Bu protokol, insan kan-beyin bariyerinin bir hücre modelinde hücreler arası sıkı kavşakların işlevsel bütünlüğünü belirlemek için sağlam bir tekniktir. Bu daha uzun bir kinetik tsömede çalışan yerine daha kısa bir süre içinde görünür geçirgenlik hesaplanmasısağlayan basit ve oldukça ucuz bir protokoldür. Bu yöntem aynı zamanda polimer DNA nano tanecikleri ile transfected beyin endotel hücrelerinde sıkı kavşakların fonksiyonel bütünlüğünü belirlemek için kullanılabilir.
Hücre kaplamasına başlamak için, 24 kuyulu bir kültür plakası içine mikro gözenekli membranlar ile doku kültürü ekler yerleştirin. Her doku kültürü eklemek 0.15 miligram-mililitre başına kollajen tip bir 400 mikrolitre ekleyin. Sonra 37 derece santigrat, %5 karbondioksit kuvözde bir saat kuluçkaya yat.
Doku kültürü ekler mikro gözenekli membran üzerinde kollajen çözeltisi bile yayılmasını sağlamak için 24-iyi plaka yavaşça rock. Bir saat sonra, kollajen çözeltisini çıkarın ve mikro gözenekli membranı 0,4 mililitre 1X PBS tamponuyla nazikçe yıkayın. Şimdi, plaka hCMEC/D3 hücreleri yoğunluğu 50, 000 hücre kare başına hücre ekler.
Hücre bağlanmasıve çoğalması için 24 kuyulu plakayı kuvöze doku kültürü kurulumu ile yerleştirin. Hücrelerin %100 biraraya gelmesi için tabağı yedi gün kuluçkaya yatırın. Her gün büyüme ortamını çıkarın ve 0,5 mililitre önceden ısıtılmış taze medyayı doku kültürü uçlarına aktarın.
DNA nanopartikül transfeksiyonu için ZO-1 ekspresyonundaki değişiklikleri belirlemek ve transfected hücrelerde hücre canlılığını belirlemek için ATP testi için Batı lekeleme için kaplama prosedürünü tekrarlayın. Lucifer Sarı belirgin geçirgenliği belirlemek için, her gün tohumlama sonrası, büyüme ortamı kaldırmak ve kuyunun bazolateral tarafına önceden ısıtılmış taşıma tampon 1.5 mililitre ekleyin. Şimdi her trans-iyi eklemek apikal tarafına 20 mikromolar Lucifer Sarı çözelti 58,3 mikrolitre ekleyin.
Floresan ölçümleri için çözeltinin 50 mikrolitresini saklayın. Apikal taraftan artık PBS tampon tamamen çıkardıktan sonra, hücreleri kurutmaönlemek için mümkün olduğunca çabuk Lucifer Sarı çözüm ekleyin. Apikal tarafta Lucifer Sarı çözeltisinin doğru hacimlerini sağlayın.
Tüm eklere Lucifer Yellow çözeltisinin aynı ve doğru hacmini eklediğinizden emin olun. Hücrelerin kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışın. Hücreleri 100 RPM ve 37 santigrat derecede 60 dakika boyunca bir döner plaka shaker'da kuluçkaya yatırın.
Daha sonra her apikal bölmeden Lucifer Sarı örnek 30 mikrolitre çıkarın. 20 mikromolar Lucifer Sarı çözeltisini ve apikal yan numuneleri önceden etiketlenmiş tüplere aktarın. Şimdi taşıma tamponkullanarak örnek on kat seyreltin.
Her bazolateral bölmeden 500 mikrolitre çıkarın ve numuneyi önceden etiketlenmiş tüplere aktarın. Standart eğri için bir dizi Lucifer Sarı standardı hazırlayın. Yinelenen siyah 96 kuyulu plakanın her kuyuya her standart apikal ve bazolateral numuneden 100 mikrolitre ekleyin.
Lucifer Sarı floresan yoğunluğunu ölçmek ve el yazması metinde açıklandığı gibi görünür geçirgenliği hesaplamak için bir floresan mikroplaka okuyucu kullanın. Sıkı kavşak oluşumunun görünür kinetiklerini belirlemek için Lucifer Sarı geçirgenliği üzerindeki kültatifzamanın etkisi kullanılmıştır. Görünen geçirgenlik değerleri ilk güne kıyasla yedinci günde önemli ölçüde azaldı, bu da bariyerin daha sıkı hale geldiğini düşündürüyor.
Görünen geçirgenlik değerleri daha sonra 10 güne kadar stabilize. Bu bariyer oluşumu tam ve fonksiyonel olduğunu ima, azalmış Lucifer Sarı parasellüler taşıma ile sonuçlanan. Batı lekeleme zaman içinde sıkı kavşak proteini ZO-1 ifadesinde değişiklikleri tespit etmek için kullanılmıştır.
İki grup iki ZO-1 İzoformtemsil eder. Densitometri analizi ZO-1 piksel değerinin üç günden yedi tohumlama sonrası güne kadar arttığını ortaya çıkararak, sıkı kavşak proteini ZO-1'in üç günden yedi güne kadar sürekli olarak oluştuğunu düşündürmektedir. Tohumlamasonrası yedinci günde kalsiyum tükenmesi tedavisinden sonra ZO-1 bandı neredeyse tespit edileemedi ve bu da ZO-1'in kalsiyum iyonlarının yokluğunda oluşamadığını gösteriyordu.
Sonuçlarda gösterildiği gibi, Sıkı kavşak proteinlerinin ifade düzeyindeki değişiklikleri belirlemek için ZO-1 proteininin Batı'da blotlanması, Lucifer Sarı tabanlı fonksiyonel aktivite verilerini tamamlayarak gerçekleştirilebilir. Ayrıca insan beyin endotel hücrelerinde sıkı kavşakların fonksiyonel aktivitesinin DNA nanopartikül transfeksiyonundan etkilenmediğini keşfettik.
