Bu eser kısmen JSP'ler KAKENHI grant numaraları 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536 ve 17 K 07086, MEXT KAKENHI grant numaraları AMED Grant numarası JP18ek0109311, 25110737 ve 23110525 ve SENSHIN Tıbbi Araştırma Vakfı ve Japonya ile desteklenmiştir Epilepsi Araştırma Vakfı.

Tüm deneysel prosedürler hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Tokyo Metropolitan tıbbi Bilim Enstitüsü tarafından kabul edildi. Doğum sonrası 8 - 16-hafta-yaşlı fareler tavsiye edilir. Doğuştan herhangi bir yük deneme için kabul edilebilir olduğunu. BALB/c ve Swiss albino farelerin PTZ için daha hassas ise C57BL/6 fareler PTZ için daha dayanıklıdır. C57BL/6 Bu çalışmada kullanılmıştır. Güvenlik Açığı için PTZ da fareyi yaş üzerinde bağlıdır. Küçük fareler için karşılaştırıldığında, büyük fareler PTZ35' e daha ateşe dayanıklı değildir. Bu yöntem için kullanılan hayvan sayısı değişebilir, ancak en az 6-10 hayvan her koşul için gereklidir.
1. PTZ hazırlanması
<ol><li>2 mg/mL PTZ steril %0,9 (w/v) NaCl geçiyoruz. PTZ kullanım gününde hazırlamak.</li>
</ol>2. enjeksiyon PTZ
<ol><li>Saat 9:00 ve 12:00 (Öğle) arasındaki tüm deneyler yapmak.</li>
	<li>Hayvanın vücut ağırlığı ölçmek.</li>
	<li>Hayvan bir gözlem odası habituation için yerleştirin.</li>
	<li>Habituation dönemde (3 dk), hayvan ve önceden belirlenmiş enjeksiyon doz vücut ağırlığına göre enjeksiyon için PTZ çözüm hacmi hesaplamak. Not: 35 mg/kg PTZ kullanılır, örneğin, PTZ 0.875 mg 25 gr ağırlığında bir fare için gereklidir (35 mg / kg x 0.025 kg 0,875 = mg). Bu nedenle, 2 mg/mL PTZ çözüm 437.5 μL enjekte (0,875 mg/2 mg / mL = 0.4375 mL). PTZ enjeksiyon doz fare genotip ve zorlanma bağlıdır. Vahşi tipli C57BL/6 fareler için 30-35 mg PTZ/kg vücut ağırlığı bir doz ilk deneme için önerilir. PTZ duyarlılık fare kullanılan zorlanma36üzerinde,37bağlıdır. Enjeksiyon dozu deneme amaçlı göre değişir.</li>
	<li>PTZ intraperitoneally 27'lik iğne için hayvanın karın sol veya sağ çeyreğine bağlı 1 mL şırınga ile enjekte. Orta hat enjekte kaçının.<ol>
<li>Aynı konumda tekrarlanan enjeksiyon kaçının.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PTZ Yönetim (Şekil 1A), sonra 30 dk için hayvan davranışlarını gözlemlemek ve sınıflandırmak ve aşağıda gösterildiği gibi anormal davranış puanı. Mümkünse, hayvanlar 24 h veya en az bir ek 6-10 h sonrası enjeksiyon için gözlem altında özellikle nöbet önem skor 3 ulaştığında veya yukarıda tut.<ol>
<li>Not herhangi bir hafif nöbetler veya 30-dak gözlem döneminin ötesinde hayvan davranış değişiklikleri. Bu gözlem süresi PTZ subconvulsive bir doz özellikle önemli ve tam etkisini epilepsi kronik sebepsiz yere ele geçirme vakaları nesil adresi olabilir uzun.</li>
		<li>Ayrıca, ölçü değişiklikleri olarak gözlenen her nöbet nöbet süresi nöbet süresi içinde ilgili nöbet önem. Ayrıca, ilk nöbet geçirdikten sonra PTZ enjeksiyon için gecikme süresi toplamak için başka bir önemli ölçüde olur. Nöbet sıklığını, süre ve gecikme süresi izleme herhangi bir sonrası nöbet Moleküler çalışmalar için önemlidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PTZ her geçen gün (Şekil 1A) enjekte. Enjeksiyonları deneme amaçta bağlıdır. Temsilcisi örnekler aşağıdaki gibidir:<ol>
<li>Hayvanlar, tamamen tutuşturulmuş bir kez bir hayvan nöbet puanı 5 (tonik-klonik nöbet) deneyimleri oluşturmak için enjeksiyon ek üç idareler içinde son. Bu durumda, nöbet puanı için üç ardışık idareleri artırmaz Eğer enjeksiyon dozu arttırmak. Her hayvan farklı sayı ve PTZ enjeksiyonları doz alabilirsiniz.</li>
		<li>Fix numarası ve PTZ enjeksiyon doz için PTZ Anti-epilepsi ilaçları ilişkin değerlendirmeler ve genetiği değiştirilmiş fare fenotip çalışmaları da dahil olmak üzere, güvenlik açığı değerlendirmek için her durumda. Bütün hayvanlar PTZ enjeksiyonları aynı sayıda vermek; Toplam 8-12 enjeksiyonları önerilir. Eğer bir hayvan ölürse, nöbet skor olarak 6 ile belirtilen.</li>
		<li>Enjeksiyon dozu yüksek nöbet korumak için gerekli belirlemek puan edinildi (4 veya 5) 10 veya daha fazla enjeksiyonları epileptik nöbetler oluşan histopatolojik değişiklikleri incelemek. Bu durumda, toplam enjeksiyon sayısı 25 dan 30'a mesafe. Nöbet puanı 5 ulaşırsa enjeksiyon dozu azalt. Nöbet puanı 3 veya daha düşük azalırsa, enjeksiyon dozu arttırmak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. nöbet puanı
<ol><li>Hayvan davranışlarını gözlemlemek ve puanları kaydedin.<ol>
<li>Sınıflandırmak ve epileptik davranışlarını izler38,39 (Şekil 1B) puan: 0: normal bir davranış, hiçbir anormallik. 1: immobilizasyon, karnına yalan. 2: baş başını sallayarak, yüz, forelimb veya hindlimb myoklonus. 3: sürekli tüm vücut myoklonus, Miyklonik gerizekalı, kuyruk kaskatı kaldırdı. 4: yetiştirme, tonik nöbet, yan tarafında düşme. 5: tonik-klonik nöbet, sırtını, acele ve atlama vahşi düşme. 6: ölüm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Racine puanı40, deneysel şartlarına bağlı olarak temel davranış ölçütünü değiştirin.</li>
</ol>4. sonrası nöbet Analizi
<ol><li>Immunohistopathological Analizi<ol>
<li>Perfüzyon fiksasyon<ol>
<li>Hazırlık<ol>
<li>%4 (w/v) paraformaldehyde (PFA) 0.1 M fosfat tampon (pH 7,4) geçiyoruz. Çözüm 1 M NaOH (yaklaşık 1 µL 50 mL PFA çözüm için 1 M NaOH) bir damla ilavesi ile yaklaşık 70 ° c ısı.</li>
				<li>Buz gibi 4 hazırlamak % PFA ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS).</li>
				<li>Peristaltik pompa, bir tüp ve iğne ile ayarlayın. Yaklaşık 20 mL su tüpünden kalıntı temizlemek için çalıştırın. O zaman, açık sonuna tüp buz gibi PBS yer.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Transcardial perfüzyon ve sabit beyin hazırlanması<ol>
<li>Fare ile % 50 isoflurane/50% Etanol küçük bir kavanoza derin anestezi.</li>
				<li>Fare onların ön ayakları ve hindlimbs iğneleyerek sırtüstü pozisyonda tutun.</li>
				<li>Karın ventral orta hat kesilmiş ve diyafram bulaşmasına neden.</li>
				<li>Diyafram kostal kenar boşluğu kesin. Sonra kaburga ve vücut yan her iki tarafında kesti. Xiphoid işlemi tarafından kilitleme forseps pinch ve göğüs kafesi çıkar. Bir iğne ile sabitleme veya forseps ile pinching tarafından xiphoid sürecinin yerini korumak. Kalp ortaya çıkarmak.</li>
				<li>İğne sol ventrikül yerleştirin ve makas kullanırken sağ atrium bir kesim yapmak. Bir iç duvarı delip geçebilir gibi iğne çok ileri kalp içine itmek için değil unutmayın.</li>
				<li>Buz gibi PBS sürekli bir akış (yaklaşık 15-20 mL/dk) kan yıkamak için iğne ile başlar.</li>
				<li>Kan vücuttan seçili olmadığında, tüp kabarcıklar ek olmadan %4 paraformaldehyde çözüm (yaklaşık 60 mL) taşıyın. O zaman, perfüzyon!</li>
				<li>Arka boyun ve omurga kesti ve baş cilt ve makas diseksiyon ile kafatası dorsal kısmı kapalı soyma.</li>
				<li>Göz yörüngeleri arasındaki premaxillary kemik kesme ve kafatası sırt kısmını tamamen kaldırmak.</li>
				<li>Arka taraftan beyin ve jugal kemik arasında bir boşluk oluşturmak ve trigeminal sinir ve optik hemisferlerine altında beyin kesti. Dikkatle beyin çıkarın ve % 4 içeren bir şişede yerleştirin PFA. 12-16 saat için 4 ° C'de beyin sonrası tamir et.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Beyin dilim hazırlık<ol>
<li>Beyin cryoprotection için izin vermek için çözüm içine batar kadar sabit beyin % 20 sükroz/PBS için transfer.</li>
			<li>Gerekli dilim yönlendirme ve gerekli beyin parçası dayalı sabit beyin kesti.</li>
			<li>Cryomicrotome ayarlayın. Bıçak bulunduğu atayıp microtome sahne altında-20 ° c sıcaklıkta saklamanız</li>
			<li>Önceden kesilmiş beyin sahnesinde yerini ve % 20 sükroz/PBS ile beyin ceket. Sükroz/PBS çözüm yavaş yavaş beyin tamamen donmuş % 20 sükroz/PBS içinde gömülü olduğu kadar beyin sahne alanı'nda kapsayan dondurdu.</li>
			<li>Beyin (30 µm kalınlık) bıçak doku ile kaydırarak dilim. Dilimleri PBS aktarmak ve onları 4 ° C'de tutmak</li>
		</ol>
</li>
		<li>Floresan immünhistokimya<ol>
<li>Gerekli dilimleri %0,1 yıkama Triton X-100/PBS (PBST) 10 dk, 3 kat, oda sıcaklığında (RT) için.</li>
			<li>Onları PBST %2 keçi serum veya %5 Sığır serum albümin (BSA) için 1-2 h RT. ile kuluçka tarafından dilimleri engellemek</li>
			<li>Bir antikor çözüm 4 ° C'de 1-7 geceleme için birincil antikor PBST % 2 keçi serum veya %5 BSA ile uygun bir konsantrasyon ile dilimleri kuluçkaya</li>
			<li>Dilimleri 3 kez, RT. 10 dk içinde PBST yıkama</li>
			<li>Dilimleri ikincil antikor PBST içinde 1-2 h, RT, ışık korumalı için uygun konsantrasyonu ile ikincil antikor çözümde kuluçkaya.</li>
			<li>Dilimleri cam slaytlar üzerine monte ve montaj orta ve cam ile kaplayın.</li>
			<li>Floresans mikroskobu dilimlerle gözlemlemek.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Üç-odası testi<ol>
<li>Hazırlık<ol>
<li>En az 2 2-6 aylık 129/Sv fareler "yabancı fare." olmak aynı cinsiyetten konu fareler olarak hazırlamak İçinde belgili tanımlık kafes analiz önce tüm fareler alıştırmak. Her eğitim oturumu için kafeste fareyi getirin ve fareyi 15 dakika bırakın.</li>
			<li>Konu fare ile her habituation aşama önce tüm cihazları ve her iki kafesler %70 etanol ile yüzey silerek temizleyin.</li>
			<li>3-odası aparatı iki yan odaları boş kafesleri yerleştirebilir ve odalar arasında kapılar açabilirsiniz.</li>
			<li>Konu fare alıştırmak için merkezi odasında bir konu fare yerleştirin ve serbestçe aparatı fare her iki kafesleri araştırmış, artı, kafes korkulu olabilir bir ek 5 dk. konu hayvan yapmak kadar taşımak fareyi sağlar 20 dk için kafes araştırmak ve bu analiz için kullanılmamalıdır. Bu tür hayvanlar kafes önlemek ve nadir kafes yakın olur.</li>
			<li>Hayvan merkezi odasına hamle sonra kapıları kapatır ve serbestçe hareket merkezi odasında 5 min için fare bildirir. Bu dönemde, 129/Sv fareler birini kafese alıştırmak için bir kafes içinde koymak.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sociality Analizi<ol>
<li>Hemen konu fare habituation süre sonra bu analizlerini.</li>
			<li>129/Sv fare içeren kafes yerleştirin, "yabancı 1 kafeste", yan odaları biri olarak adlandırdığı ve "nesne kafeste", diğer yan odası olarak adlandırılan boş kafese koyun.</li>
			<li>Kapıyı aç ve konu fare davranışınızı izleyebilir.</li>
			<li>Konu fare özgürce 10 dakikadır hareket ve aşağıdaki davranış parametreleri kaydetmek izin verir. Konu fare fare yabancı 1 kafes kaçınarak ve odaları biri köşesinde kalan gösterildiği gibi fare yabancı 1 kafeste Eğer korkuyorsa, hayvan analiz için kullanılmamalıdır. a) zaman her odası, yabancı 1 odası, nesne odası ve merkezi odası içinde geçirdi. b) zaman her kafes, yabancı 1 kafes ve nesne kafes soruşturma geçirdi. (Fare fare algılaması eğer belgili tanımlık kafes soruşturma veya toughing fare veya kafes sınıflandırılır) c) (isteğe bağlı) her odasına giriş sayısı d) toplam mesafe (isteğe bağlı) seyahat</li>
			<li>Merkezi odanın içine fare hareket sonra kapıları kapatın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sosyal yenilik Analizi<ol>
<li>Hemen sociality analizden sonra bu analizlerini.</li>
			<li>Her iki kafesler %70 etanol ile silin.</li>
			<li>"Yabancı 2 kafes" ve odaların birinde yer yabancı 2 kafes olarak adlandırdığı kafesleri, başka bir 129/Sv fare yerleştirin. Yabancı 1 fare "yabancı 1 kafes" olarak adlandırılan diğer kafesin içine yerleştirin ve yabancı 1 kafes diğer odasında yerleştirin.</li>
			<li>Kapıyı aç ve konu fare davranışınızı izleyebilir.</li>
			<li>Konu fare özgürce 10 dakikadır taşımak izin ve sociality analiz için açıklanan aynı davranış parametrelerini ölçmek. Not: Yabancı 1 ve yabancı 2 fare rasgele seçilmelidir. Yabancı 1 Oda ve nesne odası yanı sıra yabancı 1 odası ve yabancı 2 odası rastgele tespit edilmelidir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Bağlamsal korku ayrımcılık<ol>
<li>Merkezi Klima<ol>
<li>Her Klima duruşmadan önce deneysel cihazları % 70 etanol ile yüzey silerek temizleyin.</li>
			<li>Klima cihazları belirli koşullara sahip bir fare yerleştirin (aparatı şekli, duvar rengi, kat malzeme, koku, aydınlatma ve arka plan gürültü ses önceden saptanır). Örneğin, burada kullanılan klima cihazları bir kare aparatı ile şeffaf Pleksiglas duvarlar, bir metal ızgara zemin, bir etanol koku, 100 lux parlaklık ve 65 dB arka plan beyaz gürültü oldu.</li>
			<li>Ayak-şok 0.1-mA elektrik şokları 2 için takma ad-rasgele zamanlaması ile tarafından fare durumu s x 3 kez 5 dk boyunca.</li>
			<li>Fare Klima sonra eve kafes dönmek.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bellek değerlendirmesi<ol>
<li>Her değerlendirme önce deneysel cihazları % 70 etanol ile yüzey silerek temizleyin.</li>
			<li>Ertesi gün aşağıdaki Klima, fare şok koşulu olarak aynı Aparat içine koyun ve 5 dk boyunca donma süre ölçebilir.</li>
			<li>Daha sonra aynı gün içinde bir roman aparatı fareyi getirin ve bir dakika 5 değerlendirme sırasında donma süre ölçebilir. Bir üçgen aparatı beyaz Pleksiglas duvarlar, plaka kat, hiçbir koku, 30 lux parlaklık ve 70 dB Beyaz gürültü ile burada kullanılmıştır.</li>
			<li>Dondurma zaman aynı koşul ve Roman durumu arasında karşılaştırmak. Fareler bir normal bellek yeteneği ile roman durumda aynı durumda daha fazla buz tutar. Donma olduğunu hayvan fazla 2 için tanımlanmış hareketsizlik s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Burada, epilepsi farmakolojik bir hayvan modeli kurulması için yaygın olarak erişilebilir bir protokol mevcut. Kimyasal çıra PTZ-aracılı uzun bir geçmişi vardır ve epilepsi41histopatoloji ve hücresel patoloji incelenmesi için genel kabul görmüş bir modeldir. Epilepsi kimyasal çıra modelinin daha önce Suzdak ve Jansen, 199542tarafından gözden geçirilmiş. PTZ, özellikle ile farmakolojik nöbet indüksiyon şiddetli nöbetler çağrıştıran bir kolay ...

Epilepsi tarafından tekrarlayan nöbetleri ile karakterize ve insanların yaklaşık % 1'i etkileyen kronik nörolojik bir hastalıktır. Epileptogenesis ve el koyma nesil Epilepsi hastalarında temel mekanizmaları tam olarak klinik çalışmalarda açıklık olamaz. Bu nedenle, uygun bir hayvan modeli epilepsi1çalışması için gereklidir.
Hayvan modelleriyle epilepsi epilepsi fizyolojisi araştırmak ve anti-epileptik ilaçlar2,3tanımlamak için kullanılmıştır. Bu modeller arasında farmakolojik nöbet indüksiyon epilepsi4patoloji incelenmesi için hayvan bir model oluşturmak için kullanılan yaygın bir yöntemdir. Bu ucuz ve basit bir yöntemdir. Elektrot-aracılı, çıra da yaygın olarak kullanılan bir yöntem ama bu yordamı daha yüksek maliyetlerdir ve Yöntem tekrarlayan nöbetlere5ikna etmek için cerrahi ve elektrik becerileri gerektirir.
Zamanlama ve ele geçirme vakalarının sayısı kolaylıkla kontrol farmakolojik indüksiyon de avantajlı çünkü. Spontan nöbetler sergi genetik fare modelleri de epilepsi çalışmada kullanılır. Ancak, ne zaman ve ne sıklıkta bu genetik modellerinde nöbetler ortaya tahmin etmek imkansız6olabilir. Bir izleme sistemi genetiği değiştirilmiş fare6epileptik davranışlarını gözlemlemek için gereklidir.
Kainic asit, pilokarpin ve pentylenetetrazole (PTZ) nöbet indükleyici ilaç7yaygın olarak kullanılmaktadır. Glutamat reseptörlerinin için bir agonist kainic asittir ve kolinerjik reseptörler pilokarpin etkinleştirir. PTZ olduğunu bir gamma aminobütirik asit (GABA)-reseptör antagonisti8. PTZ inhibitör sinapslarda, işlev artmış nöronal aktivite için önde gelen bastırır. Bu yönetmelik jeneralize nöbetler hayvanlar9' neden olur. Kainic asit ve pilokarpin tek bir enjeksiyon akut nöbetler, özellikle durum epileptikus (SE)10,11 tetikleyebilir ve kainic asit veya pilokarpin-aracılı SE kronik ve tekrarlayan spontan nöbetler12 teşvik , 13. electroencephalographic (EEG) kayıtları ve davranış analizi belirtilen tekrarlayan spontan nöbetler bir ay sonra bir tek enjeksiyon12,13gözlenir. PTZ kasılan bir doz tek bir enjeksiyon da akut kriz neden olmaktadır. Ancak, kronik spontan nöbetler PTZ tek bir enjeksiyon sonra teşvik etmek zordur. PTZ kronik İdaresi tekrarlayan nöbetleri14ikna etmek için gereklidir. Her iki yöntemde, tekrarlayan nöbetlere nesil bir patoloji daha insan epilepsi için benzer akut nöbetleri üretimi ikna etmek yapabiliyor. PTZ, söz konusu olduğunda her enjeksiyon nöbet uyandıran ve kademeli bir şekilde her enjeksiyon ile nöbet önem daha şiddetli olur. Son olarak, tek bir düşük doz PTZ enjeksiyon şiddetli tonik-klonik nöbet neden olmaktadır. Bu aşamada, her enjeksiyon şiddetli nöbetler çağrıştırır. Buna ek olarak, nöbet gecikme süresi ve süresi de enjeksiyonları boyunca değiştirir. Gecikme süresi tonik nöbet için sık sık15çıra ikinci aşamasında daha kısa olur. Ayrıca, nöbet tırmandığı bir uzun süreli nöbet süresi16tarafından eşlik ediyor. Nöbet önem düzenleyen moleküler mekanizması araştıran, gecikme süresi ve süre, anti-epileptik ilaçların17,18,19eleme için kullanışlıdır.
Nöbetler sık PTZ tek sistemik yönetimi tarafından indüklenir ve 30 dk4,5içinde kurtarma çok hızlıdır. Böylece, ele geçirmelerin sayısı PTZ-çıra modelinde daha fazla kontrol edilebilir. Ancak, EEG izleme Genelleştirilmiş sivri PTZ-aracılı nöbet20sonra 12 saat kadar görülebilir belirtti. Bu nedenle, hayvanlar tercihen müşahede çıra mekanizmaları altında 24 saat sonra daha kesin çözümleme için Miyklonik veya tonik nöbet21 kalmalıdır.
Önce veya sonra PTZ enjeksiyon yönetim ethosuximide, valproat, phenobarbital, vigabatrin ve retigabine3gibi anti-epileptik ilaçların tırmandığı nöbet önem derecesi3,22azaltır, 23. Benzer şekilde, nakavt fareler eksikliği genler FGF-222625 ve neuritin, nöbet alevlenmesi, matriks metalloproteinaz-924gibi içinde ilgili birden çok PTZ enjeksiyonları sonra indirimli nöbet önem sergilemek gösterilmiştir. Epileptik nöbetler sonra bu yöntem ile mümkün Ayrıca, histopatolojik değişiklikler gözlemleyerek. Temporal lob epilepsi olan hastalarda tipik histolojik değişiklikler vardır yosunlu fiber çimlenme27,28, anormal granül nöron geçiş29, astrogliosis30, nöronal hücre gibi beyin Ölüm hipokampus31,32ve hipokampal skleroz33. Benzer değişiklikler epileptik modeli hayvanlarda gözlenir. Mevcut yöntemler arasında kimyasal çıra PTZ-aracılı bir hayvan modeli epilepsi üretmek için bir iyi, tekrarlanabilir ve ucuz yöntemdir. Pilokarpin-aracılı SE modelinde, nöbet kontrolü zordur ve birçok fareler ölmek ya da SE34geliştirmek başarısız. Buna ek olarak, mortalite ve nöbet önem PTZ modelinde daha fazla kontrol edilebilir. Ayrıca, PTZ kainic asit ucuzdur ve becerileri fare beyin cerrahisinde ilaç idaresi için gerekli değildir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pentylenetetrazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>MANAC</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse</td>
			<td>CLEA Japan</td>
			<td></td>
			<td>C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1mL)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle(27G x 3/4&#34;) (0.40 x 19 mm)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scale</td>
			<td>Mettler</td>
			<td>PE2000</td>
			<td>This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&#38;D company.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristatic pump</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>SJ1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>30404-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>REM-700</td>
			<td>This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>S35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-synaptoporin antibody</td>
			<td>Synaptic systems</td>
			<td>102 002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ZnT3 antibody</td>
			<td>Synaptic systems</td>
			<td>197 002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-doublecortin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8066</td>
			<td>This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contextual fear discrimination test apparatus</td>
			<td>O&#39;hara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three chamber test apparatus</td>
			<td>Muromachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pentylenetetrazole-induced kindling mouse model

Pentylenetetrazole (PTZ) GABA-A reseptör antagonisti var. Subconvulsive bir doz sıralı enjeksiyon kimyasal kindling, bir epilepsi modeli geliştirilmesi için kullanılan, ancak PTZ mayi bir iğne içine bir hayvan, yüksek doz, akut, şiddetli bir nöbet neden olmaktadır. PTZ tek bir düşük doz enjeksiyon kasılma nöbetlerinden olmadan hafif nöbet neden olmaktadır. Ancak, PTZ tekrarlayan düşük doz enjeksiyonlari eşik kasılan nöbet uyandırmak için azaltın. Son olarak, sürekli düşük doz yönetimi PTZ şiddetli tonik-klonik nöbet neden olmaktadır. Bu yöntem basit ve yerde tekrarlayan nöbetlere içerir kronik bir hastalık olarak tanımlanır epilepsi Patofizyoloji araştırmak için geçerli değildir. Bu kimyasal kindling Protokolü hayvanlarda tekrarlayan nöbetlere neden olur. Bu yöntemle, güvenlik açığı PTZ-aracılı nöbetler veya tırmandığı epileptik nöbetlerin derecesini tahmin edilmiştir. Bu avantajları anti-epileptik ilaçlar ve epilepsi ile ilgili genleri süzmek için bu yöntemin kullanılması yol açmıştır. Buna ek olarak, bu yöntem epileptik hastaların beyinlerinde gözlenen histolojik değişiklikler da kimyasal tutuşturulmuş hayvanların beyinlerinde görünür çünkü nöronal hasar sonra epileptik nöbetler araştırmak için kullanılmıştır. Böylece, bu protokole uygun epilepsi hayvan modelleri üretmek için yararlıdır.

PTZ tekrarlanan enjeksiyon nöbet şiddetinde artışa neden olmaktadır. Altı C57BL/6 fareler PTZ ile tedavi edildi ve başka bir 6 fareler bir kontrol grubu olarak serum ile tedavi edildi. PTZ verilendozun 35 mg/kg ve 10 enjeksiyonu uygulandı. Hiçbir nöbetler veya anormal davranışlar serum enjeksiyonları (Şekil 2) tarafından uyarılmış, ancak nöbet puanı PTZ enjeksiyonları ile yavaş yavaş arttı. Bonferroni testi ile takip ANOVA PTZ tedavi g...

Watch this Scientific Journal Video about Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model at JoVE.com

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Bu iletişim kuralı ile pentylenetetrazole kimyasal çıra yöntemi açıklar ve epilepsi bir fare modeli sağlar. Bu iletişim kuralı, farelerde epileptik nöbetler sonra nöbet indüksiyon ve Escherichia türleri için güvenlik açığı araştırmak için de kullanılabilir.

Pentylenetetrazole kaynaklı çıra fare modeli

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

pentylenetetrazole-induced-kindling-mouse-model

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Pharmacotherapy of the Epilepsies

SCIENTISTS IN ACTION

32.4K Görüntüleme.  Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science. Bu iletişim kuralı ile pentylenetetrazole kimyasal çıra yöntemi açıklar ve epilepsi bir fare modeli sağlar. Bu iletişim kuralı, farelerde epileptik nöbetler sonra nöbet indüksiyon ve Escherichia türleri için güvenlik açığı araştırmak için de kullanılabilir.

Video: Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Nörobilim

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer&#039;s Disease Mouse Model

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

Nöritik plaklar Alzheimer Hastalığı Fare Modeli Algılama

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages of using an IVSA paradigm to study the reinforcing properties of drugs of abuse such as cocaine include the fact that the drug is self-administered instead of experimenter-administered, the schedule of reinforcement can be altered, and accurate measurement of the quantities of drug consumed as well as the timing and pattern of IV injections can be obtained. Furthermore, the intravenous route of administration avoids potential confounds related to first pass metabolism or taste, and produces rapid increases in blood and brain drug levels. As outlined in this video, intravenous self-administration can be obtained without prior food restriction or prior drug training following careful catheter placement during surgery and meticulous daily catheter flushing and maintenance. Experimental procedures outlined in this paper include a description of animal housing and acclimation methods, operant training using sweetened milk solutions, and catheter implantation surgery.

The intravenous self-administration (IVSA) paradigm is considered to be the gold standard in examining the reinforcing properties of drugs of abuse in rodents. This manuscript outlines the experimental procedures and surgical techniques necessary to obtain reliable IVSA data. In particular, meticulous catheter implantation and maintenance are highlighted.

Bir Fare Modelinde İntravenöz Öz Yönetim Yöntemleri

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex three-dimensional retinal blood vessels and capillaries by creating a two-dimensional flat-mount of the interconnected vascular channels after digestion of the non-vascular components of the retina. This allows one to study various pathologic vascular changes, such as microaneurysms, capillary degeneration, and abnormal endothelial to pericyte ratios. However, the method is technically challenging, especially in mice, which have become the most widely available animal model to study the retina because of the ease of genetic manipulations 6,7. In the mouse eye, it is particularly difficult to completely remove the non-vascular components while maintaining the overall architecture of the retinal blood vessels. To date, there is a dearth of literature that describes the trypsin digest technique in detail in the mouse. This manuscript provides a detailed step-by-step methodology of the trypsin digest in mouse retina, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Trypsin digest is one of the most commonly used methods to analyze retinal vasculature. This manuscript describes the method in detail, including key alterations to optimize the technique and remove the non-vascular tissue while preserving the overall architecture of the vessels.

Tripsin Digest Protokolü Fare Modeli Retina damarları Analiz

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

Kornea mikrocep Testi: Fare Eye Angiogenezis Bir Model

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

Multipl Skleroz Fare Modeli Progressive Nörolojik Engellilik Ölçümü

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Neurobehavioral Assessments in a Mouse Model of Neonatal Hypoxic-ischemic Brain Injury

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI brain injury by studying neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated (i.e., normal) mice. During the study, Rice-Vannucci&#39;s method was used to induce neonatal HI brain damage in postnatal day 7-10 (P7-10) mice. The HI operation was performed on the pups by unilateral carotid artery ligation and exposure to hypoxia (8% O2 and 92% N2 for 90 min). One week after the operation, the damaged brains were evaluated with the naked eye through the semi-transparent skull and were categorized into subgroups based on the absence (&#34;no cortical injury&#34; group) or presence (&#34;cortical injury&#34; group) of cortical injury, such as a lesion in the right hemisphere. On week 6, the following neurobehavioral tests were performed to evaluate the cognitive and motor functions: passive avoidance task (PAT), ladder walking test, and grip strength test. These behavioral tests are helpful in determining the effects of neonatal HI brain injury and are used in other mouse models of neurodegenerative diseases. In this study, neonatal HI brain injury mice showed motor deficits that corresponded to right hemisphere damage. The behavioral test results are relevant to the deficits observed in human neonatal HI patients, such as cerebral palsy or neonatal stroke patients. In this study, a mouse model of neonatal HI brain injury was established and showed different degrees of motor deficits and cognitive impairment compared to non-operated mice. This work provides basic information on the HI mouse model. MRI images demonstrate the different phenotypes, separated according to the severity of brain damage by motor and cognitive tests.

We performed unilateral carotid artery occlusion on postnatal day 7-10 CD-1 mouse pups to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of HI brain injury. We studied neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated normal mice.

Yenidoğan hipoksik-iskemik beyin hasarı, fare modeli neurobehavioral değerlendirmesi

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

Vivo Multimodal görüntüleme ve fare lazer kaynaklı Choroidal neovaskülarizasyon Model analizi

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

Embriyonik Neurogenesis çalışmak için bir Model olarak fare arka beyin

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

Preparation and Implantation of Electrodes for Electrically Kindling VGAT-Cre Mice to Generate a Model for Temporal Lobe Epilepsy

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique VGAT-Cre mice were used in developing spontaneous recurring seizures (SRS) after kindling and a likely mechanism - insertion of Cre into the VGAT gene - disrupted its expression and reduced GABAergic tone. The present study extends these observations to a larger cohort of mice, focusing on key issues such as how long the SRS continues after kindling and the effect of the animal's sex and age. This report describes the protocols for the following key steps: making headsets with hippocampal depth electrodes for electrical stimulation and for reading the electroencephalogram; surgery to affix the headset securely on the mouse's skull so that it does not fall off; and key details of the electrical kindling protocol such as duration of the pulse, frequency of train, duration of train, and amount of current injected. The kindling protocol is robust in that it reliably leads to epilepsy in most VGAT-Cre mice, providing a new model to test for novel antiepileptogenic drugs.

This report describes the methods to generate a model of temporal lobe epilepsy based on the electrical kindling of transgenic VGAT-Cre mice. Kindled VGAT-Cre mice may be useful in determining what causes epilepsy and for screening novel therapies.

Temporal lob epilepsisi için bir model oluşturmak üzere elektriksel olarak çırılan VGAT-Cre fareleri için elektrotların hazırlanması ve implantasyonu

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique ...