

Serie: Models of Bone Metastasis

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Experimentelle Metastase Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Forschung

Medizin

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

In-vitro-Assay Mesothelzellen Ausverkauf, dass die Modelle der frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multimodale Bildgebung von Angiogenese in einem Nude Rattenmodell der Brustkrebs Knochenmetastasen mittels Magnetresonanztomographie, volumetrische Computertomographie und Ultraschall

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

Präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung von akuter Leukämie

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Ein orthotopen Mausmodell der menschlichen Prostatakrebs-Metastasen

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Adjustable Stiffness, External Fixator for the Rat Femur Osteotomy and Segmental Bone Defect Models

The mechanical environment around the healing of broken bone is very important as it determines the way the fracture will heal. Over the past decade there has been great clinical interest in improving bone healing by altering the mechanical environment through the fixation stability around the lesion. One constraint of preclinical animal research in this area is the lack of experimental control over the local mechanical environment within a large segmental defect as well as osteotomies as they heal. In this paper we report on the design and use of an external fixator to study the healing of large segmental bone defects or osteotomies. This device not only allows for controlled axial stiffness on the bone lesion as it heals, but it also enables the change of stiffness during the healing process in vivo. The conducted experiments have shown that the fixators were able to maintain a 5 mm femoral defect gap in rats in vivo during unrestricted cage activity for at least 8 weeks. Likewise, we observed no distortion or infections, including pin infections during the entire healing period. These results demonstrate that our newly developed external fixator was able to achieve reproducible and standardized stabilization, and the alteration of the mechanical environment of in vivo rat large bone defects and various size osteotomies. This confirms that the external fixation device is well suited for preclinical research investigations using a rat model in the field of bone regeneration and repair.

One constraint of preclinical research in the field of bone repair is the lack of experimental control over the local mechanical environment within a healing bone lesion. We report the design and use of an external fixator for bone repair with the ability to change fixator stiffness in vivo.

Einstellbare Steifheit, Fixateur externe für die Ratte Femurosteotomie und segmentale Knochendefekt Modelle

The mechanical environment around the healing of broken bone is very important as it determines the way the fracture will heal. Over the past decade there ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung der Maus Halslymphknoten

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

Ein &quot;Patient-Like&quot; Orthotope Syngene Maus-Modell der Leberzellkarzinom Metastasen

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Die Quantifizierung von Intraperitonealtest Ovarian Cancer Metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...