Beyne ilaç dağıtımı bir zorluk olmaya devam etti. Beyne teslimatı iyileştirmek için yeni nanomalzemelerden oluşan büyük panellerin geliştirilmesi, klinik öncesi tahliller çerçevesinde beyin penetrasyonunu tahmin etmek için gerçek in vitro mikrosisteme duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır. Bu tekniğin temel avantajı, kan beyin bariyeri fenotipinin indüksiyonu için gerekli olan hücre hücresi iletişimine izin veren aynı sistem içindeki kan beyin bariyerinin serbest ağrı hücresel gerçeklerini buzlamaktır.
Ayrıca, her hücre tipi daha ileri moleküler analiz için ayrı ayrı izole edilebilir. Model, sağlıklı ve patolojik koşullarda çok çeşitli deneyler için kullanılabilir ve molekül ve parçacık taşımacılığının klinik öncesi değerlendirmelerinin yanı sıra hücreler arası ve hücre içi kaçakçılık için değerli bir araçtır. Prosedürü gösteren Dr. Clemence Deligne ve Dr. Eleonora Rizzi olacak.
Kuyucukları santimetre kare başına 500 mikrolitre iki mikrogram Poli-L-Lizin çözeltisi ile kodlayarak başlayın. Gece boyunca veya 37 santigrat derecede en az bir saat boyunca inkübe edin ve Poli-L-Lizin çözeltisini, aspirasyon sistemine bağlı bir cam pipetle dikkatlice çıkarın. Daha sonra steril su ile iki kez durulayın.
Astrositleri toplamak için, önce astrositleri bir kez 10 mililitre ılık 1X PBS CMF ile yıkayın. Bunları% 5 karbondioksit ve% 21 oksijen altında 37 santigrat derecede 10 mililitre sıcak% 20 Tripsin EDTA çözeltisi ile üç dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri şişeden mekanik olarak ayırın ve süspansiyonu beş mililitre sıcak seyreltilmemiş FCS içeren konik bir tüpe aktarın.
Süspansiyonu 20 santigrat derecede beş dakika boyunca 190 kez G'de santrifüj yapın. Hücre peletini beş mililitre ılık astrosit ortamında tekrar askıya alın, ardından hücre süspansiyonunun 20 mikrolitresini 80 mikrolitre 1X PBS CMF ile seyreltin. Mikroskop altında manuel bir sayma odası kullanarak hücreleri sayın.
Her Poli-L-Lizin santimetre kare başına yaklaşık 40.000 hücre, 1.5 mililitre sıcak astrosit ortamı hacminde önceden kodlanmıştır. Geri döndürülmüş kesici uç filtrelerini 25 milimetre yüksekliğindeki kapalı bir kabağın çevresine yerleştirin ve kesici uç filtrelerine 250 mikrolitre kolajen tip bir çözelti ekleyin. Bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
Ardından, aspirasyon sistemine bağlı bir cam pipetle kollajen tip bir çözeltiyi dikkatlice çıkarın. Oda sıcaklığında 250 mikrolitre DMEM yüksek glikoz ile iki kez yıkayın ve tüm çözeltiyi kesici uç filtrelerinden dikkatlice çıkarın. Perisitleri 10 mililitre ılık 1X PBS CMF ile iki kez yıkayın ve hücreleri iki mililitre ılık Tripsin ile inkübe edin.
Tripsin'in etkisini izlemek için mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin. Hücreler ayrılmaya başladığında, Tripsin'i çıkarın, ardından hücrelere beş mililitre sıcak endotel hücresi bazal ortamı veya ECM ekleyin ve mekanik ayrışmaya başlayın. Hücre süspansiyonunun 20 mikrolitresini 80 mikrolitre 1X PBS CMF ile seyreltin ve daha önce gösterildiği gibi mikroskop altında manuel bir sayma odası kullanarak hücreleri sayın.
Tohum 44, santimetre kare başına 500 hücre üzerinde önceden kodlanmış ters çevrilmiş insert filtreler hacminde 250 mikrolitredir. Kesici uç filtrelerini nemlendirilmiş bir inkübatörde %5 karbondioksit ve %21 oksijen altında üç saat boyunca 37 santigrat derecede tutun. Kesici uç filtrelerini kuyu başına 1,5 mililitre sıcak ECM içeren 12 kuyucuklu bir plakaya dikkatlice geri döndürmek için steril cımbız kullanın.
Kesici uç filtreleri artık diğer taraftan kaplanmaya hazırdır. Üst tarafı ve kesici uç filtrelerini 500 mikrolitre hücre dışı matris bazlı hidrojel ile kaplayın. Kesici uç filtrelerini nemlendirilmiş bir inkübatöre bir saat boyunca% 5 karbondioksit ve% 21 oksijen altında 37 santigrat derecede yerleştirin.
Oda sıcaklığında 500 mikrolitre DMEM yüksek glikoz ile bir kez yıkayın. Endotel hücre kültürünü bir kez 10 mililitre ılık 1X PBS CMF ile yıkayın ve hücreleri iki mililitre ılık Tripsin ile inkübe edin. Hücreler ayrılmaya başladığında tripsin çıkarın, ardından beş mililitre sıcak ECM ekleyin ve mekanik ayrışmaya başlayın.
Hücre süspansiyonunun 20 mikrolitresini 80 mikrolitre 1X PBS CMF ile seyreltin ve manuel bir sayma odası kullanarak hücreleri sayın. Endotel hücrelerini, 500 mikrolitre sıcak ECM hacminde önceden kodlanmış kesici uç filtreler üzerinde santimetre kare başına 71.500 hücre yoğunluğunda tohumlayın. Astrosit ortamını kuyu başına 1,5 mililitre sıcak ECM ile değiştirin.
Daha sonra tohumlanmış kesici uç filtrelerini astrositleri içeren kuyucuklara aktarın. Üç kültürlü hücre sistemlerini nemlendirilmiş bir inkübatöre% 5 karbondioksit ve% 21 oksijen altında 37 santigrat derecede yerleştirin. Bir aspirasyon sistemine bağlı bir cam pipet kullanarak ortamı üst ve alt bölmeden dikkatlice çıkarın.
Ortamı, üst bölmede 500 mikrolitre ve alt bölmede 1,5 mililitre hacimde ılık ECM ile değiştirin. Aynı prosedürü tekrarlayarak ortamı altıncı güne kadar her gün yenileyin. Son olarak, hücreleri% 5 karbondioksit ve% 21 oksijen altında 37 santigrat derecede nemlendirilmiş inkübatöre geri koyun.
İmmünositokimya verileri, perisitler için trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü beta ve Desmine ve astrositler için glial fibriler asidik protein gibi geleneksel belirteçlerin ekspresyonunu doğruladı. Bu nedenle, perisitler ve astrositlerle altı günlük kültürden sonra, Ve-Kadherin'in yapışkan bağlantı boyaması ile görselleştirilen beyin benzeri endotel hücrelerinin veya BLEC'lerin tek katmanı, hücre sınırlarında TJ proteinleri CLD5 ve Z-01'in sürekli bir lokalizasyonunu gösterir. BLACS'ın floresan BBB bütünlük belirteçlerine, sodyum floreseine ve FITC dekstrana parasellüler geçirgenliği burada gösterilmiştir.
BLEC'lerde R123 hücre içi birikim, efflux pompa inhibitörü Elacridar'ın varlığında, yokluğu ile kontrol durumuna kıyasla önemli bir artış göstermiştir. Bu, BLEC'lerde aktif efflux pompa moleküllerinin, yani P glikoprotein ve meme kanseri direnç proteininin veya BCRP'nin varlığını gösterir. RPLP0 ekspresyonu ile normalleştirilen sıkı bağlantı proteinleri, taşıyıcılar ve büyük molekül reseptörlerinin gen ekspresyonu burada gösterilmiştir.
Burada, birden büyük değerler, üçlü kültür modelinde daha yüksek gen ekspresyonuna karşılık gelir. Kırmızı çizgi, iki modelin ifade düzeyinin eşdeğer olduğu bir değere karşılık gelir. Temsili görüntü, beta aktin ekspresyonu ile normalleştirilen büyük molekül reseptörlerindeki sıkı bağlantı proteinlerinin, taşıyıcıların protein seviyesini göstermektedir.
Floresan etiketli NIPAM esaslı nötr polimerik nano jellerin taşınması değerlendirildi. Sıfır zamanında, polimerik nano jeller luminal bölmeye mililitre başına 0.1 miligram konsantrasyonda yerleştirildi. 24 saatlik inkübasyondan sonra, polimerik nano jellerin% 5.82'si abluminal bölmede bulundu ve BLEC'leri geçme yeteneklerini kanıtladı.
Geri döndürülen filtre üzerindeki perisitlerin doğru kaplanması ve tohumlanması çok önemlidir. Önemli olan, hücre kültürü sisteminin kirlenmesini önlemek için yapıların sterilitesinin ve bütünlüğünün korunmasıdır.
