Nous tenons à remercier Andrea Portbury pour la lecture critique du manuscrit, le Laboratoire des services de microscope de l&#39;UNC pour l&#39;aide à la imagerie time-lapse, et le NIH (subvention n R01HL061656) pour le soutien financier.

1. Préparer Perles anticorps conjugués <ol><li> Un jour avant la dissection, mélanger l&#39;anticorps de choix avec les Dynabeads appropriées (par exemple Dynabeads IgG de rat pour un anticorps dirigé chez le rat, 4 x 10 8 perles / ml) selon les instructions du fabricant. Pour l&#39;anticorps anti-CD31 anticorps de rat BD (0,5 pg / pl, utilisé pour isoler des cellules endothéliales), trois anticorps pi est ajouté pour 25 perles pl, pour une concentration finale de 1,5 mg d&#39;anticorps anti-CD31 et 1 x 10 7 perles / 25 pi de tampon. </li><li> Incuber des perles et des anticorps nuit à 4 ° C. </li></ol> 2. Préparation de la plaque de collagène <ol><li> Cellules isolées forment tubules plus rapidement lorsqu&#39;il est cultivé sur un gel de collagène au lieu de simplement une plaque revêtue de collagène. Par conséquent, des gels de collagène sont effectués la nuit avant la dissection, comme décrit dans 6. Sur la glace dans une hotte de culture de tissus, mélanger les réactifs suivants (assez pour 19 puits): 206,4 pi H stérile &lt;sub&gt; 2 O, 140,4 pi de collagène de type I (4,08 mg / ml), 38,4 ul 10x M199, et 1,15 pi 5 M NaOH. </li><li> Pipeter 20 ul de ce gel de collagène dans les puits d&#39;une plaque de culture tissulaire à 384 puits. Placer la plaque dans un 37 ° C incubateur de culture tissulaire pendant 30 min. </li><li> Ajouter 80 ul DMEM à chaque puits et incuber pendant 15 min à 37 ° C. Retirez le milieu de culture et répéter deux fois plus. </li><li> Après le rinçage final, ajouter 80 ul 10% de FBS / DMEM à chaque puits et incuber pendant la nuit à 37 ° C. Supprimer le milieu de culture avant l&#39;addition des cellules isolées. </li></ol> 3. Accise et de digérer le Cœur <ol><li> Euthanasier une souris timed-enceinte au jour embryonnaire désirée à l&#39;aide d&#39;une technique d&#39;euthanasie approuvé. Toutes les expériences ont été approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel d&#39;utilisation à l&#39;Université de Caroline du Nord à Chapel Hill. </li><li> Avec la souris en position couchée, généreusement pulvériser la face ventrale de la femelle à l&#39;éthanol 70% avantdissection. En utilisant une pince pour soulever la peau de l&#39;abdomen inférieur et le muscle à l&#39;écart des organes internes, coupé ouvrir la cavité abdominale inférieure de la femelle de visualiser les organes internes. </li><li> En tenant le col de l&#39;utérus avec une pince, découpez soigneusement caudale à la pince de levage et de commencer la corne utérine de la cavité abdominale. Tout en soulevant la corne utérine, couper n&#39;importe quel tissu conjonctif qui tient la corne en place. Pour finir exciser la corne utérine, couper la jonction de la corne utérine avec l&#39;oviducte pour libérer la corne utérine. </li><li> Placez la corne utérine dans une boîte de Pétri contenant froid 1x saline tamponnée au phosphate (PBS) et rincer si nécessaire. Couper la corne utérine via la ligne médiane pour exposer les sacs embryonnaires joints. </li><li> Couper un sac embryonnaire à la jonction du placenta et de l&#39;embryon pour éviter de couper accidentellement l&#39;embryon et récupérer un embryon. Placez l&#39;embryon dans une seconde boîte de Pétri avec du PBS froid. Retourner la boîte de Pétri avec la corne utérine à la glace. </li><li> Decapitate l&#39;embryon pour améliorer l&#39;accès à la paroi thoracique. Si génotypage est nécessaire, couper la queue pour enlever et sauver dans un tube Eppendorf placé sur la glace. </li><li> Avec l&#39;embryon sur le dos, couper ouvrir la cage thoracique pour visualiser le cœur et les poumons. Pour éviter de couper le cœur, faire une coupe verticale sur le côté de la cage thoracique, près d&#39;une patte avant, suivi par une coupe horizontale à travers le bas des côtes, puis tirez doucement sur la paroi thoracique et hors de la voie. Up par jour environ 13,5 embryonnaire, la paroi thoracique est transparent, facilitant la visualisation. </li><li> Soulevez délicatement le cœur à l&#39;aide des pinces et couper les vaisseaux ci-dessous. Ensuite, coupez au-dessus des grands vaisseaux de libérer le cœur. Si les vaisseaux pulmonaires ne sont pas coupés, les poumons peuvent être enlevées avec le coeur. Ainsi, enlever les tissus extérieurs, comme les poumons, le cas échéant. </li><li> Séparez et jeter les vaisseaux oreillettes et des ventricules grand. Avec des ciseaux, émincer les ventricules en petits morceaux (environ 1 mm 3 &lt;/ Sup&gt;) et placer dans environ 500 pi collagénase (1 mg / ml dans du PBS stérile). Conserver les échantillons sur la glace jusqu&#39;à ce que toutes les ventricules ont été hachées et placées dans la collagénase. </li><li> Répétez les étapes précédentes jusqu&#39;à ce que les ventricules ont été supprimés de tous les embryons, la collecte de chaque cœur dans un tube Eppendorf séparé. Si tous les embryons ont le même génotype, coeurs peuvent être regroupés dans un seul tube Eppendorf. Le nombre d&#39;échantillons traités en une seule fois peut être limité en fonction de l&#39;aimant utilisé pour l&#39;isolation, la DynaMag (123-21D) utilisé ici est titulaire d&#39;un maximum de 16 tubes Eppendorf. </li><li> Placez les ventricules hachés à 37 ° C avec des rocking pendant 45 min. Toutes les 15 min, retirez délicatement les échantillons et la pipette de haut en bas de dissocier mécaniquement les cellules. </li></ol> 4. Isoler les cellules endothéliales <ol><li> Faire passer la solution ventricule collagénase travers un filtre pour éliminer les agrégats de cellules restantes 70 um. </li><li> Centrifuger les cellules à 400 g pendant 10 min. Jeterle surnageant, remplacer avec environ 200 pi 10% de FBS dans DMEM, et la pipette de haut en bas pour dissocier les cellules. </li><li> Répétez l&#39;étape précédente fois. Centrifuger les cellules à 400 g pendant 10 min après le second 10% de FBS / DMEM laver. Reprendre les cellules dans 50 ul 10% de FBS / DMEM. </li><li> Pendant l&#39;étape de centrifugation finale, préparer les perles. <ol><li> Placer le tube Eppendorf contenant l&#39;anticorps et des perles sur un aimant pendant 1 min. </li><li> Avec le tube en place sur l&#39;aimant, éliminer le surnageant. Retirer le tube de l&#39;aimant et ajouter environ 100 pi 10% de FBS / DMEM. </li><li> Placer le tube sur l&#39;aimant pendant 1 min. Retirer le surnageant et laver de nouveau avec 10% de FBS / DMEM. Répétez l&#39;opération pour un total de 3 lavages. </li><li> Après le lavage final, remettre en suspension les perles d&#39;anticorps conjugués à 10% de FBS / DMEM (5 pi par exemple). </li></ol></li><li> Pour chaque échantillon de cellules, ajouter 5 pi des perles d&#39;anticorps conjugués. Placez les suspensions de billes cellules à 4 ° C avec bascule foR 30 min. </li><li> Sous une hotte à flux laminaire, placer les tubes Eppendorf contenant des cellules et des billes-anticorps conjugués sur l&#39;aimant pendant 1 min. Retirer le surnageant, retirez les tubes de l&#39;aimant, et laver avec environ 100 pi 10% de FBS / DMEM. Répétez l&#39;opération pour 5 lavages. </li><li> Après le dernier lavage, placez les tubes sur l&#39;aimant pendant 1 minute, retirer le surnageant, et retirez les tubes de l&#39;aimant. Ajouter environ 100 ul DMEM. </li><li> Placer les tubes sur l&#39;aimant pendant 1 minute, retirer le surnageant, et retirez les tubes de l&#39;aimant. Ajouter 100-200 ul préchauffé 0,25% de trypsine-EDTA. Incuber les échantillons à 37 ° C et 5% CO2 pendant 5 min. </li><li> Placer les tubes sur l&#39;aimant pendant 2 min. Soigneusement transférer le surnageant contenant les cellules dans des tubes Eppendorf. Centrifuger pendant 5 min à 400 x g. </li><li> Eliminer le surnageant. Resuspendre les cellules dans 80 à 100 ul de milieu de croissance et de la plaque dans un 96 - ou 384 puits boîte de culture traitée, en fonction du rendement attendu(Environ 450-600 cellules des ventricules E14.5-E16.5 embryons). Pour les cellules endothéliales, en utilisant un milieu de culture de croissance de l&#39;endothélium (défini ci-après). </li></ol>

<ol>
	<li>Landecker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Life: How Cells Became Technologies. , (2007).</li><li>Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+dysfunction+and+cytoskeletal+changes+associated+with+repression+of+p16(INK4a)+during+immortalization.">Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization.</a> Oncogene. , (2012).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+endothelium:+an+emphasis+on+heterogeneity.">Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity.</a> Semin. Thromb. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells.">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).</li><li>Frauli, M., Ludwig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+a+culture+of+human+endometrial+stromal+cells+using+a+medium+containing+D-valine.">Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).</li><li>Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+L-valine+reduced+selective+media.">Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media.</a> Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).</li><li>Arima, S., Nishiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement.">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Travailler avec des cellules embryonnaires primaires permet des expériences nouvelles pour traiter in vitro étapes critiques du développement. Toutefois, la procédure d&#39;isolement n&#39;est pas anodin. Les étapes critiques pour isoler un type de cellules comprennent veillant à ce que les cellules sont bien séparés par digestion par la collagénase, puis qu&#39;ils sont bien en suspension au cours des étapes de lavage. Dissection mécanique par pipetage contribue grandement séparer les cellules lors...

L&#39;avènement de lignées cellulaires immortalisées a révolutionné la biologie cellulaire de base 1. Les lignées cellulaires actuellement disponibles sont issus d&#39;un large éventail d&#39;organes et englobent tous les principaux types de cellules. Cependant, les lignées cellulaires établies ont certaines limites. Le processus d&#39;immortalisation change évidemment le comportement des cellules, en particulier en ce qui concerne la durée de vie et la prolifération, mais peut également affecter l&#39;expression des protéines inattendus, tels que les protéines du cytosquelette 2. En outre, bien que de nombreuses lignées cellulaires différentes sont disponibles, il ya une diversité importante chez un même type de cellule unique dans un organisme entier. Les cellules endothéliales en particulier montrent divers comportements selon qu&#39;elles ligne artères ou des veines et quel type de flux est présent dans la cuve 3. Encore plus pressant dans une perspective développementale, cependant, est que la grande majorité des lignées cellulaires disponibles sont dérivées de tissus adultes (voir, par exemple til collecte disponible via ATCC). Ces lignées de cellules adultes susceptibles ne récapitulent la nature dynamique de leurs précurseurs embryonnaires. L&#39;évolution rapide des modes d&#39;expression des gènes au cours du développement spatio-temporelles observées suggèrent également qu&#39;une cellule endothéliale d&#39;un organe à un stade de développement donné peut ne pas se comporter de la même manière qu&#39;une cellule endothéliale de ce même organe à un stade de développement différent. Comme alternative à l&#39;utilisation de lignées cellulaires immortalisées disponibles dans le commerce, les cellules primaires peuvent être isolées à partir du tissu d&#39;intérêt spécifique. Parmi les avantages de cette technique, ces cellules primaires peuvent être isolés à partir d&#39;un organe spécifique ou même une partie d&#39;un organe à n&#39;importe quel stade de développement spécifique. En outre, ces cellules primaires peuvent être isolés de la grande variété d&#39;animaux transgéniques disponibles, permettant l&#39;étude in vitro des huitièmes de finale de gènes et knock-in tout en évitant d&#39;autres problèmes tels que l&#39;efficacité de la transfection in. Sans surprise, de nombreuxtechniques ont été publiés en détail comment isoler des types cellulaires spécifiques 4,5. En général, ces techniques consistent à recueillir la région d&#39;intérêt, dissocier les cellules, le marquage du type de cellule spécifique d&#39;intérêt, et d&#39;isoler ces cellules pour une analyse ultérieure. Pour étudier une population embryonnaire précoce des cellules endothéliales coronaires, on ramenait une technique 4 précédemment publié pour être utilisé avec un organe plus petit. Avec cette procédure allégée, nous pouvons isoler les cellules endothéliales coronaires du cœur embryonnaire à des stades embryonnaires spécifiques. Ces cellules peuvent ensuite être utilisés dans des essais endothéliales traditionnelles, telles que les analyses de migration. Jusqu&#39;à ce que les lignées cellulaires embryonnaires deviennent plus nombreux, en collaboration avec les cellules primaires est une technique précieuse.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Timed-pregnant mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be dissected at the embryonic stage of interest</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-mouse CD31</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553370</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rat IgG Dynabeads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>110-35</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cellgro </td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich </td>
			<td>F2442 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endothelial cell growth medium</td>
			<td>(made in lab as described in notes)</td>
			<td></td>
			<td>DMEM containing 20% FBS, 5 &mu;M &beta;-mercaptoethanol, 50 &mu;g/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECGS</td>
			<td>Biomedical Technologies, Inc.</td>
			<td>BT-203</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>384-well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>T-3037-6</td>
			<td>Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>BD</td>
			<td>354236</td>
			<td>Use at a final concentration of 1.5 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>M199, 10x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Syto-16</td>
			<td>Invitrogen </td>
			<td>S7578 </td>
			<td>Used as directed in 13 </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Nikon </td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo </td>
			<td>3110 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DynaMag</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-21D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Table-top centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75002430</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation of embryonic ventricular endothelial cells

La culture cellulaire a grandement amélioré notre capacité à évaluer les différentes populations de cellules dans des conditions de culture innombrables. Alors que des lignées cellulaires immortalisées offrent des avantages significatifs pour leur facilité d&#39;utilisation, ces lignées cellulaires ne sont pas disponibles pour tous les types cellulaires potentiels. En isolant les cellules primaires à partir d&#39;une région d&#39;intérêt, en particulier à partir d&#39;une souris transgénique, des études plus nuancées peuvent être effectuées. La technique de base consiste à disséquer l&#39;organe ou partielle d&#39;intérêt (par exemple le cœur ou une région spécifique du cœur) et dissocier l&#39;organe de cellules individuelles. Ces cellules sont ensuite incubées avec des billes magnétiques conjuguées avec un anticorps qui reconnaît le type de cellule d&#39;intérêt. Les cellules d&#39;intérêt peuvent alors être isolées à l&#39;aide d&#39;un aimant, par une courte incubation de la trypsine dissocier les cellules à partir des perles. Ces cellules isolées peuvent alors être cultivées et analysées comme vous le souhaitez. Cette technique a été conçu à l&#39;origine pour orgue de souris adultes, mais peut être facilement réduite pour une utilisation avec les organes embryonnaires, comme le démontre le présent document. Parce que notre intérêt est dans le système vasculaire coronarien développement, nous avons voulu étudier cette population de cellules embryonnaires au cours des étapes spécifiques. Ainsi, le protocole initial a dû être modifié pour être compatible avec la petite taille des ventricules embryonnaires et le faible rendement potentiel des cellules endothéliales à ces stades de développement. En utilisant cette approche à échelle réduite, nous avons évalué coronaire remodelage plexus dans les cellules endothéliales transgéniques ventriculaires embryonnaires.

En utilisant un anticorps spécifique de l&#39;endothélium qui reconnaît CD31, les cellules endothéliales ont été isolés à partir des ventricules embryonnaires (E) 13,5 (figure 1A) et 18.5 (figures 1B-1D) embryons. Lorsqu&#39;il est cultivé sur une boîte de culture traitée, ces cellules restent arrondis et pourraient former un motif de pavés si près de confluence (figure 1A). Diluer collagène a également été utilisé pour recouvrir les puits, et tandis q...

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Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

La culture de la cellule primaire est une technique utile pour l&#39;analyse de populations spécifiques de cellules, en particulier à partir d&#39;embryons de souris transgéniques à des stades spécifiques du développement. Ici, ventricules embryonnaires sont disséqués et dissociées, et des perles anticorps conjugués à reconnaître et séparer les cellules endothéliales pour une analyse ultérieure.

Isolement des cellules endothéliales embryonnaires ventriculaires

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.3K vues.  University of North Carolina at Chapel Hill. La culture de la cellule primaire est une technique utile pour l'analyse de populations spécifiques de cellules, en particulier à partir d'embryons de souris transgéniques à des stades spécifiques du développement. Ici, ventricules embryonnaires sont disséqués et dissociées, et des perles anticorps conjugués à reconnaître et séparer les cellules endothéliales pour une analyse ultérieure.

Vidéo: Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

Isolement de cellules humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Recherche

Biologie

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

Les cellules souches embryonnaires des cellules dérivées endothéliales pour traitement de l&#39;ischémie des membres postérieurs

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

L&#39;isolement des cellules endothéliales valvulaires

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

Isolement et culture de cellules progénitrices embryonnaires aviaires valvulaire

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolement et culture de cellules endothéliales pulmonaires des souris néonatales

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolement des cellules endothéliales murines Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolement de cellules de souris coronaire endothéliales

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Isolement de myocytes auriculaires et ventriculaires murins de haute qualité pour des mesures simultanées des transitoires Ca2+ et du courant calcique de type L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...