Este trabalho foi financiado em parte pela Fundação PhRMA e um Prêmio de Pesquisa e Estudos da Universidade de Maryland, College Park. Agradecemos ao Prof. Darrell Irvine pelo apoio ao trabalho inicial realizado na conclusão da "Engenharia In situ do microambiente de linfonodos através da injeção intranodal de partículas de polímeros liberantes adjuvante". 5

Todos os estudos em animais neste protocolo foram concluídos em conformidade com as diretrizes federais, estaduais e locais, e utilizando protocolos revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Maryland.
1. Síntese de Micro e Nanopartículas estabilizadas lipídicas
<ol><li>Em um frasco de vidro de 7 ml(s), combine lipídios DOPC, DSPE-PEG e DOTAP a uma relação molar de 60:20:20 para preparar uma mistura lipídica mestre.<ol>
<li>Para sintetizar uma única amostra: Transfira 242,9 μl, 287,4 μl e 71,9 μl, de DOPC, DSPE-PEG e DOTAP, respectivamente, para o frasco utilizando pipetas sorológicas de vidro de 2 ml.</li>
		<li>Para sintetizar várias amostras: Multiplique cada volume lipídico acima pelo número de amostras e combine em um único frasco, em seguida, transfira alíquotas iguais desta mistura lipídica em frascos correspondentes a cada amostra a ser preparada.</li>
		<li>Lipídios secos sob um fluxo suave de gás nitrogênio por 10 minutos, ou colocados no forno a vácuo durante a noite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Em um único frasco de vidro vazio de 20 ml, dissolva 80 mg de PLGA em 5 ml de diclorometano para cada amostra de partícula para gerar uma solução de caldo de polímero de 16 mg/ml.</li>
	<li>Adicione 5 ml de solução de polímero ao frasco(s) contendo os lipídios secos, tampa e vórtice por 30 segundos.</li>
	<li>Para sintetizar micropartículas:<ol>
<li>Comece a sonicar a fase orgânica contendo o polímero, lipídio e outra carga insolúvel em água no gelo a 12 W usando um sonicator.</li>
		<li>Crie a emulsão água-em-óleo (w/o) usando uma pipeta para adicionar 500 μl de H2O destilado, ou H2O contendo 1 mg de peptídeo, proteína ou outra carga solúvel em água.</li>
		<li>Continue sonicando por 30 segundos a 12 W no gelo, balançando suavemente o frasco para cima e para baixo e de um lado para o outro em torno da ponta do sonicator para garantir a emulsificação completa.</li>
		<li>Crie a emulsão água-em-óleo-na-água (w/o/w) derramando a emulsão w/o em 40 ml de H2O em um béquer de 150 ml.</li>
		<li>Homogeneize por 3 min a 16.000 rpm usando um homogeneizador digital.</li>
		<li>Adicione uma barra de agitação magnética, transfira o béquer para uma placa de mexida e deixe a emulsão w/o/w mexer durante a noite para remover o excesso de solvente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para sintetizar nanopartículas:<ol>
<li>Comece a sonicar a fase orgânica contendo o polímero, lipídio e outra carga insolúvel de água no gelo a 14 W.</li>
		<li>Crie a emulsão de w/o usando uma pipeta para adicionar 500 μl de H2O destilado, ou H2O contendo 1 mg de peptídeo, proteína ou outra carga solúvel em água.</li>
		<li>Continue sonicando por 30 segundos a 14 W no gelo.</li>
		<li>Crie a emulsão w/o/w derramando a emulsão w/o a 40 ml de H2O em um béquer de 150 ml e sonicando por 5 min a 16 W no gelo. Balance suavemente o frasco para cima e para baixo e lado a lado ao redor da ponta do sonicator para garantir a emulsificação completa.</li>
		<li>Adicione uma barra de agitação magnética, transfira o frasco para uma placa de mexida e deixe a emulsão w/o/w mexer durante a noite para remover o excesso de solvente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na manhã seguinte, lave e colete partículas:<ol>
<li>Despeje a emulsão através de 40 μm coador de células de malha de nylon em um tubo cônico de 50 ml.</li>
		<li>Partículas centrífugas por 5 min a 5.000 x g para micropartículas ou 5 min a 24.000 x g para nanopartículas.</li>
		<li>Decanteante supernaspetivo e lave partículas reutilizando-se em 1 ml de H2O.</li>
		<li>Transfira partículas suspensas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.</li>
		<li>Centrífuga por 5 min a 5.000 x g para micropartículas ou 5 min a 24.500 x g para nanopartículas.</li>
		<li>Lave partículas mais duas vezes removendo supernasces, resusus pendentes em 1 ml H2O, e centrifugando como na etapa 1.6.5. Após a lavagem, suspenda partículas em 1 ml H2O para uso imediato ou liofilize para armazenamento prolongado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Medição do Rendimento da Síntese
<ol><li>Preweigh um frasco vazio de vidro de 20 ml. Adicione 100 μl de suspensão de partículas ao frasco pré-varrido após a tubulação para cima e para baixo com uma micropipette para misturar.</li>
	<li>Lyophilize as partículas ou seque sob um fluxo suave de nitrogênio.</li>
	<li>Pesar o frasco contendo o polímero seco. Determine o rendimento de partículas no frasco subtraindo o peso original do frasco da massa do frasco contendo as partículas secas.</li>
	<li>Determine o rendimento total das partículas multiplicando a massa de partículas no frasco pelo fator de diluição. Para determinar o rendimento percentual, divida a massa de partículas pela massa de entrada teórica máxima e multiplique em 100%.</li>
</ol>3. Determinação do tamanho das partículas
<ol><li>Limpe a célula de fração de vidro fornecida no estilo cuvette, enchendo com água deionizada e limpando com cotonete com ponta de algodão. Transfira 10 ml de H2O destilado para a célula de facção limpa, adicione micro-barra de agitação magnética e carregue a célula fracionada no suporte celular do analisador de tamanho de partículas.</li>
	<li>Ajuste a velocidade de agitação magnética no analisador de partículas para obter a mistura completa na célula fração e feche a porta do compartimento.</li>
	<li>Alinhe os lasers à célula fração usando a interface de software de instrumento.</li>
	<li>Use a interface do software de instrumento para gravar uma leitura de linha de base com a célula fração contendo apenas H2O destilado.</li>
	<li>Pipeta a suspensão original de partículas para cima e para baixo com uma micropipette para misturar.</li>
	<li>Pipeta 10 μl de suspensão de partículas (tipicamente aproximadamente 0,5 mg) na célula fracionária. Certifique-se de que o volume da amostra de partículas adicionada à célula é suficiente para gerar força de sinal na faixa apropriada, conforme indicado na interface do software do instrumento. A massa real de partículas necessária depende do rendimento percentual e das propriedades ópticas da amostra de partículas.</li>
	<li>Feche a porta do compartimento do analisador de tamanho de partículas e meça o tamanho das partículas usando um índice refrativo de 1,60 para PLGA.</li>
	<li>Use a interface de software para calcular o diâmetro das partículas usando uma base numémia.</li>
</ol>4. Visualização de Partículas
<ol><li>Suspensão de partículas pipeta para cima e para baixo com micropipette para misturar. Suspensão de partículas diluídas a 1 mg/ml em água deionizada.</li>
	<li>Prepare um slide de microscópio adicionando 3 μl de suspensão de partículas diluídas e montando um deslizamento de tampa em um ângulo de 45° para evitar a formação de bolhas. Coloque o slide no estágio do microscópio e na imagem usando os conjuntos de filtros apropriados para cada carga fluorescente.</li>
</ol>5. Preparação de Ratos para i.LN. injecção
<ol><li>Prepare a solução de corante do rastreador:<ol>
<li>Prepare uma solução de 0,1% (w/v) de corante rastreador, dissolvendo 10 mg de pó de corante com 10 ml de H2O destilado.</li>
		<li>Esterilize a solução de corante em um frasco de vidro usando um filtro de seringa de 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um dia antes da injeção, anesthetize o rato usando isoflurane de acordo com um protocolo animal aprovado pela IACUC. Para avaliar a profundidade da anestesia, realize um teste de reflexo de beliscar o dedo do pé e monitore a taxa de respiração para garantir uma taxa respiratória de aproximadamente 100-140 respirações por minuto.</li>
	<li>Raspe o cabelo na base da cauda e do traseiro usando cortadores enquanto o rato é anestesiado. Remova o cabelo do lado ventral do animal e lateralmente ao redor do lado dorsal logo acima da articulação da perna traseira (quadril).</li>
	<li>Injete corante rastreador.<ol>
<li>Para cada injeção de corante, use uma micropipette para transferir 10 μl de solução de corante em um tubo de microcentrifuuge, e aspire toda a 10 μl em uma agulha 31G presa a uma seringa de 1 ml.</li>
		<li>Injete 10 μl de solução de corante subcutânea em cada lado da base traseira onde o cabelo foi cortado, recarregando entre as injeções.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova o cabelo restante aplicando um creme depilatório leve através de cotonetes de algodão. Certifique-se de revestir a área entre a parte traseira da coxa e abdômen.</li>
	<li>Deixe o creme depilatório incubar na pele por 3 minutos. Após a incubação, mão enluvada molhada com H2O quente e esfregue suavemente creme depilatório na pele.</li>
	<li>Remova imediatamente o creme depilatório molhando a mão enluvada com H2O quente e esfregando a base da cauda e o traseiro. Repita até que o excesso de depilatório seja removido, certificando-se de manter a mão molhada para evitar irritação.</li>
	<li>Remova o depilatório residual do mouse, molhando um pano macio ou uma toalha de papel com H2O quente e em um único movimento, limpando porção inferior do mouse. Evite um movimento de esfregar para evitar abrasão ou danos na pele do mouse.</li>
	<li>Deixe que o mouse se recupere sob uma lâmpada de calor e volte a segurar.</li>
</ol>6. i.LN. Injeção de Partículas
<ol><li>No dia seguinte, anesthetize o rato usando isoflurane de acordo com um protocolo animal aprovado pela IACUC.</li>
	<li>Examine o mouse para confirmar a drenagem do corante rastreador em cada linfonodo inguinal. O linfonodo deve ser visível como uma mancha escura perto da coxa traseira e abdômen.</li>
	<li>Prepare a solução de injeção de partículas:<ol>
<li>Partículas de resuspend em H2O destiladas na concentração de injeção desejada. Para cada injeção, use uma micropipette para transferir 10 μl de solução de partículas para um tubo de microcentrifuge.</li>
		<li>Aspire o 10 μl inteiro em uma agulha de insulina 31G presa a uma seringa de 1 ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injeção de partícula:<ol>
<li>Depois de visualizar a LN, aperte a pele ao redor da LN usando polegar, dedo indicador e dedo médio para puxar a provocação da pele e permitir a colocação controlada do volume de injeção.</li>
		<li>Aproxime-se da LN com a agulha em um ângulo de 90° para a pele e penetrá-lo sobre a LN tingida a uma profundidade de 1 mm.</li>
		<li>Injete lentamente todo o volume. Durante a injeção, observe o volume de LN através da pele para confirmar a injeção por alargamento visível da LN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permita que o mouse se recupere sob uma lâmpada de calor e volte a segurar ou realize testes adicionais.</li>
</ol>Para técnicas de análise relevantes (por exemplo, histologia, citometria de fluxo) consulte os artigos JoVE 265, 1743 e 3054 e Protocolos Atuais em Imunologia, capítulos 5 e 2115-22.

<ol>
	<li>Swartz, M. A., Hirosue, S., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Approaches+to+Immunotherapy.">Engineering Approaches to Immunotherapy.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Adamina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranodal+immunization+with+a+vaccinia+virus+encoding+multiple+antigenic+epitopes+and+costimulatory+molecules+in+metastatic+melanoma.">Intranodal immunization with a vaccinia virus encoding multiple antigenic epitopes and costimulatory molecules in metastatic melanoma.</a> Mol. Ther. 18, 651-659 (2010).</li><li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-Lymph+Node+Prime-Boost+Vaccination+against+Melan+A+and+Tyrosinase+for+the+Treatment+of+Metastatic+Melanoma:+Results+of+a+Phase+1.">Intra-Lymph Node Prime-Boost Vaccination against Melan A and Tyrosinase for the Treatment of Metastatic Melanoma: Results of a Phase 1.</a> Clinical Trial. Clin. Cancer Res. 17, 2987-2996 (2011).</li><li>Senti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intralymphatic+allergen+administration+renders+specific+immunotherapy+faster+and+safer:+a+randomized+controlled+trial.">Intralymphatic allergen administration renders specific immunotherapy faster and safer: a randomized controlled trial.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 17908-17912 (2008).</li><li>Jewell, C. M., Lopez, S. C. B., Irvine, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+engineering+of+the+lymph+node+microenvironment+via+intranodal+injection+of+adjuvant-releasing+polymer+particles.">In situ engineering of the lymph node microenvironment via intranodal injection of adjuvant-releasing polymer particles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15745-15750 (2011).</li><li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+kinetics+determines+immune+reactivity.">Antigen kinetics determines immune reactivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5189-5194 (2008).</li><li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels.">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 617-628 (2005).</li><li>Irvine, D. J., Jewell, C. M., Ducheyne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+132.">Ch. 132.</a> Comprehensive Biomaterials. , (2011).</li><li>Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Nano-+and+Microparticles+to+Tune+Immunity.">Engineering Nano- and Microparticles to Tune Immunity.</a> Adv. Mater. 24, 3724-3746 (2012).</li><li>Reddy, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+lymphatic+transport+and+complement+activation+in+nanoparticle+vaccines.">Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines.</a> Tissue Eng. Part A. 14, 734-735 (2008).</li><li>Bershteyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-supported+lipid+shells,+onions,+and+flowers.">Polymer-supported lipid shells, onions, and flowers.</a> Soft Matter. 4, 1787-1791 (2008).</li><li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+intralymphatic+injection+of+peptide+vaccines+enhances+immunogenicity.">Direct intralymphatic injection of peptide vaccines enhances immunogenicity.</a> Eur. J. Immunol. 35, 568-574 (2005).</li><li>Mohanan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+routes+affect+the+quality+of+immune+responses:+A+cross-sectional+evaluation+of+particulate+antigen-delivery+systems.">Administration routes affect the quality of immune responses: A cross-sectional evaluation of particulate antigen-delivery systems.</a> J. Controlled Release. 147, 342-349 (2010).</li><li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+in+the+mouse.">Lymph node mapping in the mouse.</a> J. Immunol. Methods. 332, 170-174 (2008).</li><li>He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Flow+Cytometry+Analyses+of+Cellular+Immune+Response+in+Rhesus+Macaques.">Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques.</a> J. Vis. Exp. , 1743 (2010).</li><li>Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+2-Photon+Imaging+of+Peripheral+Lymph+Nodes+in+Mice.">Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice.</a> J. Vis. Exp. e265. , 265 (2007).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Imaging+of+T+Cells+in+Murine+Lymph+Node+Slices+with+Widefield+and+Confocal+Microscopes.">Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes.</a> J. Vis. Exp. , 3054 (2011).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Immunofluorescence Staining. , (2001).</li><li>Hofman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Immunohistochemistry. , (2001).</li><li>Holmes, K., Lantz, L. M., Fowlkes, B. J., Schmid, I., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Preparation of Cells and Reagents for Flow Cytometry. , (2001).</li><li>Sharrow, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Overview of Flow Cytometry. , (2001).</li><li>Sharrow, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Analysis of Flow Cytometry Data. , (2001).</li><li>Anderson, J. M., Shive, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+and+biocompatibility+of+PLA+and+PLGA+microspheres.">Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 28, 5-24 (1997).</li><li>Danhier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLGA-based+nanoparticles:+an+overview+of+biomedical+applications.">PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications.</a> J. Controlled Release. 161, 505-522 (2012).</li></ol>

Os custos de produção e as taxas de acesso para este artigo foram parcialmente patrocinados pela HORIBA, Ltd.

A técnica descrita neste protocolo permite a entrega controlada de vacinas às LNs e às células de apresentação de antígenos residentes em LN. A carga encapsulada por materiais biomagráficos pode ser localizada dentro da LN, permitindo a manipulação das doses de um ou mais tipos de carga entregues ao microambiente LN. A localização e a liberação controlada de partículas de polímeros tem sido demonstrada para gerar uma potente resposta imune celular e humoral em doses significativamente menores do que as abordagens convencionais. Além disso, através da manipulação do tamanho do transportador de biomateriais, o modo primário de processamento celular pode ser modulado entre a absorção direta de nanopartículas ou a liberação de carga extracelular de micropartículas maiores5. Esses resultados estabelecem a viabilidade da entrega de biomateriais como plataforma de entrega de vacinas terapêuticas.
A síntese de partículas PLGA por evaporação de emulsão/solvente tem sido amplamente empregada em aplicações de entrega de medicamentos23,24. Assim, os desafios potenciais associados a essa técnica referem-se principalmente à identificação e deposição bem-sucedidas de vacinas no local alvo da LN. Embora o uso de corante rastreador facilite a visualização das LNs inguinais direcionadas, o tamanho do alvo e a profundidade sob a pele são pequenos. Assim, os autores recomendam o tempo de alocação e camundongos para a prática da preparação e injeções de camundongos. Durante a preparação animal (ou seja, barbear e aplicação de depilatório), deve-se tomar cuidado para não cortar os camundongos no lado ventral do animal onde o ângulo da perna com o abdômen torna a pele mais propensa a lesões de cortadores. Além disso, todo depilatório deve ser removido com água morna para evitar que os animais ingeram o creme durante o comportamento normal de preparo. Para praticar injeções de LN, uma maior concentração de corante rastreador pode ser administrada e praticar animais podem ser eutanizados e, em seguida, injetados várias vezes. Após a injeção os camundongos podem ser necropsiados e o tamanho de LNs de animais injetados pode ser comparado com um controle não injetado LN. Uma limitação dessa técnica é o limite físico do volume de injeção que pode ser carregado na estrutura LN. Nosso protocolo sugere um volume de injeção de 10 μl em camundongos, embora outros estudos tenham relatado volumes de injeção maiores pelo menos até 20 μl.13 No entanto, a entrega direta de vacinas via injeção i.LN. permite uma dose dramática para que a função dessas vacinas geralmente não deve ser limitada por restrições de volume.
Como observado, mudar a propriedade física das partículas (ou seja, tamanho) é um mecanismo eficaz para alterar a via ou os desfechos induzidos por biomateriais e cargas encapsuladas no tecido LN. O protocolo de evaporação de emulsão/solvente pode ser facilmente modificado para alterar propriedades físicas ou químicas, como carga ou funcionalidade de superfície, e a taxa de biodegradação/liberação de carga23,24. Por exemplo, a cinética de liberação pode ser ajustada através de composições alternativas de polímeros, e a função da superfície pode ser alterada usando composições lipídicas modificadas ou poli (álcool vinil). A carga carregada em partículas pode ser facilmente manipulada para conter diferentes antígenos ou adjuvantes para patógenos alvo. A vantagem dessa abordagem é alcançada através da combinação de entrega de I.LN. com a liberação local e controlada de carga de biomateriais. Essa sinergia estabelece uma plataforma que pode ser explorada para gerar respostas imunes adaptativas de forma eficiente usando doses minuciosas e com efeitos colaterais não específicos/sistêmicos reduzidos.

Os linfonodos (LNs) são os centros de comando do sistema imunológico. Neste sítio imunológico, o antígeno que apresenta células é linfócito ingênuo contra antígenos estranhos específicos para ativar respostas imunes celulares e humorais. As LNs tornaram-se, assim, um alvo atraente para a entrega de vacinas e imunoterápicos. Infelizmente, a maioria das estratégias de vacina resultam em entrega ineficiente e transitória de antígeno e adjuvantes ao tecido linfoide1. Abordagens que melhorem a segmentação e retenção de componentes de vacinas em LNs podem, portanto, ter um impacto significativo na potência e eficiência de novas vacinas.
Uma estratégia para contornar o desafio da segmentação da LN que demonstrou grande interesse em novos ensaios clínicos é a injeção direta, intra-LN (i.LN.)2-4. Esses ensaios utilizaram orientações de ultrassom para fornecer vacinas às LNs como um simples procedimento ambulatorial. Em comparação com as rotas tradicionais de injeção periférica, essa abordagem resultou em uma significativa economia de doses e eficácia melhorada em contextos terapêuticos, incluindo alergias e câncer2-4. Estes estudos utilizaram a injeção de vacinas solúveis ( ouseja, livres de biomateriais) que foram rapidamente liberadas por drenagem linfática. Portanto, várias injeções ou ciclos de múltiplas injeções foram administrados para alcançar esses efeitos terapêuticos impressionantes. Uma retenção melhorada na LN poderia melhorar a interação entre antígeno e/ou células imunes e adjuvantes, melhorando ainda mais a potência da escorva de células imunes. Esse potencial é apoiado por estudos recentes que mostram cinética de antígeno e entrega adjuvante desempenham um papel crítico na determinação da resposta imune específica gerada5-7. Além disso, a localização e a minimização das doses de medicamentos e vacinas poderia reduzir ou eliminar efeitos sistêmicos, como inflamação crônica.
Os biomateriais têm sido estudados extensivamente para aumentar a potência e a eficiência das vacinas1,8,9. Encapsulamento ou adsorção em transportadores de biomateriais pode proteger fisicamente a carga da degradação e superar as limitações de solubilidade. Outra característica notável dos transportadores de biomateriais, como micro-partículas poliméricas ou nanopartículas, é a capacidade de cocarregar várias classes de carga e, posteriormente, liberar essas cargas sobre intervalos controlados. No entanto, uma limitação significativa que continua a dificultar vacinas biomateriais e imunoterápicos in vivo é alvo ineficiente de células imunes e tráfico limitado a linfonodos. Por exemplo, a injeção periférica de vacinas biomateriais através de rotas convencionais (por exemplo, intradérmicas, intramusculares) normalmente apresentam má segmentação de LN, com até 99% do material injetado permanecendo no local da injeção4,10. Mais recentemente, o tamanho dos portadores de vacinas biomateriais foi ajustado para melhorar o tráfico preferencial ou a drenagem dessas vacinas para LNs através do fluxo intersticial8,10. Esses avanços levaram a uma maior resposta imune celular e humoral, ressaltando a importância de direcionar e projetar o ambiente LN para novas vacinas.
Este artigo apresenta um protocolo de vacinação que combina partículas de polímeros estabilizadas lipídicas e entrega de I.LN. para gerar depósitos de vacinas de liberação controlada5,11. Baseando-se em estudos recentes que empregam técnicas cirúrgicas para i.LN. em camundongos6,7,12,13, desenvolvemos uma estratégia rápida e não-úrgica para injetar vacinas biomateriais em animais de pequeno porte5. Combinando a entrega da I.LN com os portadores de vacinas biomateriais potencialmente melhorou a resposta das células CD8 T dentro de 7 dias após uma única injeção de depósitos de vacinas de liberação controlada5. Também foi gerada uma forte resposta humoral (ou seja, titulantes de anticorpos; ambos os aprimoramentos foram ligados ao aumento da retenção de componentes vacinais em linfonodos que foram mediados pela liberação controlada dos portadores de biomateriais. Curiosamente, o tamanho das partículas de vacina alterou o destino desses materiais uma vez nas LNs: partículas nanoescala mostraram maior absorção direta por células, enquanto micropartículas maiores permaneceram no ambiente de LN extracelular e liberaram cargas(por exemplo, adjuvante) que foram absorídas pelo antígeno residente em LN que apresentava células5. Esses dados sugerem dois caminhos que poderiam ser explorados para novas vacinas controlando o tamanho de biomateriais injetados i.LN.
Neste artigo, partículas de polímero biodegradáveis estabilizadas por lipídios (micro e nanoescala) são sintetizadas usando uma estratégia de dupla emulsão modificada5,11. As propriedades das partículas são caracterizadas por difração a laser e microscopia. Essas partículas são então injetadas diretamente nas LNs inguinais identificadas nãourgicamente usando um corante rastreador comum e nãotóxico14. A análise pós-injeção de LNs por histologia ou citometria de fluxo pode ser usada para verificar a distribuição de partículas dentro do ambiente LN, bem como para monitorar a absorção celular e a retenção de partículas ao longo do tempo. Para protocolos detalhando processamento histológico e citometria de fluxo, os leitores são encaminhados para artigos recentes do JoVE e relatórios de revistas15-22. Resultados típicos demonstram o direcionamento local da LN desses depósitos que poderiam ser explorados para alcançar respostas imunes potentes e eficientes ou para adaptar a imunidade para patógenos-alvo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850375</td>
			<td style="width:167px;">10 mg/ml stock in chloroform</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">880128</td>
			<td style="width:167px;">10 mg/ml stock in chloroform</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">890890</td>
			<td style="width:167px;">10 mg/ml stock in chloroform</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Polylactic-co-glycolic acid (PLGA)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2191</td>
			<td style="width:167px;">Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dichloromethane (DCM)</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH1113</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:71px;">Vetone</td>
			<td style="width:119px;">502017</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nair</td>
			<td style="width:71px;">Nair</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Evans blue tracer dye</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">AAA16774-09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD328418</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD305167</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD309628</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 &#181;m</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-949</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vybrant DiD Cell-Labeling Solution</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">V-22887</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 &#181;m</td>
			<td style="width:71px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">17149</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 &#181;m</td>
			<td style="width:71px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">17156</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Ovalbumin, Purified</td>
			<td style="width:71px;">Worthington Biochemical</td>
			<td style="width:119px;">LS003056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125</td>
			<td style="width:71px;">Qsonica</td>
			<td style="width:119px;">Q125</td>
			<td style="width:167px;">1/8 in diameter microtip probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer</td>
			<td style="width:71px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">YO-04739-22</td>
			<td style="width:167px;">10 G dispersing element</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX-83</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer</td>
			<td style="width:71px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">LA-950</td>
			<td style="width:167px;">Including provided cuvette-style glass fraction cell</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Professional 8685 Peanut Classic Clippers</td>
			<td style="width:71px;">Wahl</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-lymph node injection of biodegradable polymer particles

A geração de resposta imune adaptativa depende de drenagem eficiente ou tráfico de antígeno para linfonodos para processamento e apresentação dessas moléculas estranhas aos linfócitos T e B. Os linfonodos tornaram-se, assim, alvos críticos para novas vacinas e imunoterapias. Uma estratégia recente para atingir esses tecidos é a injeção direta de linfonodos de componentes de vacinas solúveis, e os ensaios clínicos envolvendo essa técnica têm sido promissores. Várias estratégias de biomateriais também têm sido investigadas para melhorar o direcionamento do linfonodo, por exemplo, ajustando o tamanho das partículas para a drenagem ideal de partículas de vacinas biomateriais. Neste artigo apresentamos um novo método que combina injeção direta de linfonodo com partículas de polímeros biodegradáveis que podem ser carregadas com antígeno, adjuvante ou outros componentes da vacina. Neste método, micropartículas poliméricas ou nanopartículas são sintetizadas por um protocolo de dupla emulsão modificado que incorpora estabilizadores lipídicos. As propriedades das partículas (por exemplo, tamanho, carga de carga) são confirmadas por difração a laser e microscopia fluorescente, respectivamente. Os linfonodos do rato são então identificados pela injeção periférica de um corante rastreador nãotóxico que permite a visualização do local de injeção alvo e a subsequente deposição de partículas de polímeros em linfonodos. Esta técnica permite o controle direto sobre as doses e combinações de biomateriais e componentes de vacinas entregues a linfonodos e poderia ser aproveitada no desenvolvimento de novas vacinas baseadas em biomateriais.

Os resultados esperados para os protocolos apresentados neste manuscrito podem ser divididos em três categorias: síntese de partículas, preparação animal e injeção de partículas.
A Figura 1 retrata a síntese e caracterização de partículas de polímeros biodegradáveis, estabilizadas por lipídios anfílicos. Os resultados do protocolo de síntese de evaporação de emulsão/solvente(Figura 1A)podem ser avaliados qualitativamente pela inspeção visual das emulsões finais geradas; Os lotes de partículas devem ser emulsões homogêneas e estáveis com aparência opaca. As complicações incluem emulsões que creme ou floculado, muitas vezes devido ao armazenamento inadequado de estabilizadores lipídicos. Para evitar essa instabilidade, os lipídios devem ser armazenados a -80 °C em estado desidratado ou em um frasco selado purgado com nitrogênio. A avaliação quantitativa da síntese de partículas pode ser realizada utilizando difração a laser ou dispersão dinâmica de luz para analisar a distribuição de tamanho(Figura 1B). Os resultados esperados incluem tamanhos de partículas monomodais bem distribuídos, indicando uma população uniforme de partículas. Os parâmetros de síntese descritos neste manuscrito geram distribuições médias de número centradas em aproximadamente 100 nm ou 3 μm para nanopartículas e micropartículas, respectivamente. Uma avaliação qualitativa adicional da síntese de partículas pode ser alcançada através da modificação do protocolo acima para incorporar múltiplas classes de carga fluorescente. Na Figura 1C,imagens de microscopia de micropartículas carregadas com peptídeo fluorescente (FITC, verde), um corante lipofílico (DiD, vermelho) e uma imagem de sobreposição (amarela) confirmam a criação de partículas dentro da faixa de tamanho desejada e encapsulamento de peptídeo dentro do volume da partícula.
Os dois primeiros painéis da Figura 2 resumem os resultados esperados da preparação animal para a estratégia de injeção da LV descrita neste artigo. A metodologia envolve a marcação de LNs inguinais por injeção periférica de um rastreador nãotóxico para identificar o local para posterior injeção de partículas i.LN. (Figura 2A)5. Como observado, a drenagem do corante rastreador após injeção subcutânea na base traseira permitirá a visualização das LNs inguinais(Figura 2B)5. A ingestão de cremes depilatórios aprovados pode representar perigos para os camundongos. Assim, deve-se tomar cuidado para remover completamente todo o creme aplicado, prestando especial atenção às patas e ao lado ventral dos ratos. O depilatório deve ser removido usando um pano molhado, macio ou toalha de papel molhado em um único movimento suave. Evite esfregar para remover o creme, pois isso pode levar a escoriações na pele exposta dos camundongos.
A confirmação do local de entrega ao Inguinal LN pode ser avaliada através de observação ou histologia. O volume de LN pode ser monitorado visualmente durante a injeção como um indicador de injeção bem sucedida. Os resultados esperados incluem distribuição eficiente de carga em toda a estrutura LN, sem vazamento significativo para tecidos ou células adjacentes. Além disso, à medida que o fluido injetado desloca/dilui o rastreador na LN, a concentração/coloração de corantes deve tornar-se menos intensa após a injeção. A observação do tecido deve revelar uma LN intacta, mas aumentada devido à injeção de fluido. Os desafios potenciais incluem injetar muito rapidamente ou perder a LN, ambas as quais podem causar elução do volume em tecido subcutâneo circundante. Esses desfechos indesejáveis podem ser confirmados por necropsia ou histologia, onde a suspensão de partículas será observada se espalhando para células e tecidos distantes de nós destinados à injeção. Em contraste, um resultado esperado seria a identificação de uma LN inguinal ampliada devido à contenção de partículas dentro da estrutura LN. O processamento histológico de LNs excisadas pode confirmar definitivamente a entrega de carga para o tecido linfoide, como mostrado nas Figuras 2C e 2D. Note que as partículas da Figura 2 incorporam carga fluorescente para permitir a visualização da carga durante a injeção, bem como durante o processamento histológico e microscopia fluorescente.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50984/50984fig1.jpg" width="600px"> Figura 1. Síntese e Caracterização de Partículas Estabilizadas Lipídicas. A) Diagrama esquemático descrevendo a síntese de partículas estabilizadas lipídicas preparadas pela evaporação de emulsão/solvente. B) Distribuições de tamanho de micropartículas (linha sólida, diâmetro = 2,8 μm) e nanopartículas (linha tracejada, diâmetro = 113 nm). C) Imagens de microscopia fluorescente de partículas carregadas com peptídeo fluorescente e um corante de partículas fluorescentes. Rótulos: peptídeo (verde) e partícula (vermelho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50984/50984fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50984/50984fig2.jpg" width="600px"> Figura 2. I.LN. Injeção e Distribuição de Partículas Biodegradáveis dentro da LN. A) Metodologia para injeção de LN. B) Visualização de LNs em um camundongo através da pele (imagem superior) e após necropsia (imagem inferior)5. C) Coloração histológica de uma LN confirmando a deposição e distribuição de micropartículas de polímeros fluorescentes (partículas, verde; Células T, vermelho; Células B, azul). D) Nanopartículas fluorescentes (50 nm, imagem esquerda) e micropartículas (6 μm, imagem direita) em LNs 24 horas após a injeção. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50984/50984fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.

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Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles

Linfonodos são os tecidos imunológicos que orquestram a resposta imune e são um alvo crítico para as vacinas. Os biomateriais têm sido empregados para melhor direcionar linfonodos e controlar a entrega de antígenos ou adjuvantes. Este artigo descreve uma técnica que combina essas ideias para injetar partículas de polímeros biocompatíveis em linfonodos.

Injeção de linfonodo intra-linfático de partículas de polímeros biodegradáveis

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these ...

intra-lymph-node-injection-of-biodegradable-polymer-particles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.3K visualizações.  University of Maryland, College Park. Linfonodos são os tecidos imunológicos que orquestram a resposta imune e são um alvo crítico para as vacinas. Os biomateriais têm sido empregados para melhor direcionar linfonodos e controlar a entrega de antígenos ou adjuvantes. Este artigo descreve uma técnica que combina essas ideias para injetar partículas de polímeros biocompatíveis em linfonodos.

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A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science. Methods for particle trapping based on optical, magnetic, electrokinetic, and acoustic techniques have led to major advancements in physics and biology ranging from the molecular to cellular level. In this article, we introduce a new microfluidic-based technique for particle trapping and manipulation based solely on hydrodynamic fluid flow. Using this method, we demonstrate trapping of micro- and nano-scale particles in aqueous solutions for long time scales. The hydrodynamic trap consists of an integrated microfluidic device with a cross-slot channel geometry where two opposing laminar streams converge, thereby generating a planar extensional flow with a fluid stagnation point (zero-velocity point). In this device, particles are confined at the trap center by active control of the flow field to maintain particle position at the fluid stagnation point. In this manner, particles are effectively trapped in free solution using a feedback control algorithm implemented with a custom-built LabVIEW code. The control algorithm consists of image acquisition for a particle in the microfluidic device, followed by particle tracking, determination of particle centroid position, and active adjustment of fluid flow by regulating the pressure applied to an on-chip pneumatic valve using a pressure regulator. In this way, the on-chip dynamic metering valve functions to regulate the relative flow rates in the outlet channels, thereby enabling fine-scale control of stagnation point position and particle trapping. The microfluidic-based hydrodynamic trap exhibits several advantages as a method for particle trapping. Hydrodynamic trapping is possible for any arbitrary particle without specific requirements on the physical or chemical properties of the trapped object. In addition, hydrodynamic trapping enables confinement of a "single" target object in concentrated or crowded particle suspensions, which is difficult using alternative force field-based trapping methods. The hydrodynamic trap is user-friendly, straightforward to implement and may be added to existing microfluidic devices to facilitate trapping and long-time analysis of particles. Overall, the hydrodynamic trap is a new platform for confinement, micromanipulation, and observation of particles without surface immobilization and eliminates the need for potentially perturbative optical, magnetic, and electric fields in the free-solution trapping of small particles.

In this article, we present a microfluidic-based method for particle confinement based on hydrodynamic flow. We demonstrate stable particle trapping at a fluid stagnation point using a feedback control mechanism, thereby enabling confinement and micromanipulation of arbitrary particles in an integrated microdevice.

A Armadilha hidrodinâmica microfluídicos baseados em partículas individuais

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Bioengenharia

A Chitosan Based, Laser Activated Thin Film Surgical Adhesive, 'SurgiLux': Preparation and Demonstration

Sutures are a 4,000 year old technology that remain the 'gold-standard' for wound closure by virtue of their repair strength (~100 KPa). However, sutures can act as a nidus for infection and in many procedures are unable to effect wound repair or interfere with functional tissue regeneration.1 Surgical glues and adhesives, such as those based on fibrin and cyanoacrylates, have been developed as alternatives to sutures for the repair of such wounds. However, current commercial adhesives also have significant disadvantages, ranging from viral and prion transfer and a lack of repair strength as with the fibrin glues, to tissue toxicity and a lack of biocompatibility for the cyanoacrylate based adhesives. Furthermore, currently available surgical adhesives tend to be gel-based and can have extended curing times which limit their application.2 Similarly, the use of UV lasers to facilitate cross-linking mechanisms in protein-based or albumin 'solders' can lead to DNA damage while laser tissue welding (LTW) predisposes thermal damage to tissues.3 Despite their disadvantages, adhesives and LTW have captured approximately 30% of the wound closure market reported to be in excess of US $5 billion per annum, a significant testament to the need for sutureless technology.4
In the pursuit of sutureless technology we have utilized chitosan as a biomaterial for the development of a flexible, thin film, laser-activated surgical adhesive termed 'SurgiLux'. This novel bioadhesive uses a unique combination of biomaterials and photonics that are FDA approved and successfully used in a variety of biomedical applications and products. SurgiLux overcomes all the disadvantages associated with sutures and current surgical adhesives (see Table 1).
In this presentation we report the relatively simple protocol for the fabrication of SurgiLux and demonstrate its laser activation and tissue weld strength. SurgiLux films adhere to collagenous tissue without chemical modification such as cross-linking and through irradiation using a comparatively low-powered (120 mW) infrared laser instead of UV light. Chitosan films have a natural but weak adhesive attraction to collagen (~3 KPa), laser activation of the chitosan based SurgiLux films emphasizes the strength of this adhesion through polymer chain interactions as a consequence of transient thermal expansion.5 Without this 'activation' process, SurgiLux films are readily removed.6-9 SurgiLux has been tested both in vitro and in vivo on a variety of tissues including nerve, intestine, dura mater and cornea. In all cases it demonstrated good biocompatibility and negligible thermal damage as a consequence of irradiation.6-10

A Chitosan Based, Laser Activated Thin Film Surgical Adhesive, &#039;SurgiLux&#039;: Preparation and Demonstration

The fabrication of a novel, flexible thin film surgical adhesive from FDA approved ingredients, chitosan and indocyanine green is described. Bonding of this adhesive to collagenous tissue through a simple activation process with a low-powered infra-red laser is demonstrated.

A base de quitosana, Laser Activated adesiva Thin Film cirúrgica &quot;, SurgiLux &#39;: Preparação e demonstração

Sutures are a 4,000 year old technology that remain the 'gold-standard' for wound closure by virtue of their repair strength (~100 KPa). However, sutures ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays de polímeros para Discovery High Throughput de Biomateriais

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Síntese combinatória de alta capacidade e liberação de proteínas a partir de polímero de Cinema e Bibliotecas Nanopartículas

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

Protocolo Relativo Avaliação hidrodinâmica de Tri-folheto polímero Válvulas

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

Células-tronco de programação para Therapeutic angiogênese Usando nanopartículas poliméricas biodegradáveis

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Manufacturing Of Robust Natural Fiber Preforms Utilizing Bacterial Cellulose as Binder

A novel method of manufacturing rigid and robust natural fiber preforms is presented here. This method is based on a papermaking process, whereby loose and short sisal fibers are dispersed into a water suspension containing bacterial cellulose. The fiber and nanocellulose suspension is then filtered (using vacuum or gravity) and the wet filter cake pressed to squeeze out any excess water, followed by a drying step. This will result in the hornification of the bacterial cellulose network, holding the loose natural fibers together.
Our method is specially suited for the manufacturing of rigid and robust preforms of hydrophilic fibers. The porous and hydrophilic nature of such fibers results in significant water uptake, drawing in the bacterial cellulose dispersed in the suspension. The bacterial cellulose will then be filtered against the surface of these fibers, forming a bacterial cellulose coating. When the loose fiber-bacterial cellulose suspension is filtered and dried, the adjacent bacterial cellulose forms a network and hornified to hold the otherwise loose fibers together.
The introduction of bacterial cellulose into the preform resulted in a significant increase of the mechanical properties of the fiber preforms. This can be attributed to the high stiffness and strength of the bacterial cellulose network. With this preform, renewable high performance hierarchical composites can also be manufactured by using conventional composite production methods, such as resin film infusion (RFI) or resin transfer molding (RTM). Here, we also describe the manufacturing of renewable hierarchical composites using double bag vacuum assisted resin infusion.

We present a novel method of manufacturing rigid and robust short natural fiber preforms using a papermaking process. Bacterial cellulose acts simultaneously as the binder for the loose fibers and provides rigidity to the fiber preforms. These preforms can be infused with a resin to produce truly green hierarchical composites.

Fabricação de fibras naturais robustos Preformas Utilizando bacteriana Celulose como Binder

A novel method of manufacturing rigid and robust natural fiber preforms is presented here. This method is based on a papermaking process, whereby loose ...

TAPE: A Biodegradable Hemostatic Glue Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants for Surgical Application

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant adhesion strength than commercial tissue adhesives. Medical adhesives have attracted great attention as potential alternative tools to sutures and staples due to their convenience in usage with minimal invasiveness. Although there are several protocols for developing tissue adhesives including those commercially available such as fibrin glues and cyanoacrylate-based materials, mostly they require a series of chemical syntheses of organic molecules, or complicated protein-purification methods, in the case of bio-driven materials (i.e., fibrin glue). Also, the development of surgical glues exhibiting high adhesive properties while maintaining biodegradability is still a challenge due to difficulties in achieving good performance in the wet environment of the body. We illustrate a new method to prepare a medical glue, known as TAPE, by the weight-based separation of a water-immiscible supramolecular aggregate formed after a physical mixing of a plant-derived, wet-resistant adhesive molecule,&#160;Tannic Acid (TA), and a well-known biopolymer, Poly(Ethylene) glycol (PEG). With our approach, TAPE shows high adhesion strength, which is 2.5-fold more than commercial fibrin glue in the presence of water. Furthermore, TAPE is biodegradable in physiological conditions and can be used as a potent hemostatic glue against tissue bleeding. We expect the widespread use of TAPE in a variety of medical settings and drug delivery applications, such as polymers for muco-adhesion, drug depots, and others.

We describe the simplest protocol to prepare biodegradable medical glue that has an effective hemostatic ability. TAPE is a water-immiscible supramolecular aggregate prepared by mixing of tannic acid, a ubiquitous compound found in plants, and poly(ethylene) glycol, yielding a 2.5 times greater water-resistant adhesion compared with commercial fibrin glue.

TAPE: Uma biodegradável Hemostática Glue Inspirado por um Composto Ubiquitous em plantas para aplicação cirúrgica

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Sustained Administration of &amp;#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets &lt;em&gt;Ex Vivo&lt;/em&gt; Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Administração sustentada dos mitógenos de células β para intactas mouse Ilhotas<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Usando biodegradável poli (ácido láctico-co-glicólico) Microesferas

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a high-protein crambe meal that has limited value, as it is not fit for food or feed use. However, it contains proteins that could potentially make it a suitable raw material for higher-value products. The purpose of this study was to find methods of making this side stream into extruded films, showing that products with a higher value can be produced. The study mainly considered the development of material compositions and methods of preparing and extruding the material. Wheat gluten was added as a supportive protein matrix material, together with glycerol as a plasticizer and urea as a denaturant. The extrudate was evaluated with respect to mechanical (tensile testing) and oxygen barrier properties, and the extrudate structure was revealed visually and by scanning electron microscopy. A denser, more homogeneous material had a lower oxygen transmission rate, higher strength, and higher extensibility. The most homogeneous films were made at an extruder die temperature of 125-130 &#176;C. It is shown here that a film can be extruded with promising mechanical and oxygen barrier properties, the latter especially after a final compression molding step.

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

The side stream from plant oil production of Crambe abyssinica has limited value. The purpose of this study was to find methods for extruding materials based on this side stream, demonstrating that products with a higher value can be produced. The extrudates were found to have promising properties.