Jeannie T. Lee'ye lee laboratuvarındayken bu projenin denetimi için teşekkür ederim ve Tyler Broering de taslağı düzenlediği için. Bu çalışma, Dimes Vakfı'nın Yürüyüşü'nden Basil O'Connor Starter Scholar Ödülü ve NIH Grant GM098605 tarafından desteklendi.

1.3D Slayt Hazırlama
<ol><li>Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın:<ol>
<li>CSK tamponu: 100 mM NaCl, 300 mM sakkaroz, 10 mM PIPES, 3 mM MgCl2. 1 M NaOH ile pH'ı 6,8'e ayarlayın. CSK tamponu 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>%0,5 Triton X-100 ile CSK tamponu: 200 μl Triton X-100 ila 40 ml CSK tampon ekleyin. Triton X-100 tamamen çözünene kadar çözeltiyi manyetik karıştırıcı kullanarak karıştırın. CSK tamponu %0,5 Triton X-100 ile 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>%4 Paraformaldehit (PFA)–PBS, pH 7.4: 4 g PFA'yı yaklaşık 70-80 ml suda çözün. Çözünme işlemini hızlandırmak için yaklaşık 20 μl 4 N NaOH ekleyin ve çözeltiyi PFA tamamen çözünene ve çözelti şeffaf olana kadar 60 °C'de bir su banyosunda tutun. Bu işlem yaklaşık 1 saat sürer. PFA tamamen çözüldükten sonra, 10 ml 10x PBS ekleyin. Son ses seviyesini su ile 100 ml'ye ayarlayın ve çözeltiyi oda sıcaklığına (25 °C) soğutun. Her yeni deney için yeni hazırlanmış bir çözüm kullanın. Not: Tüm hayvan işleri için kurumsal izin alın ve ilgili hayvan bakım yönergelerine uyun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erkek farelere ötenazi. Tokslar ve makas kullanarak testisleri fareden açın. Testisleri PBS'ye (veya RPMI 1640)'a yerleştirin. Testislerin çıkarılmasından sonra, RNA'nın bozulmasını önlemek için aşağıdaki 1.3-1.4 adımlarını hızla uygulayın.</li>
	<li>Testisleri küçük bir Petri kabında yırtın ve tunica albuginea 'yıçıkarın. PBS'deki seminifer tübülleri, todükler kullanarak buz üzerinde çözün.</li>
	<li>Forseps kullanarak, birkaç tübül (yaklaşık 5-10 mm uzunluğunda birkaç tübül parçası) 500 ml CSK tampon + % 0,5 Triton X-100 içeren 4 kuyulu bir kabın bir kuyusuna aktarın ve 6 dakika kuluçkaya yatırın. CSK arabelleğine aşırı maruz kalmak hücrelerin bozulmasına neden olabilir.</li>
	<li>Forseps kullanarak, tüm tübülleri% 4 PFA-PBS çözeltisi içeren 4 kuyulu bir kabın bir kuyusuna aktarın. Bu adım stereomikroskop olmadan önceden biçimlendirilebilir, ancak isteğe bağlı olarak kullanılabilir. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatır. Aynı zamanda kuluçka dönemlerinde 12 sitospin odası hazırlamaya başlayın.</li>
	<li>Tokmakları kullanarak, tüm tübülleri PBS içeren 4 kuyulu bir kabın bir kuyusuna aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Cam bir slaydın arka tarafında, tüm tübülleri 30 μl PBS'ye aktarın (katyonik yük nedeniyle slaydın üst kısmı önlenmelidir). İki yaban arısının uçlarını kullanarak tübülleri parçalara ayırın. Tübülleri iki yaban arısının uçları arasında kırparak ve tokmakları yatay olarak çekerek yatay yönde doğrayın. Bu adıma yaklaşık 10-20 saniye devam edin.</li>
	<li>Süspansiyonu P20 pipet kullanarak pipetle karıştırın.</li>
	<li>Süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, PBS ile yaklaşık 1,3 ml'ye seyreltin. 12 sitospin odasının her birine (toplam 1,2 ml) 100 μl süspansiyon uygulayın. Bu adımda, hücrelerin konsantrasyonunun belirlenmesi gerekmez.</li>
	<li>Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.000 rpm'de cytospin. Sitospinnlemeden sonra, laboratuvar tezgahında oda sıcaklığında birkaç dakika boyunca kuru kaydıraklar. Slaytların birkaç dakika boyunca tamamen kurumasına izin verildikten sonra, bir sonraki adıma geçin.</li>
	<li>PBS içeren bir Coplin kavanozu kullanarak, slaytları oda sıcaklığında 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Slaytları% 70 etanol içeren bir Coplin kavanozuna aktarın ve RNA FISH'in başlatılmasından önce en az 2 dakika bekleyin. Slaytlar 4 °C'de% 70 etanolde birkaç hafta stabildir. Uzun süreli depolama için, Coplin kavanozlarında her biri 2 dakika boyunca% 80 ve% 100 etanol ile seri işlem kullanarak susuz slaytları susuz bırakın ve hava kurusu slaytları tamamen susuz bırakın. -80 °C'de bir slayt kutusunda saklayın.</li>
</ol>2. Rastgele Astarlama ile Cot-1 DNA Prob Hazırlama
<ol><li>Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın:<ol>
<li>Hibridizasyon tamponu: 900 ml hibridizasyon tampon stoğu hazırlamak için işlem bileşenlerini karıştırın; bu çözüm probları stoklamak için kullanılacaktır. Bu hibridizasyon tampon stoğu, hibridizasyondan önce% 10 hacimli RNase inhibitör çözeltisinin (Ribonucleoside Vanadyl Kompleksi) eklenmesini sağlar.<table><tbody>
<tr>
<td>parça</td>
					<td>Miktar (μl)</td>
					<td>Son konsantrasyon</td>
				</tr>
<tr>
<td>Formamid</td>
					<td>500</td>
					<td>%50 (v/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>%50 Dektran</td>
					<td>200</td>
					<td>%10 (w/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>20x SSC</td>
					<td>100</td>
					<td>2x</td>
				</tr>
<tr>
<td>%1 BSA</td>
					<td>100</td>
					<td>0.1%</td>
				</tr>
</tbody></table>Hibridizasyondan önce, son konsantrasyona uyacak şekilde hibridizasyon tampon stoğuna 200 mM Ribonucleoside Vanadyl Kompleksi'nin 1/10 vol'unu veya suyu ekleyin. -20 °C'de, bu karışım bir yıldan fazla bir süre stabildir.</li>
		<li>20x SSC: Yaklaşık 800 ml suda 88,2 g sodyum sitrat ve 175,3 g NaCl çözün. Birkaç damla 1 M HCl kullanarak pH'ı 7,0'a ayarlayın. Hazırlık sonrası oda sıcaklığında 20x SSC saklanabilir.</li>
		<li>% 50 (w/v) Dektran: Suyu karıştırın ve yavaşça 50 g dektran sülfat ekleyin. Oda sıcaklığında gece boyunca karıştırmaya devam edin. Son ses seviyesini 100 ml'ye ayarlamak için su ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşağıda listelenen aşağıdaki bileşenleri bir PCR tüpüne ekleyin. Bir PCR makinesi kullanarak, çözeltiyi 95 °C'de 5 dakika karıştırın ve kuluçkaya yatırın.<table><tbody>
<tr>
<td>parça</td>
				<td align="center">Reaksiyon başına miktar (μl)</td>
				<td align="center">son</td>
			</tr>
<tr>
<td>Karyola-1 DNA:1 mg/ml</td>
				<td align="center">1</td>
				<td align="center">1 μg</td>
			</tr>
<tr>
<td>Rastgele 9mer astar (kitten)</td>
				<td align="center">10</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>Su</td>
				<td align="center">27</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Santrifüj kısa bir süre ve buza yerleştirin.</li>
	<li>Aşağıdaki bileşenleri ekleyin. Pcr makinesi kullanarak 37 °C'de 30 dakika karıştırın ve kuluçkaya yatırın. (Kullanılan kitin ayrıntıları için reaktifler ve ekipman tablosuna bakın).<table><tbody>
<tr>
<td>parça</td>
				<td align="center">Reaksiyon başına miktar (μl)</td>
				<td align="center">Son konsantrasyon</td>
			</tr>
<tr>
<td>Adım 2.2'den hazırlanan karışım</td>
				<td align="center">38</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>5x nükleotid tampon (kitten)</td>
				<td align="center">9.2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>Cy3-dUTP (1 mM)</td>
				<td align="center">0.8</td>
				<td align="center">16 μM</td>
			</tr>
<tr>
<td>Klenow (kitten)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>Reaksiyonu durdurmak için 2 μl durdurma tamponu (kitten) ekleyin.</li>
	<li>Mikrospin sütunlarını kullanarak durdurulan reaksiyonun saflaştırılması.</li>
	<li>Saflaştırılmış fraksiyona 50 μg (5 μl) fırlayan sperm DNA'sı (50 kat şablon Cot-1 DNA fazlalığı) ekleyin.</li>
	<li>Pipet kullanarak toplam hacmi ölçün. 4 °C'de bir mikrosantrifüj kullanarak maksimum hızda (17.000 x g) 0,7x hacim % 100 etanol ve 0,1x hacim 3 M sodyum asetat (pH 5,2) ekleyin, iyice karıştırın ve santrifüj ekleyin.</li>
	<li>Sıvıyı çıkarın ve % 70 etanol 200 μl ekleyin, iyice karıştırın ve 4 ° C'de maksimum hızda 5 dakika santrifüj.</li>
	<li>Fazla sıvıyı çıkarın. Çökelticiyi oda sıcaklığında 10-30 dakika kurutun.</li>
	<li>Peletin 20 μl hibridizasyon tampon stoğunda çözün. Peletin çözülmesi genellikle zor olduğundan, pipet tekrar tekrar. Alternatif bir seçenek olarak, peleti verimli bir şekilde çözmek için bir girdap karıştırıcısı da kullanılabilir. Problar kullanıma kadar -20 °C'de tutulabilir.</li>
</ol>3. Karyola-1 RNA BALIK
<ol><li>Aşağıda listelenen bileşenleri bir PCR tüpüne ekleyin. Bir PCR makinesi kullanarak, 80 ° C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın, ardından 42 ° C'de yaklaşık 10-30 dakikalık bir preannealing adımı. Melezleme işlemine kadar 42 °C'de tutun. Ribonucleoside Vanadyl Kompleksi isteğe bağlıdır; su ile değiştirilebilir.<table><tbody>
<tr>
<td>parça</td>
				<td align="center">Reaksiyon başına miktar (μl)</td>
				<td align="center">son</td>
			</tr>
<tr>
<td>Karyola-1 DNA probu (50 ng/μl)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">100 ng</td>
			</tr>
<tr>
<td>Ribonucleoside Vanadyl Kompleksi (200 mM)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">20 mM</td>
			</tr>
<tr>
<td>Karmalaştırma arabelleği</td>
				<td align="center">20'ye eklendi</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>2 dakika boyunca% 80 etanol içeren bir Coplin kavanozunda dehidrat kayar, ardından 2 dakika boyunca% 100 etanol içeren bir Coplin kavanozu. Oda sıcaklığında tamamen laboratuvar tezgahında kuru kaydıraklar.</li>
	<li>Bir uç kutu haznesi (2-3 cm su ile doldurulmuş) önceden 42 °C inkübatörde ısıtın. Slaydı uç kutusu haznesine yerleştirin. Önceden tasarlanmış probları ve pipeti doğrudan susuz slaytlara kısaca santrifüjleyin. Kabarcık yapmaktan kaçının. Slaydı bir kapak kayması ile hafifçe örtün.</li>
	<li>42 °C'de 6 saat ila bir gecede (14-15 saat) melezlen.</li>
	<li>Coplin kavanozlarında yıkama çözeltileri hazırlayın (hem 2x SSC hem de% 50 formamid içeren iki kavanoz ve 2x SSC'li iki kavanoz). 42 °C'de bir su banyosunda 30 dakika önceden ısıtın.</li>
	<li>Kapak fişini slaydın kenarından çıkarmak için jilet kullanın. Örnekleri çizmekten kaçının. Slaytları 2x SSC ve% 50 formamid içeren bir Coplin kavanozunda 45 ° C'de 5 dakika boyunca yıkayın. Bu adımı bir kez yineleyin.</li>
	<li>Slaytları 2x SSC içeren bir Coplin kavanozunda 45 °C'de 5 dakika boyunca yıkayın. Bu adımı bir kez yineleyin.</li>
	<li>Slaytlara 20 μl DAPI montaj ortamı ekleyin ve kapak kayması ile örtün. Ekstra montaj medyasını çıkarmak için kapak camına hafifçe basın. Temizleme dokusu ile ekstra montaj ortamı leke. Slaytlar mikroskopi değerlendirmesi için hazır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice.">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li><li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nascent+RNA,+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos.">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li><li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis.">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li><li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells.">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li><li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos.">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li><li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line.">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li><li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+imprinted+X+inactivation:+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse.">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li><li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells.">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li><li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids.">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li></ol>

Yazarın açıklayacak bir şeyi yok.

3D slayt hazırlamada, permeabilizasyon adımı sabitleme adımından önce gelir. Bu adımlar doğrudan seminifer tübüller üzerinde gerçekleştirilir, böylece üç boyutlu kromatin yapısı korunur. RNA/DNA FISH için kromatin yapısını korumak için alternatif bir seçenek, permeabilizasyon adımını ve fiksasyon adımını aynı anda gerçekleştirmektir. Bu alternatif teknik keseli mikrop hücrelerinde ve fare preimplantasyon embriyolarında7,8. Ancak, sabitleme adımı permeabilizasyon adımından...

Testislerde, mikrop hücreleri diploid spermatogonia'dan meiosis yoluyla olgun, haploid spermatozoaya farklılaşır. Bu işlem sırasında mikrop hücrelerinin nükleer kromatin yapısı sürekli ve dinamik olarak yeniden şekillendirilir. Yüzey yayılımları genellikle bireysel spermatojenik hücrelerin sitolojik incelemesi için kullanılır. Yaygın bir yüzey yayılım yöntemi, bireysel spermatojenik hücrelerin yayıldığı ve düzleştirildiği hipotonik tedaviyi kullanmaktadır1. Bu koşullar meiotik kromozomların ayrıntılı analizi için en uygun olanıdır. Sinaptik durum ve rekombinasyon odakları gibi kromozomal özellikler bu yöntem kullanılarak kolayca gözlenir. Bununla birlikte, hipotonik tedavi subnükleer kromatin mimarisini bozar, bu nedenle bu teknik çekirdeklerin yapısal analizi için uygun değildir. Sonuç olarak, testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin yapısını korumak için geliştirilmiş bir yöntem tasarlanmıştır. Bu yöntem üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak adlanmıştır (Şekil 1). 3D slayt yöntemi, başlangıçta RNA floresan in situ hibridizasyonu (FISH)2,3ile testis germ hücre farklılaşması sırasında gen ekspresyasyonu ve kromatin durumlarını incelemek için optimize edildiği için çekirdeklerde nascent RNA lokalizasyonunun tespit edilmesini sağlamıştır. Bu 3D yöntem immünofluoresans, DNA ve RNA FISH kombinasyonu için de geçerlidir. Ek olarak, bu yöntem postmeiotik spermatidlerde bulunan cinsiyet kromozomlarının sessiz bir bölmesi olan postmeiotik cinsiyet kromatinin (PMSC) keşfine yardımcı olmuştur2.
3D slayt yöntemi başlangıçta nükleer boyama için yaygın olarak kullanılan iki temel slayt hazırlama adımının kombinasyonu ile optimize edilmiştir: nükleer malzemeleri düzeltmek için tasarlanmış sabitleme adımı ve antikorlar ve FISH probları gibi boyama reaktiflerinin erişilebilirliğini artırmak için sitoplazmik malzemelerin çıkarılması amaçlanan permeabilizasyon adımı. Daha önce başka bir yayında açıklandığı gibi3, düşük sitoplazmik arka plan ile en uygun sonuçları elde etmek için permeabilizasyon adımının sabitleme adımından önce gelmesi gerektiği belirlenmiştir. Bu 3D slayt yönteminde, permeabilizasyon adımı ve sonraki sabitleme adımı doğrudan seminifer tübüller üzerinde gerçekleştirilir ve slaytlara sitospinningden önce mikrop hücrelerinin tokalarla mekanik ayrışması ile takip edilir. Spermatojenik hücrelerin RNA BALIK için alternatif bir yöntem başka bir laboratuvarda geliştirilmiştir4. Bu yöntemde, 3D yöntemiyle tutarlı olarak, RNA FISH'in en iyi sonuçlarını elde etmek için permeabilizasyon adımının sabitleme adımından önce gelmesi gerekir.
Aşağıdaki protokol 3D slayt yöntemini açıklar ve nükleer nascent RNA'ların tespiti için olası bir uygulama olan Cot-1 RNA FISH'e bir örnek sağlar. Karyola-1 DNA'sı genomdaki tekrarlayan elementlerden oluşur. Burada, bir Cot-1 DNA probu, nascent transkriptlerinin bir intron ve UTR'sine melezlenmiştir, böylece çekirdek5,6'dakitranskripsiyonal olarak aktif bölgeleri tespit eder. Kromatin mimarisi arasındaki mekansal ilişkilerin detaylı incelenmesini sağlamak için 3D slaytlar çok yönlüdür ve immünofluoresans, DNA ve RNA FISH tekniklerinin bir kombinasyonuna uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Cot-1 DNA&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr><tr><td>Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit</td><td>Agilent</td><td>300380</td><td></td></tr><tr><td>Herring sperm DNA Solution</td><td>Invitrogen</td><td>15634-017</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol. 200 proof (absolute)</td><td>Pharmco-aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Formamide deionized</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Lifeblood Medical</td><td>77110-100</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6001</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>A10491-01</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76240</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1200</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleoside-vanadyl complex</td><td>New England Biolabs</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin G-50 Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>VWR</td><td>300-050</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 3</td><td>Shandon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost /Plus Microscope Slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>4-well dish</td><td>Fisher</td><td>12-566-301</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Air incubator</td><td>Revolutionary Science</td><td>RS-IF-203</td><td></td></tr></tbody></table>

slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells

Testis germ hücre farklılaşması sırasında nükleer kromatin yapısı dinamik olarak değişir. Aşağıda, farelerde bulunan testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin düzenini korumak için tasarlanmış bir yöntem açıklanmaktadır; bu yöntem üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak ad verilmiştir. Bu yöntemde, testis tübülleri doğrudan sitoplazmik malzemeyi uzaklaştıran bir permeabilizasyon adımı ve ardından nükleer malzemeleri düzelten bir fiksasyon adımı ile muamele edilir. Tübüller daha sonra ayrışır, hücre süspansiyonu sitospundur ve hücreler slaytlara yapışır. Bu yöntem subnükleer yapıların saptanmasında hassasiyeti artırır ve immünoresans, DNA ve RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve bu tespit yöntemlerinin kombinasyonu için geçerlidir. 3D slayt yönteminin olası bir uygulamasına örnek olarak, nascent RNA'ları algılamak için bir Cot-1 RNA FISH gösterilir. 3D slayt yöntemi, testis germ hücre farklılaşması sırasında kromatin yapısı, DNA ve RNA arasındaki mekansal ilişkilerin ayrıntılı olarak incelenmesini kolaylaştıracaktır.

3D slaydın temsili bir sonucu Şekil 2'de gösterilir. Bu deneyde Cot-1 RNA FISH, anti CBX1 ve φH2AX antikorları kullanılarak immünostaining ile birlikte nascent transkripsiyonunu tespit etmek için gerçekleştirildi. RNA FISH ve immünostaining'i birleştirmek için önce immünostaining yapıldı, ardından3'teaçıklandığı gibi RNA FISH . CBX1, XY vücudu (veya seks vücudu) adı verilen meiosisteki perisantronerik heterokromatin ve sessiz cinsiyet kromozomlarına lokalize olan bir...

Watch this Scientific Journal Video about Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells at JoVE.com

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Buradaki materyal testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin yapısını korumak için geliştirilen bir yöntemi açıklamaktadır. Bu, üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak ad verilmiştir. Bu yöntem subnükleer yapıların tespiti için hassasiyeti artırır ve immünoresans, DNA ve RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) için geçerlidir.

Testis Germ Hücrelerinin Üç Boyutlu Kromatin Mimarisini Korumak için Slayt Hazırlama Yöntemi

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

slide-preparation-method-to-preserve-three-dimensional-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Görüntüleme.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Buradaki materyal testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin yapısını korumak için geliştirilen bir yöntemi açıklamaktadır. Bu, üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak ad verilmiştir. Bu yöntem subnükleer yapıların tespiti için hassasiyeti artırır ve immünoresans, DNA ve RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) için geçerlidir.

Video: Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Kromatin fare oosit ilerleme profaz metafaz II analizi için hazırlıklar yaymak

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Genetik

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Zebrabalığı Spermatositlerinden Meiotik Kromozom Spreadlerinin Hazırlanması

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

Standart Laboratuvar Ekipmanları Kullanılarak Fare Testlerinden Pachytene Spermatosit ve Spermatidlerin Zenginleşmesi

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Gelişim Biyolojisi

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Antikor Etiketleme Drosophila politen Kromozom kabak hazırlanması

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Biyoloji

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

Fly Testislerin görüntüleme centrosomes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Floresan DNA için Basit Bir Yöntem<em&gt; In Situ</em&gt; Ezilmiş Kromozomlar için Hibridizasyon

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on the surface of slides (rather than dropping them from a height), we demonstrate an optimized technique on mouse spermatocytes that was first described in 1997. This method is widely used in laboratories to study mammalian meiosis because it yields a plethora of high quality nuclei undergoing substages of prophase I. Seminiferous tubules are first placed in a hypotonic solution to swell spermatocytes. Then spermatocytes are released into a sucrose solution to create a cell suspension, and nuclei are spread onto fixative-soaked glass slides. Following immunostaining, a diversity of proteins germane to meiotic processes can be examined. For example, proteins of the synaptonemal complex, a tripartite structure that connects the chromosome axes/cores of homologs together can be easily visualized. Meiotic recombination proteins, which are involved in repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination, can also be immunostained to evaluate progression of prophase I. Here we describe and demonstrate in detail a technique widely used to study mammalian meiosis in spermatocytes from juvenile or adult male mice.

Meiosis is the developmental process by which gametes are formed through a single round of DNA replication and two successive rounds of chromosome segregation. Mammalian meiosis can be examined by utilizing a technique to prepare meiotic chromosome spreads. Here, we demonstrate a method of preparing surface-spread nuclei from mouse spermatocytes.

Fare Spermatocytes segregasyonun kromozom hazırlanması yayılır

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

Testis Germ Hücrelerinin Üç Boyutlu Kromatin Mimarisini Korumak için Slayt Hazırlama Yöntemi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler