Yazarlar, bu çalışmanın yürütülmesi boyunca yararlı tartışmalar için harata laboratuar üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği, distoni Tıbbi Araştırma Vakfı, Edward Mallinckrodt, Jr Vakfı, Ulusal Bilim Vakfı ve NCH için Whitehall Vakfı hibe tarafından finanse edildi

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Biz, spontan ve minyatür sinaptik aktivite uyarılmış ve destaining aşamasında görüntüleme için yanıt sinaptik veziküller boyama ve lekenin için protokoller tanımlamışlardır. Mevcut protokoller ek olarak, minyatür sinapsis aktivitesine dayandığı FM destaining gözlemleme yeni bir protokol dahil ettik. Bu protokolleri kullanarak, önceden hareket bozukluğu distoni bir fare modeli kültürlü nöronlar anormallikleri tespit. Yüksek etkinlik 20 ile uyarıldığında, vahşi tip farelerde mu...

Sinaptik veziküllerin işlevi sinaptik iletim önemli bir belirleyicisidir. Bunların presinaptik plazma zarı (ekzositozu) ile kaynaştırmak zaman bu veziküller nörotransmitter serbest bırakmak ve bunlar plazma zarı (endositoz) rejenere edilmiş ve nörotransmitter ile yeniden sonra serbest bir çevrimi için hazır hale gelir. Dinamikleri ve sinaptik vezikül geri dönüşüm altında yatan mekanizmaları içine Araştırma ölçüde Stiril FM boyaların 1 tanıtımı ile birlikte ivme kazanmıştır. Pozitif (Şekil 1A, Şekil 1B FM1-43 StereoView birden boyalar) hidrofilik baş grupları ve hidrofobik kuyrukları ücret bu amfipatik moleküller, tersine çevrilebilir girmek ve onları nüfuz etmeden lipid membranlar çıkabilirsiniz. FM boyaların grupları yaydıkları ışık aralığını etkileyen benzer özellikler taşırlar. Örneğin, FM2-10, FM1-43 ve-84 FM1 iki siklik bileşikler ve sho arasında bir çift bağa sahipw yeşil emisyon. Aralarındaki fark, hidrofob belirler ve bu nedenle zardan çıkış hızı (departitioning), hidrofobik kuyruk uzunluğudur. FM5-95 ve FM4-64 durumlarda, üç çift bağlar siklik bileşikler bağlamak ve onlar kırmızı emisyon göstermektedirler. Bu boyalar, hidrofilik kısmına göre değişir. Vadesi hidrofilik çevreye hidrofobik ortam göreceli olarak kuantum veriminde bir artışa bağlı olarak, biyolojik zarların içine sokulur, tüm FM boyalar olarak, floresan yoğunluğu artar. Böylece FM şiddetindeki değişiklikler membran ciro değişiklikleri temsil eder. Farklı renk (emisyon spektrumları) ve hidrofobluğa FM sinaptik vezikül geri dönüşüm çok yönlü bir araştırma aracı boyar yapmak. Bu özelliklere bağlı olarak, FM boyalar çok sinaptik vezikül geri dönüşüm analiz aşağıdaki şema (Şekil 2) uygun olarak kullanılmaktadır. NöronBu endositoz (boyama) yoluyla meydana olarak s sinaptik vesiküller (SVS) içine alınacak etkinleştirme, FM, boyayı ihtiva eden bir hücre dışı çözelti içinde banyo edilir. Daha sonra boya, boya içermeyen hücre dışı çözelti uygulanması ile yıkanır, bu, yani yalnızca aktif geçiren endositoz boya (Şekil 2, alt) ile yüklenir sinaptik veziküllerin bir küme içerir işlevsel sinir terminalleri, ortaya koymaktadır. Sonraki ekzositozu hücre dışı alanı için FM boya kaybı ve floresan bir eşlik eden kaybına neden olur (destaining, nedeniyle bir hidrofilik çevreye departitioning ve uzak ekzositoz sitesinden difüzyon hem de). Bu nedenle FM floresan yoğunluğundaki değişiklikler sinaptik vezikül ekso-ve endositoz göstergeleridir. FM boyalar, çeşitli organizmalar ve preparatlar 2,3 sinaptik veziküllerin leke ve destain için kullanılmıştır. Örnekler memeli Neur dahilÖnal kültürleri 4-9, memeli beyin dilimleri 10,11, nöromüsküler kavşakları 12,13, retina bipolar nöronlar 14,15 ve kokleanın 16 saç hücreleri. Genellikle bu tür deneylerde, boyama ve destaining hem yoğun nöron (uyarılmış aktivite) uyararak tetiklenir. Bir dış etmenin etkisi ile (kendiliğinden ve minyatür sinaptik aktivite) 9,17-19 yokluğunda olduğu gibi geri dönüşüm Ancak son zamanlarda, zayıf bir uyarıya yanıt olarak sinaptik vezikül geri dönüşüm aynı zamanda, analiz edilmiştir. Spontan ve minyatür sinaptik faaliyetleri hareket potansiyellerinin kendiliğinden ateş (Şekil 3) içeren önceki ile, dış uyaranların yokluğunda meydana olanlar olarak tanımlanmaktadır. Bu zayıf sinaptik faaliyetleri geniş uyarılmasıyla tetiklenen daha FM sinyalleri olarak daha küçük değişikliklerle ilişkilidir. Ölçüm gerektirir FM fluoresc değişimlerence yoğunluğu doğru sinaptik vezikül eksositosizini veya endositozu ama yoğunluğu yapay olmamasını değişiklikleri yansıtacak. Dışlayıcı bir nedeni FM boyalar ile, plazma zarının spesifik olmayan lekelenme varlığıdır. Bu bileşenin kademeli yıkama hatalı sinaptik faaliyetleri atfedilen edilecek ölçülen floresan yoğunluğunda kademeli bir değişim, yol açacaktır. Bu faktör (Protokolü bakınız) uygun yöntemlerle azaltılabilir. Dışlayıcı en önemli nedeni sinaptik keseler içinde tutulan FM boya photobleaching olduğunu. FM yoğunluğu ışıkla ağartma ilgili değişiklikler ölçülür biyolojik (sinaptik) değişikliklere göre küçük olmalıdır. Hassas kameralarının son gelişmeler, örneğin, elektron-çarparak şarj-kuplajlı aygıt (EMCCD) kamera, mümkün maruz kalma süresini kısaltarak ve fluorofor uyarmak için kullanılan ışığın yoğunluğunu zayıflatarak ışıkla ağartma en aza indirdiği bulunmuştur. Dışlayıcı bir başka nedeni bir sürüklenme in ışık mikroskobu odaklama seviyesi. Bir görüntüleme oturumu sırasında odak kayması mekanik ya da termal etkilere neden olabilir ve hatalı ölçülen floresan yoğunluğunda bir değişikliğe yol açacaktır. Burada, bu durum özellikle, minyatür sinaptik etkinliği, daha zayıf ya da herhangi bir stimülasyon bağlamında sinaptik vezikül geri dönüşüm analiz etmek için FM boyaların kullanımı gerekli protokolleri ve donanım tarif etmektedir. Biz kültürlü kemirgen hipokampal nöronlar kullanarak ve destaining faz görüntüleme, uyarılmış ve spontan sinaptik olaylar sırasında veziküllerin boyama ve destaining örneklerini göstermektedir. Biz de sinaptik faaliyetleri herhangi bir FM boya kaybı yokluğunda, FM boya ağartmanın derecesini değerlendirmek nasıl gösterilmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1767">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pulse generator</td>
			<td>AMPI</td>
			<td>Master-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolated stimulator</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>DS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>This is used for assessing the cell morphology at low magnification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TiE</td>
			<td>This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. &#62;10 &#956;m).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032509</td>
			<td>490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032809</td>
			<td>490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXon EM+ DU-860</td>
			<td>This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid recirculating chiller</td>
			<td>Solid State Cooling Systems</td>
			<td>Oasis 160</td>
			<td>This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80&#176;C, and thereby reducing noise.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>CoolLED-Custom Interconnect</td>
			<td>490 nm&#160;</td>
			<td>This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Solis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-21BRFS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast perfusion system</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-77B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D,L-AP5</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>0106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1069</td>
			<td>Caution: toxic reagent. Handle with care.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T35356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F35355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; balanced salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>51200-038</td>
			<td>This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Caution: toxic reagent. Handle with care.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of synaptic vesicle recycling using fm dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities

Fonksiyonel sinir terminalleri sinaptik kesecikler ekzositoz ve endositoz tabi. Bu sinaptik vezikül geri dönüşüm etkili membran ciro ortaya styryl FM boyalar kullanılarak analiz olabilir. FM boyaların kullanılması için geleneksel protokolleri uyarılmış (uyarılmış) sinaptik etkinliği aşağıdaki nöronlar analiz etmek için tasarlanmıştır. Son zamanlarda, bu tür protokoller spontan veya minyatür sinaptik olaylar gibi zayıf sinaptik faaliyetleri, eşlik FM sinyallerini analiz için kullanılabilir hale gelmiştir. FM sinyalleri, bu küçük değişikliklerin analizi görüntüleme sistemi, yoğunluğu küçük değişiklikler tespit etmek için yeterince duyarlı olan, ancak büyük genlikli bu suni bastırılmış değişiklikler gerektirir. Burada, uyarılmış spontan ve minyatür sinaptik faaliyetleri, ve bir örnek olarak kültürlü hipokampal nöronlar kullanmak için uygulanabilir bir protokol açıklar. Bu, önemli olduğu için bu protokol, aynı zamanda, boyaların FM ışıkla ağartma oranını değerlendirmek için bir araç içeriryoğunluğundaki küçük değişiklikler görüntüleme eserler kaynağıdır.

Bir örnek olarak, sinaptik veziküllerin destaining zaman süreci (Şekil 4) için temsilci sonuçlar göstermektedir. Kültür hipokampal nöronlar spontan sinaptik etkinliği (adım 2.3) kullanılarak FM4-64 ile boyanmış ve boya içermeyen çözeltisi (çözelti 2 yıkama) ile yıkanmıştır. Görüntüleme spontan aktivite (adım 5.3) (sürekli çizgi ilk parçası, Şekil 4A) kullanılarak başlangıç ​​destaining zaman sürecini gösterir. Bu, yaklaşık 120 saniye boyunca...

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities at JoVE.com

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Fonksiyonel sinir terminallerinin sinaptik vezikül görüntü geri dönüşüm için stiril FM boyaların kullanımını tarif eder. Bu protokol, sadece uyarılmış için değil, aynı zamanda doğal ve minyatür sinaptik faaliyetleri uygulanabilir. Protokol etkili değerlendirilebilir sinaptik olayların çeşitli genişletir.

Uyarılmış, Spontan ve Minyatür Synaptic Faaliyetleri Sırasında FM boyalar kullanarak sinaptik vezikül Geri Dönüşüm Sınavı

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

examination-synaptic-vesicle-recycling-using-fm-dyes-during-evoked

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Neuroscience

Cellular Processes

Membranes and Cellular Transport

SCIENTISTS IN ACTION

20.9K Görüntüleme.  University of Iowa Carver College of Medicine.  Fonksiyonel sinir terminallerinin sinaptik vezikül görüntü geri dönüşüm için stiril FM boyaların kullanımını tarif eder. Bu protokol, sadece uyarılmış için değil, aynı zamanda doğal ve minyatür sinaptik faaliyetleri uygulanabilir. Protokol etkili değerlendirilebilir sinaptik olayların çeşitli genişletir. 