Bu protokol, mekanizma odaklı bir yaklaşımla potansiyel antiviral küçük moleküllerin keşfine yardımcı olabilir. Ek çalışma süresi, enfeksiyonun hangi adımında küçük molekülün antiviral aktivitesini sergilediğini belirler. Moleküler yerleştirme küçük molekül ve viral proteinler arasındaki etkileşimi tahmin eder.
Viral enfeksiyon öncesinde ev sahibi hücreler üzerinde ilaçların etkisini değerlendirmek için, iyi kaplama yoğunluğu başına beş kez 10 iki kez 10 tohum RD hücreleri. Hücreleri bir gecede %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi sabah, rd monolayer her iyi ilgi bir test bileşik ile tedavi, triplicate, bazal orta bir mililitre toksik olmayan konsantrasyonlarda bir veya dört saat.
Tedavi kuluçka sonunda, bir saat boyunca iyi bazal orta 300 mikrolitre 50 plak oluşturan birim virüs eklemeden önce PBS bir mililitre ile hücreleri yıkayın, her 15 dakikada sallanan. Enfeksiyon kuluçka sonunda, PBS ile hücreleri yıkayın ve taze bazal orta bir mililitre ile hücreleri bindirme 0.8% metilselüloz içeren. Hücre kültürü kuluçka 72 saat sonra, PBS iki mililitre ile her iyi yıkayın ve 15 dakika boyunca iyi başına% 37 formaldehit 0.5 mililitre ile hücreleri düzeltmek.
Fiksasyon sonunda, pbs ile kuyuyıkama ve iyi başına% 0,5 kristal mor çözelti0.5 mililitre ile hücreleri leke. İki dakika sonra, kuyuları hafif bir su akışıyla yıkayın ve plakanın kurumasını bekleyin. Sonra sayma için beyaz bir ışık kutusu üzerine plaka yerleştirin ve formüle göre coxsackievirus enfekte hücrelerin yüzdesini hesaplamak.
Moleküler yerleştirme analizi için, PubChem'den test bileşiklerinin 3Boyutlu moleküllerini indirin. Bir molekülün yüklenen bir 3B yapısı yoksa, 2B yapısını indirin veya uygun bir moleküler program aracılığıyla yapıyı bir 3B moleküle dönüştürmek için SMILE dize dizisini kullanın. Sonra, RCSB Protein Veri Bankası'ndan viral biyolojik montaj ünitesi indirin.
Uygun bir biyo-bilgi işlem programı kullanarak, Protein Veri Bankası dosyasından çözücüleri silin, Dunbrack 2010 rotamer kitaplığından alınan verileri kullanarak eksik yan zincirleri değiştirin ve daha önce bildirildiği gibi yapıya hidrojen ve patlayıcı ekleyin. Test bileşiklerini hazırlanan virüs ünitesine yerleştirmek için, test bileşik dosyasını Ligand olarak California Üniversitesi San Francisco Chimera'ya yükleyin ve kör yerleştirme yapmak için reseptör olarak hazırlanan viral proteinin tamamını seçin. Ek yerleştirme için, yerleştirme alanını, arama hacmini daha da azaltarak kör yerleştirme sonuçlarından elde edilen ilgi bölgelerine viral proteinle sınırlandırın.
Ardından bağlama modu konumlarını analiz etmek için yerleştirme dosyasını uygun bir moleküler grafik sistemine yükleyin. Herhangi bir atom seçeneği ile polar temasları tanımlayan, viral protein bileşik polar temas bulmak için ligand seçin. Bu temsili deneyde test edilen küçük moleküllerin her ikisi de, viral enfeksiyon dan önce konak hücrelerin ön tedavisinde veya enfeksiyon sonrası tedavide olsun, sadece coxsackievirus A16 enfektivitesine karşı marjinal bir etki yaratmaktadır.
Buna karşılık, moleküller etkili bir co-ek tedavi de% 80'den fazla enfeksiyon ortadan, iki bileşikler infeksiyon sırasında konak hücre yüzeyinde virüs parçacıkları ile aynı anda mevcut olduğunda en etkili olduğunu düşündürmektedir. Akış sitometri sitometri sitometrisi bazlı bağlama analizi, iki tanenin konak hücrelere viral parçacık bağlanmasını engelleyerek coxsackievirus A16 enfekte girişini engellediğini doğrulamaktadır. Tanenlerin moleküler kenetlenme her ikisi de coxsackievirus pentamer kanyon bölgesinde bağlamak için tahmin olduğunu gösterir, cep faktörü tutan cep girişinin hemen üzerinde ve coxsackievirus bağlama ve konak hücreye giriş aracılık için önemli bir rol oynar.
Bu yüzey projeksiyonlarında, cep girişinin etrafındaki küçük moleküllerin kutupsal temaslarından öngörülen benzersiz kalıntılar asparagin-85, lizin-257 ve asparagin-417 ile iki tanen arasında ortak olarak görülebilir. Moleküler yerleştirme için, bağlayıcı kareler sıralamasında viral proteinin topolojisinin dikkate alınması gerekir. Ek deneyler rekombinant virüsler üzerinde bileşiğin antiviral aktivitesitest içerebilir, amino asitler üzerindeki mutasyonlar ilacın etkinliği için önemini doğrulamak için keşfedilen.
