Bu çalışma kısmen PhRMA vakfı ve Maryland Üniversitesi, College Park'tan bir Araştırma ve Akademik Ödülü tarafından finanse edildi. Prof. DarrellIrvine'e, "Lenf nodu mikroçevresinin adjuvan salınımlı polimer parçacıklarının intranodal enjeksiyonu yoluyla yerinde mühendisliği" tamamlanmasında yapılan ilk çalışmaların desteği için teşekkür ederiz. 5

Bu protokoldeki tüm hayvan çalışmaları Federal, Eyalet ve yerel yönergelere uygun olarak ve Maryland Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelenen ve onaylanan protokoller kullanılarak tamamlanmıştır.
1. Lipid stabilize Mikro ve Nanopartiküllerin Sentezi
<ol><li>7 ml'lik cam şişelerde DOPC, DSPE-PEG ve DOTAP lipitlerini 60:20:20 molar oranında birleştirerek ana lipit karışımını hazırlayın.<ol>
<li>Tek bir numuneyi sentezlemek için: Sırasıyla DOPC, DSPE-PEG ve DOTAP'ın 242,9 μl, 287,4 μl ve 71,9 μl'sini 2 ml cam serolojik pipetler kullanarak şişeye aktarın.</li>
		<li>Birden fazla örneği sentezlemek için: Yukarıdaki her lipit hacmini numune sayısıyla çarpın ve tek bir şişede birleştirin, ardından bu lipit karışımının eşit aliquotlarını hazırlanacak her örneğe karşılık gelen şişelere aktarın.</li>
		<li>Lipitleri 10 dakika boyunca hafif bir azot gazı akışı altında kurulayın veya bir gecede vakumlu fırına yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tek, boş 20 ml'lik bir cam şişede, 16 mg/ml polimer stok çözeltisi oluşturmak için her parçacık örneği için 5 ml dikloromethanede 80 mg PLGA çözün.</li>
	<li>Kurutulmuş lipitleri, kapağı ve girdabı içeren şişelere 30 saniye boyunca 5 ml polimer çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Mikropartikülleri sentezlemek için:<ol>
<li>Polimer, lipid ve diğer suda çözünmeyen kargoyu içeren organik fazı bir sonicator kullanarak 12 W'ta buz üzerinde sonicating başlayın.</li>
		<li>1 mg peptit, protein veya diğer suda çözünür kargo içeren 500 μl damıtılmış H2O veya H2O eklemek için bir pipet kullanarak yağdaki su (w/o) emülsiyonunu oluşturun.</li>
		<li>Buz üzerinde 12 W'ta 30 saniye boyunca sonicating devam edin, tam emülsifikasyon sağlamak için şişeyi yukarı ve aşağı ve yan yana sallayın.</li>
		<li>W/o emülsiyonunu 150 ml'lik bir beherde 40 ml H2O'ya dökerek sudaki su (w/o/w) emülsiyonunu oluşturun.</li>
		<li>Dijital homojenizatör kullanarak 16.000 rpm'de 3 dakika homojenize edin.</li>
		<li>Manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin, kabı bir karıştırma plakasına aktarın ve fazla çözücüyü çıkarmak için w /o/w emülsiyonun gece boyunca karıştırmasına izin verin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nanopartikülleri sentezlemek için:<ol>
<li>Polimer, lipid ve diğer suda çözünmeyen kargoyu içeren organik fazı 14 W'ta buz üzerinde sonicating başlayın.</li>
		<li>1 mg peptit, protein veya suda çözünür kargo içeren 500 μl damıtılmış H2O veya H2O eklemek için bir pipet kullanarak w/o emülsiyonunu oluşturun.</li>
		<li>Buz üzerinde 14 W'ta 30 saniye sonicating devam edin.</li>
		<li>W/o emülsiyonunu 150 ml'lik bir beherde 40 ml H2O'ya dökerek ve buz üzerinde 16 W'da 5 dakika sonicating yaparak w/o/w emülsiyonunu oluşturun. Tam emülsifikasyon sağlamak için şişeyi sonicator ucunun etrafında yukarı ve aşağı ve yan yana hafifçe sallayın.</li>
		<li>Manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin, şişeyi bir karıştırma plakasına aktarın ve fazla çözücüyü çıkarmak için w/o/w emülsiyonun gece boyunca karıştırmasına izin verin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ertesi sabah, parçacıkları yıkayın ve toplayın:<ol>
<li>Emülsiyon'u 40 μm Naylon ağ hücre süzgecinden 50 ml konik bir tüpe dökün.</li>
		<li>Mikropartiküller için 5.000 x g'da 5 dakika veya nanopartiküller için 24.000 x g'da 5 dakika santrifüj parçacıkları.</li>
		<li>1 ml H2O'da yeniden dirılarak parçacıkları dekant süpernatant ve yıkama.</li>
		<li>Askıya alınan parçacıkları 1,5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
		<li>Mikropartiküller için 5.000 x g'da 5 dakika veya nanopartiküller için 24.500 x g'da 5 dakika santrifüj.</li>
		<li>Süpernatantı çıkararak, 1 ml H 2 O'da yeniden oluşturarak ve1.6.5adımında olduğu gibi santrifüjle parçacıkları iki kez daha yıkayın. Yıkadıktan sonra, parçacıkları hemen kullanım için 1 ml H2O'da askıya alın veya genişletilmiş depolama için liyofilize edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Sentez Veriminin Ölçülen
<ol><li>Boş bir 20 ml cam şişeye önceden ağır bas. Karıştırmak için bir mikropipette ile yukarı ve aşağı pipetledikten sonra önceden ağır basılan şişeye 100 μl parçacık süspansiyonu ekleyin.</li>
	<li>Parçacıkları liyofilize edin veya yumuşak bir azot akışı altında kurutun.</li>
	<li>Kurutulmuş polimer içeren şişeyi tartın. Kurumuş parçacıkları içeren şişenin kütlesinden şişenin orijinal ağırlığını çıkararak şişedeki partikül verimini belirleyin.</li>
	<li>Şişedeki parçacık kütlesini seyreltme faktörü ile çarparak genel parçacık verimini belirleyin. Yüzde verimini belirlemek için parçacık kütlesini maksimum teorik giriş kütlesine bölün ve % 100 ile çarpın.</li>
</ol>3. Parçacık Boyutunun Belirlenmesi
<ol><li>Deiyonize su ile doldurup pamuk uçlu çubukla silerek birlikte verilen cuvette tarzı cam fraksiyon hücresini temizleyin. Temizlenmiş fraksiyon hücresine 10 ml damıtılmış H2O aktarın, manyetik mikro karıştırma çubuğu ekleyin ve fraksiyon hücresini parçacık boyutu analizörünün hücre montajına yükleyin.</li>
	<li>Fraksiyon hücresinde tam karıştırma elde etmek için parçacık analizöründeki manyetik karıştırma hızını ayarlayın ve bölme kapısını kapatın.</li>
	<li>Enstrüman yazılımı arabirimini kullanarak lazerleri kesir hücresine hizalayın.</li>
	<li>Yalnızca damıtılmış H2O içeren kesir hücresiyle taban çizgisi okumasını kaydetmek için enstrüman yazılımı arabirimini kullanın.</li>
	<li>Pipet orijinal parçacık süspansiyonu karıştırmak için bir mikropipette ile yukarı ve aşağı.</li>
	<li>Pipet fraksiyon hücresine 10 μl parçacık süspansiyonu (tipik olarak yaklaşık 0,5 mg). Hücreye eklenen parçacık numunesinin hacminin, cihaz yazılımı arayüzünde belirtildiği gibi uygun aralıkta sinyal gücü oluşturmak için yeterli olduğundan emin olun. Gerekli parçacıkların gerçek kütlesi yüzde verimine ve parçacık örneğinin optik özelliklerine bağlıdır.</li>
	<li>Plga için 1.60 kırma indeksi kullanarak parçacık boyutu analizör bölmesi kapısını kapatın ve parçacık boyutunu ölçün.</li>
	<li>Sayı temeli kullanarak parçacık çapını hesaplamak için yazılım arayüzünü kullanın.</li>
</ol>4. Parçacıkların Görselleştirilmesi
<ol><li>Pipet parçacık süspansiyonu karıştırmak için mikropipette ile yukarı ve aşağı. Parçacık süspansiyonunu deiyonize suda 1 mg / ml'ye seyreltin.</li>
	<li>Kabarcık oluşumunu önlemek için 3 μl seyreltilmiş parçacık süspansiyonu ekleyerek ve bir kapak kapağını 45 ° açıyla monte ederek bir mikroskop slaytı hazırlayın. Her floresan kargo için uygun filtre setlerini kullanarak slaydı mikroskop aşamasına ve görüntüye yerleştirin.</li>
</ol>5. I.LN için Farelerin Hazırlanması. enjeksiyon
<ol><li>İzleyici boya çözeltisi hazırlayın:<ol>
<li>10 mg boya tozunun 10 ml damıtılmış H2O ile çözünmesiyle% 0,1 (w/v) izleyici boyası çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>Boya çözeltisini 0,2 μm şırınna filtresi kullanarak bir cam şişeye sterilize edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjeksiyondan bir gün önce, IACUC onaylı bir hayvan protokolüne göre izofluran kullanarak fareyi uyuşturur. Anestezi derinliğini değerlendirmek için, bir parmak sıkışma refleks testi gerçekleştirin ve dakikada yaklaşık 100-140 nefes solunum hızı sağlamak için nefes alma hızını izleyin.</li>
	<li>Fare uyuşturulurken saçlarını kuyruk ve arkadaki makas kullanarak tıraş edin. Saçı hayvanın ventral tarafından ve yanal olarak arka bacağın (kalça) ekleminin hemen üstündeki sırt tarafına çıkarın.</li>
	<li>İzleyici boya enjekte et.<ol>
<li>Her boya enjeksiyonu için, 10 μl boya çözeltisini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için bir mikropipette kullanın ve 10 μl'nin tamamını 1 ml şırıngaya bağlı 31G iğneye epire edin.</li>
		<li>Saçın kırpıldığı kuyruk tabanının her iki tarafına deri altından 10 μl boya çözeltisi enjekte edin, enjeksiyonlar arasında yeniden yükleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pamuklu çubuklar yoluyla hafif bir tüy döken krem uygulayarak kalan saçları çıkarın. Arka uyluk ve karın arasındaki bölgeyi kaplayıp kaplayıp kaplamayı unutmayın.</li>
	<li>Depilatör kremin ciltte 3 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. Kuluçkadan sonra, ılık H2O ile ıslak eldivenli el ve cildin içine depilatory kremi hafifçe sürün.</li>
	<li>Eldivenli eli ılık H2O ile ıslatarak ve kuyruk tabanını ve arka ayakları ovalayarak hemen depilatör kremi çıkarın. Aşırı depilatory çıkarılana kadar tekrarlayın, tahrişi önlemek için el ıslak tuttuğunuzdan emin olun.</li>
	<li>Yumuşak bir bezi veya kağıt havluyu ılık H2O ile ıslatarak ve farenin alt kısmını silerek tek bir hareketle fareden artık depilatory'i çıkarın. Farenin aşınmasını veya cilt hasarını önlemek için bir ovma hareketinden kaçının.</li>
	<li>Farenin bir ısı lambası altında iyileşmesine ve tutmaya dönmesine izin verin.</li>
</ol>6. I.LN. Parçacıkların Enjeksiyonu
<ol><li>Ertesi gün, IACUC onaylı bir hayvan protokolüne göre izofluran kullanarak fareyi uyuşturun.</li>
	<li>Her kasık lenf düğümüne izleyici boyasının drenajını doğrulamak için fareyi inceleyin. Lenf nodu arka uyluk ve karın yakınında karanlık bir nokta olarak görünmelidir.</li>
	<li>Parçacık enjeksiyonu çözeltisi hazırlayın:<ol>
<li>İstenilen enjeksiyon konsantrasyonunda damıtılmış H2O'daki parçacıkları yeniden diriltir. Her enjeksiyon için, 10 μl parçacık çözeltisini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için bir mikropipette kullanın.</li>
		<li>10 μl'nin tamamını 1 ml şırıngaya bağlı 31G insülin iğnesine epire edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjekte parçacık dozu:<ol>
<li>LN'yi görselleştirdikten sonra, cilt alay hareketini çekmek ve enjeksiyon hacminin kontrollü bir şekilde yerleştirilmesine izin vermek için başparmak, işaret parmağı ve orta parmak kullanarak LN çevresindeki cildi sıkılaştırın.</li>
		<li>LN'ye iğneyle cilde 90° açıyla yaklaşın ve boyalı LN üzerinden 1 mm derinliğe kadar cilde nüfuz edin.</li>
		<li>Tüm birimi yavaşça enjekte edin. Enjeksiyon sırasında, görünür LN büyütme ile enjeksiyonu onaylamak için cilt boyunca LN hacmini gözlemleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Farenin bir ısı lambası altında iyileşmesine izin verin ve tutmaya geri dönün veya ek testler gerçekleştirin.</li>
</ol>İlgili analiz teknikleri için (örneğin histoloji, akış sitometrisi) bkz.

<ol>
	<li>Swartz, M. A., Hirosue, S., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Approaches+to+Immunotherapy.">Engineering Approaches to Immunotherapy.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Adamina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranodal+immunization+with+a+vaccinia+virus+encoding+multiple+antigenic+epitopes+and+costimulatory+molecules+in+metastatic+melanoma.">Intranodal immunization with a vaccinia virus encoding multiple antigenic epitopes and costimulatory molecules in metastatic melanoma.</a> Mol. Ther. 18, 651-659 (2010).</li><li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-Lymph+Node+Prime-Boost+Vaccination+against+Melan+A+and+Tyrosinase+for+the+Treatment+of+Metastatic+Melanoma:+Results+of+a+Phase+1.">Intra-Lymph Node Prime-Boost Vaccination against Melan A and Tyrosinase for the Treatment of Metastatic Melanoma: Results of a Phase 1.</a> Clinical Trial. Clin. Cancer Res. 17, 2987-2996 (2011).</li><li>Senti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intralymphatic+allergen+administration+renders+specific+immunotherapy+faster+and+safer:+a+randomized+controlled+trial.">Intralymphatic allergen administration renders specific immunotherapy faster and safer: a randomized controlled trial.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 17908-17912 (2008).</li><li>Jewell, C. M., Lopez, S. C. B., Irvine, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+engineering+of+the+lymph+node+microenvironment+via+intranodal+injection+of+adjuvant-releasing+polymer+particles.">In situ engineering of the lymph node microenvironment via intranodal injection of adjuvant-releasing polymer particles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15745-15750 (2011).</li><li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+kinetics+determines+immune+reactivity.">Antigen kinetics determines immune reactivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5189-5194 (2008).</li><li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels.">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 617-628 (2005).</li><li>Irvine, D. J., Jewell, C. M., Ducheyne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+132.">Ch. 132.</a> Comprehensive Biomaterials. , (2011).</li><li>Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Nano-+and+Microparticles+to+Tune+Immunity.">Engineering Nano- and Microparticles to Tune Immunity.</a> Adv. Mater. 24, 3724-3746 (2012).</li><li>Reddy, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+lymphatic+transport+and+complement+activation+in+nanoparticle+vaccines.">Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines.</a> Tissue Eng. Part A. 14, 734-735 (2008).</li><li>Bershteyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-supported+lipid+shells,+onions,+and+flowers.">Polymer-supported lipid shells, onions, and flowers.</a> Soft Matter. 4, 1787-1791 (2008).</li><li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+intralymphatic+injection+of+peptide+vaccines+enhances+immunogenicity.">Direct intralymphatic injection of peptide vaccines enhances immunogenicity.</a> Eur. J. Immunol. 35, 568-574 (2005).</li><li>Mohanan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+routes+affect+the+quality+of+immune+responses:+A+cross-sectional+evaluation+of+particulate+antigen-delivery+systems.">Administration routes affect the quality of immune responses: A cross-sectional evaluation of particulate antigen-delivery systems.</a> J. Controlled Release. 147, 342-349 (2010).</li><li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+in+the+mouse.">Lymph node mapping in the mouse.</a> J. Immunol. Methods. 332, 170-174 (2008).</li><li>He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Flow+Cytometry+Analyses+of+Cellular+Immune+Response+in+Rhesus+Macaques.">Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques.</a> J. Vis. Exp. , 1743 (2010).</li><li>Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+2-Photon+Imaging+of+Peripheral+Lymph+Nodes+in+Mice.">Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice.</a> J. Vis. Exp. e265. , 265 (2007).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Imaging+of+T+Cells+in+Murine+Lymph+Node+Slices+with+Widefield+and+Confocal+Microscopes.">Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes.</a> J. Vis. Exp. , 3054 (2011).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Immunofluorescence Staining. , (2001).</li><li>Hofman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Immunohistochemistry. , (2001).</li><li>Holmes, K., Lantz, L. M., Fowlkes, B. J., Schmid, I., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Preparation of Cells and Reagents for Flow Cytometry. , (2001).</li><li>Sharrow, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Overview of Flow Cytometry. , (2001).</li><li>Sharrow, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Analysis of Flow Cytometry Data. , (2001).</li><li>Anderson, J. M., Shive, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+and+biocompatibility+of+PLA+and+PLGA+microspheres.">Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 28, 5-24 (1997).</li><li>Danhier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLGA-based+nanoparticles:+an+overview+of+biomedical+applications.">PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications.</a> J. Controlled Release. 161, 505-522 (2012).</li></ol>

Bu makalelerin üretim maliyetleri ve erişim ücretleri kısmen HORIBA, Ltd. tarafından desteklenmiştir.

Bu protokolde açıklanan teknik, aşıların LN'lere ve LN yerleşik antijen sunan hücrelere kontrollü olarak ulaştırılmasını sağlar. Biyomalzeme kapsüllü kargo LN içinde yerelleştirilebilir ve LN mikroçevrimine teslim edilen bir veya daha fazla kargo türünün dozlarının manipülasyonunu sağlar. Polimer parçacıklarından lokalizasyon ve kontrollü salınımın, geleneksel yaklaşımlara göre önemli ölçüde daha düşük dozlarda güçlü bir hücresel ve humoral immün yanıt ürettiği gösterilmiştir. Ayrıca, biyomalzeme taşıyıcı boyutunun manipülasyonu yoluyla, hücresel işlemenin birincil modu nanopartiküllerin doğrudan alınması veya daha büyük mikropartiküllerden hücre dışı kargo salınımı arasında modüle edilebilir5. Bu sonuçlar, terapötik aşı dağıtımı için bir platform olarak i.LN. biyomalzeme teslimatının fizibilitesini ortaya oturtur.
PLGA parçacıklarının emülsiyon/solvent buharlaşması ile sentezi ilaç dağıtım uygulamalarında yaygın olarak23,24. Bu nedenle, bu teknikle ilişkili potansiyel zorluklar çoğunlukla LN hedef sahasında aşıların başarılı bir şekilde tanımlanması ve birikmesi ile ilgilidir. İzleyici boya kullanımı hedeflenen kasık LN'lerinin görselleştirilmesini kolaylaştırsa da, cildin altındaki hedef boyut ve derinlik küçüktür. Bu nedenle, yazarlar farelerin hazırlanmasını ve enjeksiyonlarını uygulamak için zaman ve fare tahsis etmeyi önerir. Hayvan hazırlığı sırasında(yani tıraş ve depilasyon uygulaması), bacağın karınla olan açısının cildi makaslardan yaralanmaya daha yatkın hale getirdiği hayvanın ventral tarafındaki fareleri kesmemeye özen edilmelidir. Ek olarak, hayvanların normal bakım davranışı sırasında kremi yutmasını önlemek için tüm epilasyon ılık suyla çıkarılmalıdır. LN enjeksiyonlarını uygulamak için, daha yüksek bir izleyici boya konsantrasyonu uygulanabilir ve hayvanlar ötenaziye tabi edilebilir ve daha sonra birden çok kez enjekte edilebilir. Enjeksiyon fareleri nekropsilenebilir ve enjekte edilen hayvanlardan gelen LN'lerin büyüklüğü, seçilmemiş bir kontrol LN ile karşılaştırılabilir. Bu tekniğin bir sınırlaması, LN yapısına yüklenebilen enjeksiyon hacminin fiziksel sınırıdır. Protokolümüz farelerde 10 μl enjeksiyon hacmi önermektedir, ancak diğer çalışmalar en az 20 μl kadar yüksek enjeksiyon hacimleri bildirmektedir.
Belirtildiği gibi, parçacıkların fiziksel özelliğini(yani boyutunu) değiştirmek, LN dokusundaki biyomalzemeler ve kapsüllenmiş kargolar tarafından indüklenen yolu veya sonuçları değiştirmek için etkili bir mekanizmadır. Emülsiyon/çözücü buharlaştırma protokolü, yüzey yükü veya işlevselliği ve biyobozunurluk/kargo salınımı oranı23,24gibi fiziksel veya kimyasal özellikleri değiştirmek için kolayca değiştirilebilir. Örneğin, salınım kinetiği alternatif polimer bileşimleri aracılığıyla ayarlanabilir ve yüzey fonksiyonu modifiye lipid bileşimleri veya poli (vinil alkol) kullanılarak değiştirilebilir. Parçacıklara yüklenen kargo, hedef patojenler için farklı antijenler veya adjuvanlar içerecek şekilde kolayca manipüle edilebilir. Bu yaklaşımın avantajı, i.LN. teslimatının biyomalzemelerden kargonun yerel, kontrollü salınımı ile birleştirilmesiyle elde edilir. Bu sinerji, dakika dozları kullanarak ve spesifik olmayan / sistemik yan etkileri azaltılmış adaptif bağışıklık yanıtları verimli bir şekilde üretmek için yararlanılabilir bir platform oluşturur.

Lenf düğümleri (LN' ler) bağışıklık sisteminin komuta merkezleridir. Bu immünolojik sitede, hücreleri sunan antijen, hücresel ve humoral immün yanıtları aktive etmek için belirli yabancı antijenlere karşı naif lenfositleri astarlar. Böylece LN'ler aşı ve immünoterapilerin teslimi için cazip bir hedef haline gelmiştir. Ne yazık ki, çoğu aşı stratejisi antijen ve yardımcıların lenfoid dokuya verimsiz, geçici olarak verilmesiyle sonuçlanır1. Bu nedenle, LN'lerde aşı bileşenlerinin hedef ve tutulmasını geliştiren yaklaşımlar, yeni aşıların gücü ve verimliliği üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir.
Yeni klinik çalışmalara büyük ilgi gösteren LN hedeflemesinin zorluğunu atlatmak için bir strateji doğrudan, LN içi (i.LN.) enjeksiyon2-4. Bu denemelerde, basit bir ayakta tedavi prosedürü olarak LN'lere aşı ulaştırmak için ultrason rehberliği kullanıldı. Geleneksel periferik enjeksiyon yolları ile karşılaştırıldığında, bu yaklaşım alerjiler ve kanser2-4dahil olmak üzere terapötik bağlamlarda önemli dozdan sağlayıcı ve daha iyi etkinlik ile sonuçlandı. Bu çalışmalarda lenfatik drenaj ile hızla temizlenen çözünür aşıların(yani biyomalzeme içermeyen) i.LN. enjeksiyonu kullanıldı. Bu nedenle, bu etkileyici terapötik etkileri elde etmek için çoklu enjeksiyonlar veya çoklu enjeksiyon döngüleri uygulandı. LN'de daha iyi elde tutulması, antijen ve/veya adjuvan ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimi artırarak bağışıklık hücresi astarlamanın gücünü daha da artırabilir. Bu potansiyel, antijen kinetiği ve adjuvan doğumun5-7oluşturulan spesifik immün yanıtın belirlenmesinde kritik bir rol oynadığını gösteren son çalışmalarla desteklenmektedir. Ayrıca, ilaç ve aşı dozlarının lokalize ve en aza indirilmesi kronik inflamasyon gibi sistemik etkileri azaltabilir veya ortadan kaldırabilir.
Biyomalzemeler aşıların gücünü ve verimliliğini artırmak için kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır1,8,9. Biyomalzeme taşıyıcılarında kapsülleme veya adsorpsiyon, kargoyu bozulmaya karşı fiziksel olarak koruyabilir ve çözünürlük sınırlamalarının üstesinden gelebilir. Polimerik mikro veya nanopartiküller gibi biyomalzeme taşıyıcıların bir diğer önemli özelliği, birkaç kargo sınıfını birlikte yükleyebilme ve daha sonra bu kargoları kontrollü aralıklarla serbest bırakma yeteneğidir. Bununla birlikte, in vivo biyomalzeme aşıları ve immünoterapileri engellemeye devam eden önemli bir sınırlama, bağışıklık hücrelerinin verimsiz hedeflenmesi ve lenf düğümlerine sınırlı kaçakçılıktır. Örneğin, biyomalzeme aşıların konvansiyonel rotalardan(örneğin intradermal, intramüsküler) periferik enjeksiyonu tipik olarak zayıf LN hedeflemesi sergiler ve enjekte edilen malzemenin% 99'u enjeksiyon yerinde kalır4,10. Daha yakın zamanda, biyomalzeme aşı taşıyıcılarının büyüklüğü, bu aşıların interstisyel akış yoluyla LN'lere tercihli ticaretini veya drenajını iyileştirmek için ayarlanmıştır8,10. Bu gelişmeler, LN ortamının yeni aşılar için hedeflenme ve mühendisliğinin öneminin altını çizerek hücresel ve humoral immün yanıtların artmasına yol açmıştır.
Bu makale, kontrollü salınımlı aşı depoları5,11oluşturmak için lipid stabilize polimer parçacıklarını ve i.LN. teslimatlarını birleştiren bir aşılama protokolü sunun. İ.LNiçin cerrahi teknikler kullanan son çalışmalara dayanarak. farelerde6,7,12,13, küçük hayvanlara biyomalzeme aşıları enjekte etmek için hızlı, cerrahi olmayan bir strateji geliştirdik5. i.LN. dağıtımını biyomalzeme aşı taşıyıcıları ile birleştirmek, kontrollü salınımlı aşı depolarının tek bir enjeksiyonundan sonraki 7 gün içinde CD8 T hücre yanıtını güçlü bir şekilde artırmıştır5. Güçlü bir humoral yanıt(yani antikor titreleri) de üretildi; her iki gelişme de, biyomalzeme taşıyıcılarından kontrollü salınımla aracılık edilen lenf düğümlerinde aşı bileşenlerinin daha fazla tutulmasıyla bağlantılıydı. İlginçtir ki, aşı parçacıklarının boyutu bu malzemelerin kaderini bir kez LN'lerde değiştirdi: nano ölçekli parçacıklar hücreler tarafından doğrudan alımın arttığını gösterirken, daha büyük mikropartiküller hücre dışı LN ortamında kaldı ve LN yerleşik antijen sunan hücreler tarafından alınan kargoyu(örneğin adjuvan) serbest bıraktı5. Bu veriler, i.LN enjekte edilen biyomalzemelerin boyutunu kontrol ederek yeni aşılar için yararlanabilecek iki yol olduğunu göstermektedir.
Bu makalede biyobozunur lipid stabilize polimer parçacıkları (mikro ve nano ölçekli) modifiye çift emülsiyon stratejisi kullanılarak sentezlenir5,11. Partikül özellikleri lazer kırınımı ve mikroskopi ile karakterizedir. Bu parçacıklar daha sonra yaygın, toksik olmayan bir izleyici boyası14kullanılarak cerrahi olmayan olarak tanımlanan kasık LN'lerine doğrudan enjekte edilir. LN'lerin histoloji veya akış sitometrisi ile enjeksiyon sonrası analizi, parçacıkların LN ortamında dağılımını doğrulamak ve zaman içinde parçacıkların hücresel alımını ve tutulmasını izlemek için kullanılabilir. Histolojik işleme ve akış sitometrisini ayrıntılı olarak açıklayan protokoller için, okuyucular son JoVE makalelerine ve dergi raporlarına atıfta bulunulur15-22. Tipik sonuçlar, güçlü, verimli bağışıklık yanıtları elde etmek veya hedef patojenler için bağışıklığı uyarlamak için yararlanılabilen bu depoların yerel LN hedeflemesini göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850375</td>
			<td style="width:167px;">10 mg/ml stock in chloroform</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">880128</td>
			<td style="width:167px;">10 mg/ml stock in chloroform</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">890890</td>
			<td style="width:167px;">10 mg/ml stock in chloroform</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Polylactic-co-glycolic acid (PLGA)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2191</td>
			<td style="width:167px;">Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dichloromethane (DCM)</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH1113</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:71px;">Vetone</td>
			<td style="width:119px;">502017</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nair</td>
			<td style="width:71px;">Nair</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Evans blue tracer dye</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">AAA16774-09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD328418</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD305167</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD309628</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 &#181;m</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-949</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vybrant DiD Cell-Labeling Solution</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">V-22887</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 &#181;m</td>
			<td style="width:71px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">17149</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 &#181;m</td>
			<td style="width:71px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">17156</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Ovalbumin, Purified</td>
			<td style="width:71px;">Worthington Biochemical</td>
			<td style="width:119px;">LS003056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125</td>
			<td style="width:71px;">Qsonica</td>
			<td style="width:119px;">Q125</td>
			<td style="width:167px;">1/8 in diameter microtip probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer</td>
			<td style="width:71px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">YO-04739-22</td>
			<td style="width:167px;">10 G dispersing element</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX-83</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer</td>
			<td style="width:71px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">LA-950</td>
			<td style="width:167px;">Including provided cuvette-style glass fraction cell</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Professional 8685 Peanut Classic Clippers</td>
			<td style="width:71px;">Wahl</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-lymph node injection of biodegradable polymer particles

Adaptif immün yanıtın üretilmesi, bu yabancı moleküllerin T ve B lenfositlerine işlenmesi ve sunulması için lenf düğümlerine verimli drenaj veya antijen kaçakçılığına dayanır. Lenf düğümleri böylece yeni aşılar ve immünoterapiler için kritik hedefler haline gelmiştir. Bu dokuları hedeflemek için yeni bir strateji çözünür aşı bileşenlerinin doğrudan lenf nodu enjeksiyonudur ve bu tekniği içeren klinik çalışmalar umut verici olmuştur. Lenf nodu hedeflemesini iyileştirmek için çeşitli biyomalzeme stratejileri de araştırılmıştır, örneğin biyomalzeme aşı parçacıklarının optimal drenajı için parçacık boyutunu ayarlama. Bu yazıda, doğrudan lenf nodu enjeksiyonu ile antijen, adjuvan veya diğer aşı bileşenleriyle dolu olabilecek biyobozunur polimer parçacıklarını birleştiren yeni bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemde polimerik mikropartiküller veya nanopartiküller lipid stabilizatörlerini içeren modifiye çift emülsiyon protokolü ile sentezlenir. Partikül özellikleri(örneğin boyut, kargo yükleme) sırasıyla lazer kırınım ve floresan mikroskopi ile doğrulanır. Fare lenf düğümleri daha sonra hedef enjeksiyon bölgesinin görselleştirilmesine ve daha sonra lenf düğümlerinde polimer parçacıklarının birikmesine izin veren toksik olmayan bir izleyici boyasının periferik enjeksiyonu ile tanımlanır. Bu teknik, lenf düğümlerine teslim edilen biyomalzemelerin ve aşı bileşenlerinin dozları ve kombinasyonları üzerinde doğrudan kontrol sağlar ve yeni biyomalzeme bazlı aşıların geliştirilmesinde kullanılabilir.

Bu yazıda sunulan protokoller için beklenen sonuçlar üç kategoriye ayrılabilir: parçacık sentezi, hayvan hazırlama ve parçacık enjeksiyonu.
Şekil 1, amfifilik lipitler tarafından stabilize edilen biyobozunur polimer parçacıklarının sentezini ve karakterizasyonunu tasvir eder. Emülsiyon/solvent buharlaşma sentez protokolünün sonuçları (Şekil 1A) üretilen nihai emülsiyonların görsel incelemesi ile nitel olarak değerlendirilebilir; parçacık partileri homojen, opak bir görünüme sahip kararlı emülsiyonlar olmalıdır. Komplikasyonlar, genellikle lipid stabilizatörlerinin yanlış depolanması nedeniyle krem veya flokülasyon yapan emülsiyonları içerir. Bu dengesizliği önlemek için lipitler -80 °C'de susuz bir durumda veya azotla temizlenmiş kapalı bir şişede saklanmalıdır. Parçacık sentezinin nicel değerlendirmesi, boyut dağılımını analiz etmek için lazer kırınımı veya dinamik ışık saçılımı kullanılarak yapılabilir (Şekil 1B). Beklenen sonuçlar, eşit bir parçacık popülasyonu gösteren sıkıca dağılmış, monomodal parçacık boyutlarını içerir. Bu yazıda açıklanan sentez parametreleri, nanopartiküller ve mikropartiküller için sırasıyla yaklaşık 100 nm veya 3 μm merkezli ortalama dağılımlar oluşturur. Parçacık sentezinin daha nitel değerlendirmesi, yukarıdaki protokolün birden fazla floresan kargo sınıfını içerecek şekilde değiştirilmesiyle elde edilebilir. Şekil 1C'de,floresan peptit (FITC, yeşil), lipofilik boya (DiD, kırmızı) ve kaplama görüntüsü (sarı) ile yüklenen mikropartiküllerin mikroskopi görüntüleri, istenen boyut aralığında parçacıkların oluşturunu ve parçacığın hacmi içinde peptidin kapsüllendiğini doğrular.
Şekil 2'nin ilk iki paneli, bu makalede açıklanan i.LN. enjeksiyon stratejisi için hayvan hazırlığının beklenen sonuçlarını özetlemektedir. Metodoloji, sonraki i.LN. parçacık enjeksiyonunun yerini belirlemek için toksik olmayan bir izleyicinin periferik enjeksiyonu ile kasık LN'lerinin işaretlenmesini içerir (Şekil 2A)5. Belirtildiği gibi, kuyruk tabanında deri altı enjeksiyonunu takiben izleyici boyasının drenajı kasık LN'lerinin görselleştirilmesini sağlayacaktır (Şekil 2B)5. Onaylı depilatör kremlerin yutulması fareler için tehlike oluşturabilir. Bu nedenle, pençelere ve farelerin ventral tarafına özellikle dikkat ederek uygulanan tüm kremleri iyice çıkarmaya özen edilmelidir. Depilatory, ıslak, yumuşak bir bez veya ıslak kağıt havlu kullanılarak tek ve pürüzsüz bir hareketle çıkarılmalıdır. Farelerin açıkta kalan cildinde aşınmalara yol açabileceğinden, kremi çıkarmak için sürtünmekten kaçının.
Kasık LN'sine teslimatın lokalinin onaylanması gözlem veya histoloji ile değerlendirilebilir. LN hacmi, başarılı enjeksiyonun bir göstergesi olarak enjeksiyon sırasında görsel olarak izlenebilir. Beklenen sonuçlar, bitişik dokulara veya hücrelere önemli bir sızıntı olmadan LN yapısı boyunca verimli kargo dağıtımını içerir. Ayrıca, enjekte edilen sıvı LN'deki izleyiciyi yerinden ettikçe/seyreltdikçe, enjeksiyondan sonra boya konsantrasyonu / renklendirme daha az yoğun hale gelmelidir. Dokunun gözlemi, sıvı enjeksiyonu nedeniyle bozulmamış, ancak genişlemiş bir LN ortaya açmalıdır. Potansiyel zorluklar arasında çok hızlı enjekte etmek veya LN'yi kaçırmak yer almaktadır, her ikisi de hacmin çevredeki deri altı dokusuna elüasyonuna neden olabilir. Bu istenmeyen sonuçlar, parçacık süspansiyonun enjeksiyon için hedeflenen düğümlerden uzak hücrelere ve dokuya yayıldığının gözlemlendiği nekropsi veya histoloji ile doğrulanabilir. Buna karşılık, beklenen bir sonuç, LN yapısı içindeki parçacıkların çevrelenmesi nedeniyle genişlemiş bir kasık LN'nin tanımlanması olacaktır. Ekscise LN'lerin histolojik işlenmesi, Şekil 2C ve 2D'degösterildiği gibi, lenfoid dokuya kargonun teslimini kesin olarak doğrulayabilir. Şekil 2'deki parçacıkların, enjeksiyon sırasında, histolojik işlem ve floresan mikroskopi sırasında kargonun görselleştirilmesine izin vermek için floresan kargoyu içerdiğini unutmayın.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50984/50984fig1.jpg" width="600px"> Şekil 1. Lipid Stabilize Parçacıkların Sentezi ve Karakterizasyonu. A)Emülsiyon/solvent buharlaşması ile hazırlanan lipid stabilize partiküllerin sentezini açıklayan şematik diyagram. B)Mikropartiküllerin (katı çizgi, çap = 2,8 μm) ve nanopartiküllerin boyut dağılımları (kesik çizgi, çap = 113 nm). C) Floresan etiketli peptit ve floresan parçacık boyası ile yüklü parçacıkların floresan mikroskopi görüntüleri. Etiketler: peptit (yeşil) ve parçacık (kırmızı). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50984/50984fig1highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50984/50984fig2.jpg" width="600px"> Şekil 2. I.LN. LN içinde Biyobozunur Parçacıkların Enjeksiyonu ve Dağılımı. A) i.LN. enjeksiyonu için metodoloji. B)Bir faredeki LN'lerin cilt (üst görüntü) ve nekropsi (alt görüntü) takip edilmesi5. C) Floresan etiketli polimer mikropartiküllerin (parçacıklar, yeşil; T hücreleri, kırmızı; B hücreleri, mavi). D) Enjeksiyondan 24 saat sonra LN'lerde floresan etiketli nanopartiküller (50 nm, sol görüntü) ve mikropartiküller (6 μm, sağ görüntü). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50984/50984fig2highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles at JoVE.com

Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles

Lenf düğümleri immün yanıtı düzenleyen immünolojik dokulardır ve aşılar için kritik bir hedeftir. Lenf düğümlerini daha iyi hedeflemek ve antijenlerin veya yardımcıların doğumlarını kontrol etmek için biyomalzemeler bunların uzaması haline getirildi. Bu makalede, lenf düğümlerine biyouyumlu polimer parçacıkları enjekte etmek için bu fikirleri birleştiren bir teknik açıklanmaktadır.

Biyobozunur Polimer Parçacıklarının Lenf İçi Düğüm Enjeksiyonu

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these ...

intra-lymph-node-injection-of-biodegradable-polymer-particles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.3K Görüntüleme.  University of Maryland, College Park. Lenf düğümleri immün yanıtı düzenleyen immünolojik dokulardır ve aşılar için kritik bir hedeftir. Lenf düğümlerini daha iyi hedeflemek ve antijenlerin veya yardımcıların doğumlarını kontrol etmek için biyomalzemeler bunların uzaması haline getirildi. Bu makalede, lenf düğümlerine biyouyumlu polimer parçacıkları enjekte etmek için bu fikirleri birleştiren bir teknik açıklanmaktadır.

Video: Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science. Methods for particle trapping based on optical, magnetic, electrokinetic, and acoustic techniques have led to major advancements in physics and biology ranging from the molecular to cellular level. In this article, we introduce a new microfluidic-based technique for particle trapping and manipulation based solely on hydrodynamic fluid flow. Using this method, we demonstrate trapping of micro- and nano-scale particles in aqueous solutions for long time scales. The hydrodynamic trap consists of an integrated microfluidic device with a cross-slot channel geometry where two opposing laminar streams converge, thereby generating a planar extensional flow with a fluid stagnation point (zero-velocity point). In this device, particles are confined at the trap center by active control of the flow field to maintain particle position at the fluid stagnation point. In this manner, particles are effectively trapped in free solution using a feedback control algorithm implemented with a custom-built LabVIEW code. The control algorithm consists of image acquisition for a particle in the microfluidic device, followed by particle tracking, determination of particle centroid position, and active adjustment of fluid flow by regulating the pressure applied to an on-chip pneumatic valve using a pressure regulator. In this way, the on-chip dynamic metering valve functions to regulate the relative flow rates in the outlet channels, thereby enabling fine-scale control of stagnation point position and particle trapping. The microfluidic-based hydrodynamic trap exhibits several advantages as a method for particle trapping. Hydrodynamic trapping is possible for any arbitrary particle without specific requirements on the physical or chemical properties of the trapped object. In addition, hydrodynamic trapping enables confinement of a "single" target object in concentrated or crowded particle suspensions, which is difficult using alternative force field-based trapping methods. The hydrodynamic trap is user-friendly, straightforward to implement and may be added to existing microfluidic devices to facilitate trapping and long-time analysis of particles. Overall, the hydrodynamic trap is a new platform for confinement, micromanipulation, and observation of particles without surface immobilization and eliminates the need for potentially perturbative optical, magnetic, and electric fields in the free-solution trapping of small particles.

In this article, we present a microfluidic-based method for particle confinement based on hydrodynamic flow. We demonstrate stable particle trapping at a fluid stagnation point using a feedback control mechanism, thereby enabling confinement and micromanipulation of arbitrary particles in an integrated microdevice.

Tek Parçacıklar için mikroakışkan tabanlı Hidrodinamik Tuzak

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Biyomühendislik

A Chitosan Based, Laser Activated Thin Film Surgical Adhesive, 'SurgiLux': Preparation and Demonstration

Sutures are a 4,000 year old technology that remain the 'gold-standard' for wound closure by virtue of their repair strength (~100 KPa). However, sutures can act as a nidus for infection and in many procedures are unable to effect wound repair or interfere with functional tissue regeneration.1 Surgical glues and adhesives, such as those based on fibrin and cyanoacrylates, have been developed as alternatives to sutures for the repair of such wounds. However, current commercial adhesives also have significant disadvantages, ranging from viral and prion transfer and a lack of repair strength as with the fibrin glues, to tissue toxicity and a lack of biocompatibility for the cyanoacrylate based adhesives. Furthermore, currently available surgical adhesives tend to be gel-based and can have extended curing times which limit their application.2 Similarly, the use of UV lasers to facilitate cross-linking mechanisms in protein-based or albumin 'solders' can lead to DNA damage while laser tissue welding (LTW) predisposes thermal damage to tissues.3 Despite their disadvantages, adhesives and LTW have captured approximately 30% of the wound closure market reported to be in excess of US $5 billion per annum, a significant testament to the need for sutureless technology.4
In the pursuit of sutureless technology we have utilized chitosan as a biomaterial for the development of a flexible, thin film, laser-activated surgical adhesive termed 'SurgiLux'. This novel bioadhesive uses a unique combination of biomaterials and photonics that are FDA approved and successfully used in a variety of biomedical applications and products. SurgiLux overcomes all the disadvantages associated with sutures and current surgical adhesives (see Table 1).
In this presentation we report the relatively simple protocol for the fabrication of SurgiLux and demonstrate its laser activation and tissue weld strength. SurgiLux films adhere to collagenous tissue without chemical modification such as cross-linking and through irradiation using a comparatively low-powered (120 mW) infrared laser instead of UV light. Chitosan films have a natural but weak adhesive attraction to collagen (~3 KPa), laser activation of the chitosan based SurgiLux films emphasizes the strength of this adhesion through polymer chain interactions as a consequence of transient thermal expansion.5 Without this 'activation' process, SurgiLux films are readily removed.6-9 SurgiLux has been tested both in vitro and in vivo on a variety of tissues including nerve, intestine, dura mater and cornea. In all cases it demonstrated good biocompatibility and negligible thermal damage as a consequence of irradiation.6-10

A Chitosan Based, Laser Activated Thin Film Surgical Adhesive, &#039;SurgiLux&#039;: Preparation and Demonstration

The fabrication of a novel, flexible thin film surgical adhesive from FDA approved ingredients, chitosan and indocyanine green is described. Bonding of this adhesive to collagenous tissue through a simple activation process with a low-powered infra-red laser is demonstrated.

Bir Kitosan Bazlı, Lazer Aktif İnce Film Cerrahi Yapıştırıcı, &#39;SurgiLux&#39;: Hazırlık ve Gösteri

Sutures are a 4,000 year old technology that remain the 'gold-standard' for wound closure by virtue of their repair strength (~100 KPa). However, sutures ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Kombinatorik Sentezi ve Polimer Film ve Nanoparçacık Kütüphaneler gelen Yüksek throughput Protein Yayın

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

Tri-broşür Polimer Vanalar göreceli hidrodinamik Değerlendirme Protokolü

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

Biyobozunur polimerik nano partiküllerin kullanılması Tedavi Angiogenezis Programlama Kök Hücreler

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Manufacturing Of Robust Natural Fiber Preforms Utilizing Bacterial Cellulose as Binder

A novel method of manufacturing rigid and robust natural fiber preforms is presented here. This method is based on a papermaking process, whereby loose and short sisal fibers are dispersed into a water suspension containing bacterial cellulose. The fiber and nanocellulose suspension is then filtered (using vacuum or gravity) and the wet filter cake pressed to squeeze out any excess water, followed by a drying step. This will result in the hornification of the bacterial cellulose network, holding the loose natural fibers together.
Our method is specially suited for the manufacturing of rigid and robust preforms of hydrophilic fibers. The porous and hydrophilic nature of such fibers results in significant water uptake, drawing in the bacterial cellulose dispersed in the suspension. The bacterial cellulose will then be filtered against the surface of these fibers, forming a bacterial cellulose coating. When the loose fiber-bacterial cellulose suspension is filtered and dried, the adjacent bacterial cellulose forms a network and hornified to hold the otherwise loose fibers together.
The introduction of bacterial cellulose into the preform resulted in a significant increase of the mechanical properties of the fiber preforms. This can be attributed to the high stiffness and strength of the bacterial cellulose network. With this preform, renewable high performance hierarchical composites can also be manufactured by using conventional composite production methods, such as resin film infusion (RFI) or resin transfer molding (RTM). Here, we also describe the manufacturing of renewable hierarchical composites using double bag vacuum assisted resin infusion.

We present a novel method of manufacturing rigid and robust short natural fiber preforms using a papermaking process. Bacterial cellulose acts simultaneously as the binder for the loose fibers and provides rigidity to the fiber preforms. These preforms can be infused with a resin to produce truly green hierarchical composites.

Binder Bakteriyel Selüloz kullanmak Sağlam Doğal Elyaf preform üretim

A novel method of manufacturing rigid and robust natural fiber preforms is presented here. This method is based on a papermaking process, whereby loose ...

TAPE: A Biodegradable Hemostatic Glue Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants for Surgical Application

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant adhesion strength than commercial tissue adhesives. Medical adhesives have attracted great attention as potential alternative tools to sutures and staples due to their convenience in usage with minimal invasiveness. Although there are several protocols for developing tissue adhesives including those commercially available such as fibrin glues and cyanoacrylate-based materials, mostly they require a series of chemical syntheses of organic molecules, or complicated protein-purification methods, in the case of bio-driven materials (i.e., fibrin glue). Also, the development of surgical glues exhibiting high adhesive properties while maintaining biodegradability is still a challenge due to difficulties in achieving good performance in the wet environment of the body. We illustrate a new method to prepare a medical glue, known as TAPE, by the weight-based separation of a water-immiscible supramolecular aggregate formed after a physical mixing of a plant-derived, wet-resistant adhesive molecule,&#160;Tannic Acid (TA), and a well-known biopolymer, Poly(Ethylene) glycol (PEG). With our approach, TAPE shows high adhesion strength, which is 2.5-fold more than commercial fibrin glue in the presence of water. Furthermore, TAPE is biodegradable in physiological conditions and can be used as a potent hemostatic glue against tissue bleeding. We expect the widespread use of TAPE in a variety of medical settings and drug delivery applications, such as polymers for muco-adhesion, drug depots, and others.

We describe the simplest protocol to prepare biodegradable medical glue that has an effective hemostatic ability. TAPE is a water-immiscible supramolecular aggregate prepared by mixing of tannic acid, a ubiquitous compound found in plants, and poly(ethylene) glycol, yielding a 2.5 times greater water-resistant adhesion compared with commercial fibrin glue.

BANT: Cerrahi Uygulama için Bitkilerde bir Ubiquitous Bileşik esinlenerek bir Biyobozunur Hemostatik Tutkal

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Sustained Administration of &amp;#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets &lt;em&gt;Ex Vivo&lt;/em&gt; Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Bozulmamış Fare Adacık için β-hücre mitogenlerin Sürekli İdaresi<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Biyolojik olarak parçalanabilir poli (laktik-ko-glikolik asit) mikro kullanılması

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a high-protein crambe meal that has limited value, as it is not fit for food or feed use. However, it contains proteins that could potentially make it a suitable raw material for higher-value products. The purpose of this study was to find methods of making this side stream into extruded films, showing that products with a higher value can be produced. The study mainly considered the development of material compositions and methods of preparing and extruding the material. Wheat gluten was added as a supportive protein matrix material, together with glycerol as a plasticizer and urea as a denaturant. The extrudate was evaluated with respect to mechanical (tensile testing) and oxygen barrier properties, and the extrudate structure was revealed visually and by scanning electron microscopy. A denser, more homogeneous material had a lower oxygen transmission rate, higher strength, and higher extensibility. The most homogeneous films were made at an extruder die temperature of 125-130 &#176;C. It is shown here that a film can be extruded with promising mechanical and oxygen barrier properties, the latter especially after a final compression molding step.

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

The side stream from plant oil production of Crambe abyssinica has limited value. The purpose of this study was to find methods for extruding materials based on this side stream, demonstrating that products with a higher value can be produced. The extrudates were found to have promising properties.