Auteurs tiennent à remercier les membres passés et présents dans les laboratoires des Drs. Peter Palese et Adolfo Garcia-Sastre pour le développement de la génétique inverse NDV techniques et d&#39;assistance technique. Recherche dans le virus de la maladie de Newcastle dans le laboratoire AG-S est partiellement financé par NIAD accorder R01AI088770 et par le Département du Centre de la sécurité intérieure des sciences et de la technologie d&#39;excellence pour les maladies émergentes et zoonotique (CEEZAD, nombre de prix 2010-ST-061-AG001). Recherche dans le laboratoire LM-S est financé par les subventions des NIH RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, les Centres d&#39;excellence pour le NIAID recherche sur l&#39;influenza et de la surveillance (HHSN266200700008C), et l&#39;Université de Rochester Centre pour la biodéfense immunitaire Modeling (HHSN272201000055C) .

Une. Préparation des cellules de mammifères (figure 4A, Jour 1) Scission HEp-2 ou des cellules A549 le jour avant la transfection dans des plaques à 6 puits. Densité de cellules doit atteindre 80 à 90% de confluence le jour suivant. Habituellement, un confluent boîte de 100 mm peut être divisé en 8 puits (environ 1 x 10 6 cellules par puits). Pour chaque virus pour être sauvé, 2-4 puits différents devraient être inclus, ainsi que deux puits supplémentaires pour les contrôles pCAGGS-GFP et pCITE-GFP 18, visant à surveiller la transfection et MVA-T7 efficacité d&#39;infection, respectivement. 2. L&#39;infection des cellules de mammifères avec recombinant modifié le virus de la vaccine Ankara Exprimant le bactériophage T7 RNA Polymerase (MVA-T7) (figure 4A, Jour 2) <ol><li> Warm up PBS 1x/BA/PS et médias à 37 ° C. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 1 ml de PBS 1x/BA/PS. </li><li> Infecter les cellules de mammifères en culture avec le virus MVA-T7 à une multiplicité d&#39;infection (moi) De 1 pfu / cellule dans un volume final de 200 ul dans du PBS / BA / PS pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Au cours de l&#39;infection virale incubation, préparer le mélange de transfection comme décrit dans 3. </li></ol> 3. La transfection de cellules de mammifères (figure 4A, Jour 2) <ol><li> Préparation de Lipofectamine: Mélanger 1-2 pg de LPF2000 avec 250 pi de OptiMEM par tentative de sauvetage et incuber pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Préparation de l&#39;ADN: Faire un cocktail de plasmide pour chaque sauvetage dans 50 pi de OptiMEM. Ajouter 0,4 pg de PTM1-NP, 0,2 pg de PTM1-P, et 0,2 pg de PTM1-L par tube. Ajouter 1 ug de l&#39;ADNc de pleine longueur clone de NDV être secouru à chaque tube. Préparer aussi deux transfections de contrôle, une avec 2 pg de pCAGGS-GFP (pour vérifier l&#39;efficacité de la transfection) et l&#39;autre avec 2 pg de pCITE-GFP (pour vérifier T7 polymerase entraîné expression par le MVA-T7). </li><li> Après que la solution LPF2000-OptiMEM a été pré-incubé pendant 5 min (étape 3.1), ajouter 250ul de la solution dans les tubes d&#39;ADN (étape 3.2) et incuber pendant 20 à 30 min à température ambiante. </li><li> Après incubation avec MVA-T7, enlever l&#39;inoculum de virus par aspiration et le remplacer par le mélange de transfection d&#39;ADN de LPF2000 (étape 3.3). </li><li> Ajouter 1 ml de DMEM 10% FBS / PS pour chaque plat. </li><li> Incuber les cellules infectées / transfectées pour 6-8 heures (ou toute la nuit) à 37 ° C, 5% de CO 2, puis remplacer le milieu de transfection avec 1,5 ml de DMEM frais 10% de FBS / PS. </li><li> À 24 heures post-transfection, les puits de contrôle peut être observée sous un microscope à fluorescence afin d&#39;évaluer l&#39;efficacité de transfection (pCAGGS-GFP) et l&#39;activité de la polymerase T7 (pCITE-GFP) (Figure 5A). Procéder à la co-culture de cellules infectées / transfectées avec des fibroblastes aviaires tels que décrits ci-dessous. </li></ol> 4. Co-culture de cellules de mammifère avec des cellules aviaires (Figure 4A, Jour 3) Habituellement, une boîte de 100 mm confluent des tissus de culture de poulet (CEF) or canard (defs) fibroblastes d&#39;embryon est utilisé par deux puits transfectées. Veillez à préparer, à l&#39;avance, assez 100 mm boîtes de culture de tissus de cellules aviaires par toutes les tentatives de sauvetage. Pour le sauvetage efficace du virus, de DMEM 10% FBS / PS milieu est enrichi avec 5% de liquide allantoïdien et 30 mM de MgCl2. À ce stade, 24 h pi, des cellules de mammifères peuvent commencer à montrer un effet cytopathique (CPE) due à une infection MVA-T7, asevident sur ​​la figure 5A. <ol><li> Warm up 1x PBS et médias à 37 ° C. </li><li> Laver les cellules de mammifères, 2x, avec 1 ml de PBS 1x. </li><li> Trypsiniser les cellules de mammifères avec 0,2 ml de trypsine-EDTA jusqu&#39;à ce qu&#39;elles se détachent. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de DMEM 10% FBS / PS, 5% de liquide allantoïdien, 30 mM de MgCl2 et le transfert à une boîte de culture tissulaire de 100 mm. Ajouter 3 ml de même support. </li><li> Laver les cellules aviaires, deux fois, avec 4 ml de PBS 1x. </li><li> Trypsiniser cellules aviaires avec 1 ml de trypsine-EDTA et incuber pendant 1-2 min à 37 ° C jusqu&#39;à ce que les cellules se détachent. E Remettre en suspensioncellules de e en ajoutant 8 ml de DMEM 10% FBS / PS, 5% de liquide allantoïdien, 30 mM de MgCl2 et ajouter 4 ml des cellules trypsinisées pour les cellules de mammifères dans le boîte de 100 mm pour culture de tissu de co-culture pendant un volume total de 8 ml (4 ml de mammifères, des cellules aviaires 4 ml). </li><li> Secouer doucement la main les cellules co-cultivées dans la boîte de 100 mm afin d&#39;avoir une distribution uniforme et puis les placer dans l&#39;incubateur à 37 ° C pendant 3-4 jours. Les critères pour infecter les œufs 3 ou 4 jours après co-culture de cellules de mammifères et aviaires dépend de la quantité d&#39;effet cytopathique (arrondissement des cellules, la mort, le détachement de la surface, etc.) Est observé dans l&#39;infection virale MVA-T7. </li></ol> 5. Infection de poulet embryonnés (figure 4A, Jours 6-7) <ol><li> Après 3-4 jours de co-culture de cellules de mammifères et aviaires, retirer 1 ml de surnageant de culture tissulaire et l&#39;ajouter à un tube Eppendorf. </li><li> Centrifuger le surnageant de culture tissulaire pendant 1 min à 12 000 rpm dans un banccentrifugeuse pour éliminer les débris cellulaires. </li><li> Bougie les oeufs à l&#39;aide d&#39;une boîte de mirage de lumière pour voir l&#39;interface entre le sac de l&#39;air et la cavité allantoïde. Faire une marque sur la frontière de l&#39;interface éviter vaisseau sanguin localisation. Vaporiser éthanol à 70% sur les oeufs d&#39;établir des conditions stériles. Faire doucement un trou dans la coquille d&#39;oeuf sur la place nette et inoculer 500 pi du surnageant à l&#39;aide d&#39;une insuline (1 ml) seringue, visant l&#39;aiguille verticalement et directement dans la cavité allantoïde. (Figure 4B). </li><li> Sceller le pseudo dans la coquille d&#39;oeuf avec de la cire ou de la paraffine fondue. </li><li> Incuber les oeufs pendant 2-3 jours à 37 ° C. </li></ol> 6. Récolte de liquide allantoïdien infecté de poulet embryonnés (figure 4A, Jours 8-10) <ol><li> Incuber les œufs infectés de 4.2 h ou pendant une nuit à 4 ° C afin de tuer l&#39;embryon de poulet et de coaguler le sang. </li><li> Pulvériser les œufs avec 70% d&#39;éthanol (pour maintenir des conditions stériles). </li><li> Enfoncer délicatement la section apicale de l&#39;oeuf, sur la cavité d&#39;air, avec une cuillère. Une fois la coquille est fêlée, enlever les fragments avec une pince et entièrement exposer la membrane allantoïde. </li><li> Exposer la cavité allantoïque par excision de la membrane allantoïdien avec des pinces et des ciseaux, ce qui évite d&#39;endommager les vaisseaux sanguins et le jaune. </li><li> Pousser doucement sur l&#39;embryon avec une spatule et recueillir le liquide allantoïdien d&#39;écoulement vers le haut (8-12 ml par oeuf) avec une pipette de 10 ml. Éviter d&#39;endommager la membrane du jaune. Transférer le liquide allantoïdien à un tube de centrifugation de 15 ml sur glace (utiliser un tube par œuf). </li><li> Clarifier le liquide allantoïdien par centrifugation pendant 5 min à 1500 rpm. Transférer le surnageant dans un nouveau tube sans perturber le culot. </li><li> Conserver les échantillons à 4 ° C pendant 1 semaine, jusqu&#39;à ce que leur vérification de la présence de NDV par hémagglutination. </li></ol> 7. Hémagglutination (HA) Dosage La présence de virus dans la Allantfluide de l&#39;OCI à partir d&#39;œufs infectés peut être déterminée de façon macroscopique par leur capacité à hemagglutinate dinde de globules rouges (RBC). Dans le cas de NDV, environ 10 6 unités formant des plages (UFP) par ml sont nécessaires pour donner un signal positif dans le test HA. des dosages de HA sont réalisées dans des plaques à 96 puits à fond en V. Négatif (PBS 1x, liquide allantoïdien infecté) aussi bien que positifs (liquide allantoïdien de tout virus NDV) échantillons de contrôle doivent toujours être inclus dans n&#39;importe quel dosage HA pour le valider. Pour effectuer un test HA: <ol><li> Pipette 50 ul de PBS 1x par puits dans une plaque de 96 puits à fond en V. </li><li> Introduire à la pipette 50 ul des échantillons de fluide allantoïdien dans les puits de la première colonne de la plaque. Effectuer des dilutions en série de 2 fois le reste de la plaque et jetez la dernière, en sus de 50 pi à partir de puits dans la dernière colonne. </li><li> Distribuer 50 ul de 0,5% dinde RBC dans du PBS 1x par puits. Secouer doucement la plaque en tapotant. </li><li> Incuber la plaque à 4 ° C (ou glace) fou de 30 à 45 min ou jusqu&#39;à ce qu&#39;un culot clair est formé dans les puits témoins négatifs. </li></ol>

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Virol. 84, 781-788 (2003).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells.">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> J. Mol. Biol. 196, 947-950 (1987).</li><li>Calain, P., Roux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rule+of+six,+a+basic+feature+for+efficient+replication+of+Sendai+virus+defective+interfering+RNA.">The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA.</a> J. Virol. 67, 4822-4830 (1993).</li><li>Wyatt, L. S., Moss, B., Rozenblatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-deficient+vaccinia+virus+encoding+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+for+transient+gene+expression+in+mammalian+cells.">Replication-deficient vaccinia virus encoding bacteriophage T7 RNA polymerase for transient gene expression in mammalian cells.</a> Virology. 210, 202-205 (1995).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+review.+New+mammalian+expression+vectors.">Product review. New mammalian expression vectors.</a> Nature. 348, 91-92 (1990).</li><li>Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+of+mononegavirales.">Reverse genetics of mononegavirales.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).</li></ol>

Adolfo Garcia-Sastre est un inventeur de brevets sur les virus recombinants la maladie de Newcastle qui sont détenues par l&#39;École de médecine Icahn au Mont Sinaï.

Plusieurs facteurs sont à considérer pour obtenir de bons résultats tout en sauvant NDV. Tout d&#39;abord, la construction d&#39;ADNc de pleine longueur à utiliser doit être conçu pour permettre l&#39;incorporation fonctionnelle des nouvelles modifications / transgènes dans le génome du NDV. Cela signifie, comme indiqué ci-dessus, que (i) fin appropriée du gène (GE), intergénique (IG) et début de gène (GS) des séquences doivent être ajoutés si nécessaire, (ii) il n&#39;existe pas de séquences GE ou GS...

Virus de la maladie de Newcastle (NDV), un paramyxovirus aviaire appartenant au genre Avulavirus 1, est un agent zoonotique économiquement pertinent et donc largement étudiée et surveillée, qui peuvent gravement affecter l&#39;élevage de volailles dans le monde entier. Bien que n&#39;étant pas un agent pathogène humain, NDV a également été étudiée à fond au-delà du champ de vétérinaire à la fois comme un paramyxovirus de modèle et en raison de ses très intéressantes, les propriétés oncolytiques naturelles 6. Recherche sur le NDV a grandement bénéficié de l&#39;évolution des techniques de génétique inverse pour, non segmentés virus à ARN négatif simple brin de sens, d&#39;abord décrits pour le virus de la rage par Conzelmann et coleagues 2. Une variété de NDVs génétiquement modifiées, portant des gènes ou des modifications de leur génome de type sauvage étrangers ont été largement étudiées depuis. Travailler avec ces virus recombinants a été critique à caractériser les différents facteurs de virulence non seulement de NDV, mais aussi d&#39;autres HUMA pertinenten agents pathogènes tels que les virus influenza A 7 - ou l&#39;émergence virus Nipah 8. En outre, un certain nombre de différentes études ont exploré l&#39;utilisation de ces techniques pour améliorer l&#39;activité anti-tumorale innée de NDV 6,9,10, principalement en améliorant les propriétés immunostimulantes du virus. Autre domaine de recherche concerné sur NDVs recombinants a été la production de vaccins candidats contre d&#39;autres maladies virales telles que la grippe 5,11,12, 13 VIH, la rougeole 14, 15 SRAS, ou celle causée par le virus respiratoire sincytial (RSV) 16. Parmi les différents avantages remarquables fournis par NDV sont l&#39;absence d&#39;immunité préexistante dans les populations humaines, la stabilité des inserts étrangers génétiques, un manque d&#39;activité et recombinatoire ensemble un profil de sécurité élevé combiné avec les propriétés immunostimulantes naturels mentionnés ci-dessus 17. Il est également intéressant de noter l&#39;utilisation potentielle de vaccins bivalents recombinants dans poultry, de protection à la fois contre le NDV et influenza aviaire hautement pathogène virus 11,12. Cela peut être un excellent moyen de réduire les risques de propagation de la dernière sauvage des animaux domestiques, ce qui contribuerait à éviter un possible saut inter-spécifique de la grippe aviaire à l&#39;homme redoutable. Enfin, le journaliste exprimant NDV ont été utilisés pour l&#39;évaluation des réponses immunitaires innées ainsi que l&#39;identification de l&#39;interféron antagoniste codée par plusieurs virus 18-27. Le processus de délivrance d&#39;un recombinant, non segmenté, virus ARN à brin négatif se compose essentiellement de forcer artificiellement un cycle de réplication virale dans une cellule produisant par transfection de l&#39;ADNc codant pour la machinerie moléculaire infectieuse minimale, dite ribonucléoprotéine ou RNP (Figure 2). Les RNP consistent en la polymerase virale (P et les protéines L), la nucléoprotéine (NP) et la longueur totale de l&#39;ARN antigénomique du virus. Cet ARN antigénomique + e estmodèle de e requise pour la génération des ARN-génomes complémentaires, qui, également associés avec le reste des protéines de la RNP virale, reprend le même complexe infectieux d&#39;un virus naturel libérerait le cytoplasme de la cellule lors de l&#39;infection (Figure 2A ). De cette étape en avant, le cycle viral peut procéder naturellement et virions recombinants, encapsidation des génomes modifiés, sera généré (figure 2B). Remarquablement, la transfection de l&#39;ADNc génomique à la place de l&#39;ADNc antigénomique nuit considérablement ou supprime sauvetage efficacité 2,28-30 complètement. Même lorsque l&#39;ADNc antigénomique est transfecté, l&#39;efficacité de l&#39;encapsidation de l&#39;ARN recombinant dans des RNP dans les cellules transfectées est probablement très faible. Pour cette raison, les protocoles de sauvetage pour NDV comprennent souvent des différentes étapes de l&#39;amplification de ces particules virales libérées par les cellules transfectées à l&#39;origine par leur co-culture avec des cellules permissives et / ou par l&#39;infection des œufs embryonnés. Avant la délivrance, l&#39;ADNc peut être manipulé par des techniques de clonage standard afin de générer les modifications désirées. Alors que les mutations spécifiques des différents produits des gènes et des séquences régulatrices du virus peuvent être carrément obtenus de cette façon, la plupart des travaux publiés concernant NDV recombinant a nécessité l&#39;ajout d&#39;une nouvelle unité de transcription dans le génome du NDV. Comme d&#39;autres membres de la famille des paramyxovirus, le génome du NDV code pour huit protéines différentes en six unités transcriptionnelles qui sont exprimés de façon différentielle en fonction de leur localisation relativement à l&#39;extrémité 3 &#39;dans un gradient critique pour le cycle de vie viral une diminution. De ce fait, l&#39;emplacement de la nouvelle unité de transcription dans le génome doit être soigneusement choisie pour obtenir un équilibre entre l&#39;expression du transgène et de la déficience de la réplication virale. Insertion entre gènes P et M a été le plus utilisé, tautres sites Hough ont également été testés 13,31. Quelle que soit la pièce, le clonage de l&#39;ADNc dans NDV doit suivre certaines règles pour générer une construction rescuable: (i) tout nouveau gène à être inclus dans le génome NDV doit être sous le contrôle des signaux appropriés pour l&#39;ARN-dépendante de l&#39;ARN viral polymerase. Ces séquences doivent être ajoutés en amont du nouveau cadre de lecture ouvert (ORF) de sorte que la polymerase peuvent reconnaître la fin du gène précédent (GE) et le début de la nouvelle transgène (GS), espacée par une seule séquence intergénique de nucleotides (IG) . L&#39;addition d&#39;un Kozak valide (K) Séquence d&#39;améliorer traduction ribosomale eucaryotique est également recommandé pour une meilleure expression de la protéine étrangère 32, (ii) la réplication efficace du NDV, comme pour la plupart des membres de la famille des Paramyxoviridae, est fonction de la longueur du génome étant multiple de six 33, par conséquent, une insertion dans le NDV doit suivre cette «règle de six». Si nécessaire, required nucléotides supplémentaires peuvent être ajoutés en aval de l&#39;ORF de nouveau, et (iii) la séquence du transgène doit être vérifié pour trouver possible GE et GS comme des séquences qui pourraient nuire à l&#39;efficacité de sauvetage, l&#39;expression du transgène et / ou la viabilité du virus. S&#39;ils sont présents, ces séquences doivent être éliminés par mutagenèse silencieuse. La génération d&#39;ADNc de pleine longueur recombinant suivant les règles mentionnées ci-dessus est la première étape en vue de produire efficacement un NDV génétiquement modifiés comme indiqué ici. Dans le système toutes les constructions d&#39;ADN sont sous le contrôle du promoteur de la polymérase T7 ARN (figure 3). Cette polymerase cytoplasmique est fournie en trans par co-infection avec un virus recombinant modifié de la vaccine Ankara (MVA-T7) 34. Figure 3A montre le plasmide pNDV-B1, qui code pour la longueur complète de l&#39;ADNc antigénomique 5. Figure 3B montre les plasmides PTM1 codant NP, P et L ORF. Les plasmides pCITE-GFP, qui code pour, under du promoteur T7, la protéine fluorescente verte (GFP), et pCAGGS GFP 18, qui code pour le même ORF sous le promoteur de l&#39;actine bêta poulet 35, sont utilisés comme contrôles. Dans ce protocole, on montre la procédure pour sauver NDV recombinant à partir de l&#39;ADNc de la souche de NDV lentogène Hitchner B1 5 (Figure 4).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (LPF2000)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35% Bovine Albumin (BA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>232-936-2</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (PS) 100x</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			Cell lines 
			A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 &#176;C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. 
			Embryonated chicken eggs 
			Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 &#176;C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. 
			Turkey red blood cells (RBC) 
			Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 &#176;C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 &#176;C for several days. 
			Plasmids 
			Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer&#39;s instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 &#956;g/&#956;l and stored at -20 &#176;C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. 
			Viruses 
			The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. 
			Tissue culture media and solutions: 
			DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 &#176;C. 
			10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 
			1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 
			100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2&#8226;6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 
			1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4&#176;C.
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rescue of recombinant newcastle disease virus from cdna

Le virus de la maladie de Newcastle (NDV), le membre prototype du genre Avulavirus de la famille des Paramyxoviridae 1, est un, de sens négatif non segmenté simple brin, virus enveloppé à ARN (Figure 1) avec des applications potentielles en tant que vecteur pour la vaccination et traitement de maladies humaines. Exploration de ces applications en profondeur est seulement devenu possible après la mise en place de techniques de génétique inverse pour sauver des virus recombinants de plasmides codant pour leurs génomes complets comme ADNc 2-5. ADNc viral peut être facilement modifiée in vitro en utilisant des procédures de clonage standard pour modifier le génotype du virus et / ou pour inclure de nouvelles unités de transcription. Sauvetage de ces virus génétiquement modifiés constitue un outil précieux pour comprendre les facteurs qui affectent plusieurs stades de l&#39;infection, ainsi que permet le développement et l&#39;amélioration des vecteurs pour l&#39;expression et la livraison des antigènespour la vaccination et de la thérapie. Ici, nous décrivons un protocole pour le sauvetage de NDVs recombinantes.

Sauvetage de NDV est une procédure bien établie, régulièrement effectuées dans les laboratoires qui ont accès à l&#39;ADNc complet du virus. Cependant, la nature stochastique intrinsèque du procédé, il est difficile d&#39;atteindre 100% d&#39;efficacité de sauvetage. Suivi des premières étapes du processus, spécialement l&#39;efficacité de la transfection et l&#39;infection par le MVA-T7, aide à identifier les problèmes possibles. Figure 5A montre transfection standard et l&#39;efficaci...

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Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Virus de la maladie de Newcastle (NDV) a été largement étudiée au cours des dernières années afin de développer de nouveaux vecteurs pour la vaccination et le traitement, entre autres. Ces études ont été possibles grâce à des techniques de sauvetage virus recombinant à partir d&#39;ADNc, comme celles que nous décrivons ici.

Sauvetage de virus de la maladie de Newcastle recombinant à partir d&#39;ADNc

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

rescue-of-recombinant-newcastle-disease-virus-from-cdna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.2K vues.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  Virus de la maladie de Newcastle (NDV) a été largement étudiée au cours des dernières années afin de développer de nouveaux vecteurs pour la vaccination et le traitement, entre autres. Ces études ont été possibles grâce à des techniques de sauvetage virus recombinant à partir d'ADNc, comme celles que nous décrivons ici. 

Vidéo: Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recherche

Immunologie et infection

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

L&#39;expression de l&#39;hémagglutinine recombinante fonctionnelle et la neuraminidase du virus de la nouvelle grippe H7N9 à l&#39;aide du système d&#39;expression baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Scalable High Throughput sélection à partir de bibliothèques d&#39;anticorps synthétiques phage

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Génération de Recombinant Human IgG anticorps monoclonaux à partir de cellules immortalisées Classé B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Le sauvetage et la caractérisation du virus recombinant à partir d&#39;un nouveau clone infectieux du virus Zika du monde

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

Détection et suppression de nucléase Contamination durant la Purification de l’intégrase du Virus spumeux Prototype Recombinant

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Extraction rapide, sûre et Simple acide nucléique chevet manuelle pour la détection des Virus dans des échantillons de sang total

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Évaluation des réponses de cellules T spécifiques du Virus Zika dans les organes Immunoprivileged des Ifnar1 infecté les souris- / -

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Identification de codage et de Classes d’ARN Non codants exprimée chez le porc sang total

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...